Screening Biomarkers of Astragalus Membranaceus for Hypertensive Ventricular Remodeling Based on Network Pharmacology and Molecular Docking
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摘要:
目的 基于网络药理学原理和分子对接，探讨黄芪治疗高血压心室重构（ventricular remodeling，VR）的作用机制。 方法 利用在线数据库获得黄芪的有效成分、药物靶点及高血压心室重构的疾病靶点，下载mRNA数据信息，筛选高血压心室重构相关的关键模块及其基因，进而预测高血压心室重构的疾病靶点，再进行GO功能/KEGG通路富集分析，构建关键靶点-功能/通路调控网络及PPI网络并可视化。利用LASSO及Random Forest构建高血压心室重构的诊断模型，分析得到生物标志物后再对生物标记物、药物活性成分绘制中药药理调控网络并可视化。最后通过数据库获取各种成分结构，进行分子对接。 结果 获得黄芪活性成分87个，药物靶点390个，高血压心室重构疾病靶点3281个，差异表达关键模块基因2103个，取交集获得24个关键靶点。分析得到关键靶点基因与生物过程、分子功能和细胞成分Terms分别有288个、15个、29个靶点，共获54条相关信号通路，得到 21个蛋白的互作网络关系。获得4个生物标志物（MAPK1，IL2，CSNK2B，SELE），分子对接结果显示4个标志物的蛋白与小分子之间均存在结合的氢键。 结论 通过筛选获取了黄芪治疗高血压心室重构标志物，验证了黄芪治疗高血压心室重构效果，并且可能成为高血压心室重构诊断和治疗的分子生物标记物。 Abstract:Objective To investigate the mechanisms of Astragalus membranaceus in the treatment of hypertensive ventricular remodeling （VR） based on the principles of network pharmacology and molecular docking. Method The effective components of Astragalus membranaceus, drug targets and disease targets of hypertensive ventricular remodeling were obtained from the online database. The mRNA data were downloaded to screen the key modules and genes related to hypertensive ventricular remodeling, and then the disease targets of hypertensive ventricular remodeling were predicted, followed by GO functional/KEGG pathway enrichment analysis. PPI network were constructed and visualized. LASSO and Random Forest were used to construct the diagnostic model of hypertensive ventricular remodeling. After analyzing the biomarkers, the pharmacological regulatory network of traditional Chinese medicine was drawn and visualized for biomarkers and active components. Finally, the component structures were obtained through the database for molecular docking. Results 87 active ingredients of Astragalus membranaceus, 390 drug targets, 3281 hypertensive ventricular remodeling disease targets and 2103 differentially expressed key module genes were obtained, and 24 key targets were obtained by taking the intersection. There were 288, 15 and 29 targets in terms of