动脉粥样硬化（Atherosclerosis）为一种与炎症相关的动脉血管病理改变过程，是冠状动脉粥样硬化性心脏病、主动脉夹层、动脉瘤等严重心血管疾病的病变基础^[1-2]。血管壁主要组成之一的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）在动脉粥样硬化的形成及发展起到重要的作用，血管内皮在受到炎症反应、机械性损伤、病毒感染等因素的刺激下，内皮表层组织受损，内皮下组织暴露在炎症等环境中，VSMCs应激性发生表型转变，由收缩表型向合成表型转化，致使处于稳定状态的VSMCs获得异常的增殖和迁移能力，迁移到血管内皮受损部位，参与动脉粥样硬化过程^[3]。但影响VSMCs迁移、增殖的内在机制复杂，尚未完全清楚。因此，深入研究引起VSMCs迁移功能的影响因素及调控机制对防治动脉粥样硬化具有重要意义。

木犀草素（luteolin，LUT）是一种天然存在于紫薇叶、蕃石榴叶等多种植物中的3，4，5，7-四羟基黄酮类化合物^[4]。此前研究显示，在结直肠癌、乳腺癌等肿瘤细胞中，木犀草素可抑制肿瘤细胞的增殖、诱导细胞凋亡，实现抗肿瘤特性^[5-6]。但木犀草素是否参与调控人主动脉平滑肌细胞（human aortic smooth muacle cells，HASMCs）的迁移功能，目前鲜有研究。

内质网是一种具有合成加工蛋白质、调节钙平衡、合成运输类固醇和脂类等多种生物功能的重要细胞器^[7-8]。内质网生物功能得以正常发挥的前提条件是内环境处于稳态。在应激损伤、炎症等情况下，内质网生物合成和信号转导等功能发生改变^[9-10]，大量未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网堆积，称内质网应激（Endoplasmic reticulum stress）。是否木犀草素通过内质网应激途径影响VSMCs的迁移，目前尚无相关报道。本实验以HASMCs为研究对象，探讨木犀草素对HASMCs迁移的影响，及通过调控内质网应激水平抑制HASMCs迁移的内在机制。为木犀草素在防治动脉粥样硬化相关疾病方面提供新的重要基础理论依据。

1.   材料与方法

1.1   材料

人主动脉平滑肌细胞（普诺赛生命科技有限公司）；胰蛋白酶（北京索莱宝公司）；胎牛血清（塞维尔生物科技有限公司）；高糖培养基（Hyclone公司）；木犀草素（北京索莱宝公司）；4-苯基丁酸钠（4-PBA，北京索莱宝公司）；二甲基亚砜（北京索莱宝公司）；BIP抗体（塞维尔生物科技有限公司）；CHOP抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；RNA提取液（塞维尔生物科技有限公司）；逆转录试剂盒（Thermo公司）；引物（塞维尔生物科技有限公司）；EvaGreen 2X q-PCR Master Mix试剂盒（abm公司）

1.2   方法

1.2.1   细胞培养

用10%胎牛血清+1%青链霉素的高糖培养基在37 ℃、含5%CO₂的培养箱中培养HASMCs，根据HASMCs的生长情况进行传代。

1.2.2   细胞划痕实验检测HASMCs迁移情况

Marker标记笔在六孔板背后均匀划横线（0.5～1 cm一条，横穿过孔，至少3条），取对数期生长良好的细胞按5×10⁵个/孔接种于六孔板内，待细胞铺满孔底，用枪头垂直于六孔板背后的横线划痕，PBS清洗3次去除划下的细胞，加入无血清培养基，并加入不同浓度的木犀草素（0、6.25、12.5、25、50 μmol/L），同时设置BC和NC，每组3个复孔，放入37 ℃、含5% CO₂的培养箱中培养。按12 h时间点取样拍照，观察细胞迁移情况，实验重复3次。

1.2.3   Western blot检测BIP和CHOP蛋白的表达

培养皿接种、培养HASMCs，并按照分组情况进行不同处理。12 h后收集各组细胞，PBS清洗3次，加入RIRA（150 µL）和PMSF（1 µL）预混液冰上裂解30 min，4 ℃、12000 r/min离心20 min，测上清液BCA法蛋白质浓度。取样品蛋白进行SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜上，封闭液封闭PVDF膜1.5 h，然后加入适量BIP和CHOP一抗4 ℃孵育过夜。第2天TBST液洗膜3次，每次10 min。然后加入相应二抗孵育1.5 h，TBST液洗膜后加入ECL显色液，暗室曝光收集图像，用Image J软件对条带进行灰度分析，重复3次。

1.2.4   RT-qPCR检测BIP和CHOP基因的表达

Trizol法提取各组HASMCs的总RNA并检测其浓度，根据试剂盒说明书依次进行逆转录合成cDNA，最后进行RT-PCR分析，反应参数为：95 ℃预变性 15min，95 ℃变性 30 s，60 ℃退火 1 min，40次循环，60 ℃延伸1 min。引物序列见表1。反应结束后基因的相对表达量用2-△△Ct计算，重复3次。

表  1  BIP、CHOP、GAPDH引物序列

Table  1.  BIP、CHOP、GAPDH primer sequence

名称	正向引物序列	反向引物序列
BIP	-TCTACTATGAAGCCCGTCCAGA -	-GCTTCATCTGGGTTTATGCCAC -
CHOP	-ATCTTCACCACTCTTGACCCTG-	-ACTCTGTTTCCGTTTCCTGGTT-
GAPDH	-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTT-	-GCCATGGGTGGAATCATATTGG-

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1.2.5   统计学处理

SPSS17.0软件分析结果，计量资料以$ \bar x \pm s $表示，多组间比较采用单因素方差分析进行统计，2组间的比较采用t检验，P < 0.05表示差异具有统计学意义。

2.   结果

2.1   木犀草素对HASMCs迁移的影响

用不同浓度的木犀草素（0、6.25、12.5、25、50 μmol/L）处理HASMCs，分别于12 h观察HASMCs划痕愈合情况（即细胞迁移情况）并进行拍照。图1结果表明：木犀草素抑制HASMCs的迁移，在实验浓度梯度范围内，随着木犀草素浓度的增加，各组HASMCs迁移的水平逐渐