key target genes and biological processes, molecular functions and cell components, respectively. A total of 54 related signaling pathways were obtained, and the interaction network relationships of 21 proteins were obtained. Four biomarkers （MAPK1, IL2, CSNK2B, SELE） were obtained, and the molecular docking results showed the existence of binding hydrogen bonds between the proteins and small molecules of all four markers. Conclusion Screening to obtain markers of ventricular remodeling in hypertension by Astragalus membranaceus validated the effect of Astragalus membranaceus in the treatment of hypertensive ventricular remodeling and may become a molecular biomarker for the diagnosis and treatment of hypertensive ventricular remodeling. -
Key words:
- Network pharmacology /
- Astragalus membranaceus /
- Hypertension /
- ventricular remodeling /
- Biomarkers
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三七（Panax notoginseng （Burk.） F. H. chen ex C. H.），又名参三七、田七等，为五加科多年生草本植物，是我国名贵中药材。三七中主要有效成分包括：三七多糖，三七皂苷、黄酮类、氨基酸、挥发油等[1]。据现有研究发现三七多糖具有调节免疫功能[2]、抗炎[3]、降血糖[4]、降血脂[5]、抗氧化[6]、抗衰老[7]等药理作用，刘平平等[8]发现从三七发酵液提取的三七多糖对DPPH自由基、羟自由基等具有一定清除作用。现已有研究表明，天然多糖如：银耳多糖、山药多糖、灵芝多糖等具有良好的吸湿保湿性能，在日化产品中具有良好的应用前景[9]，而三七多糖是否具有吸湿、保湿的生物活性尚未见报道。
三七药渣是三七在工业中提取三七总皂苷后的废渣[10]，其中三七多糖、三七素等成分仍具有药用价值却不能得到有效利用。本课题组前期采用水提醇沉法，从工业三七药渣中提取三七粗多糖，通过DEAE Sepharose Fast Flow成功分离出中性多糖和酸性多糖，已证实三七药渣中提取的三七多糖具有多种生理活性[11-12]，且具有良好的安全性[13]。本文拟在前期研究基础上，首次考察从药渣中提取的三七粗多糖及纯化后各组分是否具有吸湿、保湿及体外抗氧化活性，为三七多糖用于日化产品、保健食品、药品研发奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 样品与试剂
三七药渣（云南三七科技提供）；D-无水葡萄糖对照品、D-半乳糖醛酸对照品、DPPH、ABTS（上海源叶生物）；甘油、抗坏血酸（VC）、七水合硫酸亚铁（广东光华科技）；海藻酸钠（上海易恩）；DEAE Sepharose Fast Flow填料（美国GE Healthcare）；透析袋（合肥白鲨生物科技）；其余试剂均为国产分析级纯。
1.2 仪器与设备
BSA224S万分之一分析天平（德国Sartorius公司）；DK-98- II水浴锅（天津市泰斯特）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣）；H1850高速离心机（湖南湘仪）；SCIENTZ-10ND 冷冻干燥机（宁波新芝）；玻璃干燥器（四川蜀玻集团）；岛津UV-1900紫外-分光光度计（日本岛津）；Bio-rad MODEL 680酶标仪（美国Bio-rad 公司）。
1.3 实验方法
1.3.1 三七多糖的提取、纯化及含量测定
采用水提醇沉法从工业三七药渣中提取CPPN，取干燥三七药渣1000 g，加入10倍量超纯水，沸水浴提取6 h，过滤；滤渣加入8倍量超纯水，沸水浴提取6 h，过滤；滤渣继续加入6倍量超纯水，沸水浴提取6 h，过滤。合并3次滤液，8000 r/min离心5 min，取上清液，80℃减压浓缩，至原体积的1/10后，加入滤液3倍体积的无水乙醇，放4 ℃下醇沉过夜。8000 r/min离心5 min，弃去上清液，收集沉淀。分别用无水乙醇、乙醚洗涤沉淀三次后加入适量超纯水复溶，冷冻干燥，即得CPPN。采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换填料对CPPN进行纯化，取CPPN 600 mg，溶于20 mL超纯水中，8000 r/min离心10 min去除不溶物，经0.45 μm微孔滤膜过滤后上样，以超纯水、0.1、0.2、0.3 M NaCl溶液对其进行梯度洗脱，收集洗脱液，5 mL/管。硫酸蒽酮法跟踪检测，绘制洗脱曲线其中管数为横坐标，吸光度值为纵坐标。依据洗脱曲线，合并各组分，80℃减压浓缩至原体积1/10，超纯水透析36 h（MwCO 14000Da），每4 h换一次水。透析结束后，真空冷冻干燥，分离得到的各组分依次命名为NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ。采用硫酸蒽酮法，测定三七多糖中性糖含量，间羟基联苯法测定三七多糖糖醛酸含量[14]。
1.3.2 吸湿/保湿能力考察
参照蔡婉静等[15]在研究中采用的方法，以常用的保湿剂甘油和海藻酸钠对照，考察CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的吸湿和保湿能力。（1）吸湿性。准确称取CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ、甘油和海藻酸钠各0.5 g于称量瓶中，平行3份，将其放入置有饱和碳酸钾溶液（RH43%）和饱和硫酸铵溶液（RH81%）的干燥器内，室温下放置，并在4、8、12、24、36 h分别称量样品放置前重量（W0）和放置后的重量（W1），吸湿能力按照公式（1）计算：
$$ {\text{吸湿性}}(\%)=({\rm{W}}_0-{\rm{W}}_1)\times100/{\rm{W}}_0 $$ (1) （2）保湿性。准确称取CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ、甘油和海藻酸钠各0.5 g于称量瓶中，平行3份，并分别加入3倍样品质量的超纯水，转动称量瓶直至样品将水分完全吸收。将称量瓶放入装有干燥完全的硅胶的干燥室内，于室温下放置，并在4、8、12、24、36 h分别称量样品放置前重量（H0）和放置后的重量（H1）。保湿能力按照公式（2）计算:
$$ {\text{保湿性}}(\%)={\rm{H}}_1 \times100/{\rm{H}}_0 $$ (2) 1.3.3 抗氧化能力测定
（1） DPPH自由基清除能力。将维生素C和三七多糖各待测组分用蒸馏水配置成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL浓度的样液测定时，在96孔板中加入2×10-4 mol/L的DPPH乙醇溶液100 μL，然后加入100 μL待测液，摇匀后，在室温，黑暗处放置30 min，并测定517 nm处的吸光度值At，用乙醇代替DPPH溶液测定本底吸光度值Ar，用超纯水代替样品溶液测得参比溶液吸光度A0[16]。采用Vc作为阳性对照，同一测定设计3个平行，清除率按公式（3）计算:
$$ {\rm{DPPH}}{\text{自由基清除率}}(\%)=[1-({\rm{A}}_{\rm{t}}-{\rm{A}}_{\rm{r}})/{\rm{A}}_0]\times100 $$ (3) （2） ABTS+自由基清除能力。将5 mL的7 mmol/L ABTS和88 μL的140 mmol/L K2S2O8混合，常温避光条件下静置过夜（12 h），形成ABTS+自由基储备液。使用前用无水乙醇稀释成在734 nm波长下的吸光度为0.7±0.02工作液[17]。测定时，在96孔板中加入ABTS+工作液100 μL和100 μL待测液，振荡混匀，10 min后测定反应液在734 nm处的吸光值At，用乙醇代替ABTS+工作液测定本底吸光度值Ar，用超纯水代替样品溶液测得参比溶液吸光度A0。采用Vc作为阳性对照，同一测定设计3个平行，清除率由公式（4）计算：
$$ {\rm{ABTS}}^+{\text{自由基清除率}}(\%)=[1-({\rm{A}}_{\rm{t}}-{\rm{A}}_{\rm{r}})/{\rm{A}}_0]\times100 $$ (4) （3） 羟基自由基清除能力。配置2.25 mmol/LFeSO4水溶液、9 mmol/L水杨酸乙醇溶液，分别取50 μL加入96孔板，取50 μL待测液加入，再加入50 μL 8.80 mmol/L H2O2溶液，37 ℃反应30 min，测定510 nm处吸光度At。用超纯水代替H2O2测得对应待测溶液的本底吸光度值Ar，用超纯水代替待测液测得参比溶液吸光度A0[18]。采用Vc作为阳性对照，同一测定设计3个平行，清除率由公式（5）计算：
$$ {\text{羟基自由基清除率}}(\%)=[1-({\rm{A}}_{\rm{t}}-{\rm{A}}_{\rm{r}})/{\rm{A}}_0]\times 100 $$ (5) 2. 结果
2.1 三七多糖的提取、纯化及含量测定
1 000 g三七药渣采用经水提醇沉法，共提取到34.97g CPPN，得率为3.49 %。采用DEAE Sepharose Fast Flow对CPPN进行纯化，以超纯水、0.1、0.2、0.3 M NaCl溶液洗脱，共得到4个洗脱峰（洗脱曲线见图1），得率分别为27.68%、11.89%、15.41%、21.04%，对CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的含量测定结果如表1所示。
图 1 DEAE Sepharose Fast Flow洗脱曲线Figure 1. Elution curve with DEAE Sepharose Fast Flow表 1 三七多糖的含量测定结果（%）Table 1. Determined the contents of Panax notoginseng polysaccharide（%）样品 中性糖含量 糖醛酸含量 总糖含量 CPPN 32.4 36.25 68.65 NPPN 73.33 - 73.33 APPNⅠ 48.33 27.5 75.83 APPNⅡ 21.67 57.92 79.59 APPNⅢ 13.75 79.58 93.33 注：总糖含量 = 中性糖含量 + 糖醛酸含量。 2.2 三七多糖的吸湿性
在RH43%环境中，水分的含量随时间的变化结果如图2所示，三七多糖及各组分的吸湿率均逐渐上升，吸湿率大小依次为甘油>APPNⅢ>海藻酸钠>CPPN>APPNⅡ>APPNⅠ>NPPN，36 h时，吸湿率分别为37.21%、25.50%、23.55%、19.10%、18.43%、16.99%、13.20%。从图3可以看出，在高湿度（RH81%）环境中，在0～12 h，CPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的吸湿率上升较快，12 h～36 h变化缓慢，36 h时，吸湿率大小为甘油>APPNⅢ>海藻酸钠>APPNⅡ>APPNⅠ>CPPN>NPPN，吸湿率大小依次为83.57%、42.58%、39.76%、30.81%、27.80%、24.59%、20.80%。由两图对比显示，APPNⅢ在高湿度和低湿度下都具有良好的吸湿性，其吸湿性高于海藻酸钠。
图 2 三七多糖在RH43%环境中的吸湿率变化情况Figure 2. Relationship between moisture retention rate and time
图 3 三七多糖在RH81%环境中的吸湿率变化情况Figure 3. Relationship between moisture retention rate and time2.3 三七多糖的保湿性
保湿性考察实验结果如图4，在干燥硅胶环境中，CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ、甘油和海藻酸钠保湿率均持续下降，保湿率大小依次为APPNⅢ>海藻酸钠>CPPN>APPNⅡ>甘油>APPNⅠ>NPPN，在36 h时，保湿率分别为45.64%、40.35%、38.40%、36.15%、35.38%、34.35%、33.59%。
图 4 三七多糖在干硅胶环境中的保湿率变化情况Figure 4. Relationship between moisture retention rate and time2.4 三七多糖对DPPH的清除能力
由图5可知，CPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ对DPPH均具有较好的清除能力，且呈明显的量效关系，当多糖浓度为8 mg/mL时，CPPN对DPPH自由基的清除效果最好，达58.36%，而NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的清除率分别为12.90%、50.66%、37.26%、47.71%。抗氧化活性顺序为CPPN>APPNⅠ>APPNⅢ>APPNⅡ>NPPN。艾于杰等[18]发现纯化后的茶多糖清除DPPH清除能力纯化前强于纯化后，推测粗多糖对DPPH的清除作用可能为各组分结合后协同作用。本研究中三七粗多糖清除效果最好，推测其原因为七粗多糖中各组分协同发挥抗氧化作用。
图 5 三七多糖对DPPH的清除能力Figure 5. Scavening rate of DPPH of Panax notoginseng polysaccharide2.5 三七多糖对ABTS+的清除能力
ABTS 可被活性氧氧化，生成蓝绿色的ABTS+自由基，在734 nm 处有特征吸收，当抗氧化剂存在时，自由基被抗氧化剂清除时，蓝绿色会逐渐褪色或消失[19]。三七多糖及纯化后各组分对ABTS+的清除效果图6所示，随着多糖浓度的增大，其清除ABTS+自由基的效果也不断增强。当多糖浓度为8 mg/mL时，CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的清除率分别为95.91%、36.41%、87.37%、68.34%、83.34%，抗氧化活性顺序为CPPN>APPNⅠ>APPNⅢ>APPNⅡ>NPPN。三七粗多糖对ABTS+自由基的清除效果最好，分离纯化得到的4个组分中，APPNⅠ的清除效果较强，NPPN的清除能力较弱。有研究表明，多糖对ABTS+自由基的清除能力与DPPH自由基的清除能力具有一致性[20]，本研究中CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ对ABTS+的清除能力与对DPPH自由基清除能力趋势一致。
图 6 三七多糖对ABTS+的清除能力Figure 6. Scavening rate of ABTS+ of Panax notoginseng polysaccharide2.6 三七多糖对羟基自由基的清除能力
羟基自由基是机体内攻击性最强的活性氧，多糖是具有多羟基的醛或多羟基的酮，该结构上带有还原性的半缩醛羟基，使自由基被还原，从而阻止自由基进行连锁反应[21]。由图7可知，各浓度的VC对羟自由基的清除率最高，不同浓度的CPPN及纯化后各组分对羟自由基均具有一定的清除作用，随多糖浓度的升高，对羟自由基的清除能力也不断升高，当CPPN浓度为8 mg/mL，CPPN的清除能力为98.95%，与VC接近。同一浓度下，抗氧化活性顺序为CPPN>APPNⅢ>APPNⅡ>APPNⅠ>NPPN。
3. 讨论
本文采用水提醇沉法成功从三七药渣中提取出三七多糖，并经过DEAE Sepharose Fast Flow对其纯化，成功分离出NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ，并对CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的吸湿和保湿性能首次初步探究，发现APPNⅢ的吸湿性能优于海藻酸钠，其保湿性能也优于海藻酸钠及常用保湿剂甘油，表明APPNⅢ是一种优良的保湿剂。
自由基，是生物体新陈代谢的正常产物，在正常的生理状态下，人体内自由基的产生处于动态平衡中，受体内各种内源性抗氧化网络的严格调控。当机体平衡一旦被打破，体内自由基过多时，自由基会引发氧化应激损伤，诱导各种疾病的发生和发展，如炎症、肿瘤等疾病。现有研究表明，诸多植物多糖具有抗氧化活性，如：枸杞多糖[22]、茯苓多糖[23]。多糖的抗氧化活性常与多糖分子量、糖基组成、糖苷键类型、高级结构等相关[18]。三七多糖体外抗氧化活性研究显示：三七粗多糖与分离纯化后的各组分比较，其对三种自由基的清除效果最佳，抗氧化能力最强，推测三七粗多糖中各组分多糖的抗氧化性有协同作用；纯化后的三种酸性多糖的抗氧化活性均强于中性多糖，说明三七多糖的抗氧化性与其酸性基团密切相关。综上，通对三七多糖具有吸湿、保湿性能及体外抗氧化活性，表明三七多糖具有应用于日化行业、保健食品、药品的潜力，为工业三七药渣的综合利用提供了新思路，有利于三七资源的综合利用。
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图 1 高血压心室重构关键模块及其关键基因的筛选
A，B：样本聚类及表型热图。分支代表样本，纵坐标代表层次聚类的高度。分支对应红色临床性状代表该样本属于此类性状；C：软阈值筛选。横轴均代表权重参数power值，左图纵轴scale-free fit index，即signed R2，相关系数的平方越高，说明该网络越逼近无尺度分布，右图的纵轴代表对应的基因模块中所有基因邻接函数的均值；D，E：模块合并。F：模块与高血压心室重构相关性热图；G：模块基因与高血压心室重构相关性；H：高血压心室重构/正常样本之间差异表达基因的火山图。横坐标logFC表示差异倍数（高血压心室重构/正常），纵坐标表示可信程度-log10（adj. P-value）。图中每个点代表一个基因，蓝色和橙色的点代表显著差异表达基因。橙色的点表示其基因表达量在高血压心室重构样本中上调，蓝色的点表示基因在高血压心室重构样本中下调。横纵轴虚线分别表示log FC绝对阈值0和P-value阈值0.05。I为差异基因及相关模块基因韦恩图。
Figure 1. Screening of key modules of hypertensive ventricular remodeling and their key genes
图 2 关键靶点筛选及其调控网络
A：差异关键模块基因、药物靶点、疾病靶点取交集的韦恩图，图中黄色代表高血压心室重构的疾病靶点，红色表示药物靶点，绿色代表差异关键基因；B：关键靶点基因的GO富集条形图，纵坐标表示富集的GO Term，条形长短表示该GO Term富集到关键靶点的个数，颜色从蓝到红表示结果的可信度从低到高；C：关键靶点基因的KEGG通路富集气泡图，气泡大小表示通路基因多少，颜色从蓝到红表示结果的可信度从低到高。D，E：关键靶点-功能/通路的调控网络图，黄色六边形代表GO_MF Terms，橙色六边形代表GO_BP Terms，绿色六边形代表GO_CC Terms，蓝色圆点代表关键靶点。粉色六边形代表KEGG Pathways；蓝色圆点代表关键靶点。F：关键靶点的蛋白互作关系网络，其中线条代表它们之间的互作关系；颜色表示他们的degree值，颜色越深表示degree值越高，越处于核心位置。
Figure 2. Screening of key targets and their regulatory networks
图 3 高血压心室重构最佳诊断模型
A:LASSO回归分析筛选特征基因。横坐标deviance表示模型解释的残差的比例，显示了特征基因数量随解释的残差的比例（dev）之间的变化关系，纵坐标为基因系数（左）；横坐标为log（Lambda），纵坐标代表交叉验证的误差（右），实际中笔者希望交叉验证的误差在最小的位置，右图中，左侧虚线位置就是交叉验证误差最小的位置，根据该位置（lambda.min）确定对应的横坐标log（Lambda），上边显示了特征基因的数目，找到最优的log（Lambda）值，就左图中找到对应的基因和它的系数，以及该模型解释的残差的比例；B：ROC曲线对诊断模型的评估及验证；C、D：样本的累积残差分布图及样本残差的箱线图（曲线面积说明整体样本的累积残差值，曲线面积越小说明样本的累积残差值越小）；红点代表残差的均方；E：基因变量在RF模型中的重要性；F：ROC曲线对RF模型的评估。
Figure 3. Best diagnostic model for hypertensive ventricular remodeling
图 4 关键基因的筛选及其表达分析
A：LASSO诊断模型基因与RF模型基因的交集，粉色代表LASSO诊断模型基因，蓝色代表RF模型基因；B：生物标记物的ROC曲线；C：生物标记物的表达，绿色代表正常组，粉色代表高血压心室重构组；D：生物标记物的相关性，蓝色代表负相关，红色代表正相关。
Figure 4. Screening and expression analysis of key genes
图 5 生物标记物的中药药理调控网络
绿色正方形代表中药（Herb）；紫色圆点代表关键靶点；黄绿色菱形代表药物活性成分；红色正方形代表疾病（高血压心室重构）。
Figure 5. TCM pharmacological regulatory network of biomarkers
图 6 分子对接结果图
A：SELE与 Kaempferol 对接结果图，图中绿色双环棍棒模型为活性分子Kaempferol；B：MAPK1与 quercetin对接结果图，图中绿色双环棍棒模型为活性分子quercetin；C：IL2与 quercetin对接结果图，图中绿色双环棍棒模型为活性分子quercetin；D：CSNK2B与 Kumatakenin对接结果图，图中绿色双环棍棒模型为活性分子Kumatakenin。粉色棍棒结构为与活性成分有氢键相互作用的氨基酸残基，黄色虚线为活性成分与氨基酸残基之间形成的氢键。每根黄色的虚线代表一个氢键。
Figure 6. Molecular docking result
表 1 基因在RF模型中的重要性排序
Table 1. Ranking of importance of genes in the RF model
排序 基因 分值 模型 1 full model 0.1366 RF 2 MTHFD1 0.1345 RF 3 COMT 0.1357 RF 4 group 0.1366 RF 5 ATP1A1 0.1366 RF 6 P4HB 0.1366 RF 7 HDAC2 0.1366 RF 8 UBA1 0.1366 RF 9 SOD1 0.1366 RF 10 AKR1B1 0.1366 RF 11 RUVBL2 0.1366 RF 12 GOT1 0.1366 RF 13 CASP3 0.1366 RF 14 PPIA 0.1366 RF 15 CALM1 0.1366 RF 16 PRKACA 0.1366 RF 17 TPI1 0.1366 RF 18 CTSD 0.1366 RF 19 NOS3 0.1366 RF 20 GOT2 0.1366 RF 21 CSNK2B 0.1385 RF 22 MAPK1 0.139 RF 23 GHR 0.14 RF 24 MBL2 0.1432 RF 25 SELE 0.2202 RF 26 IL2 0.3298 RF 
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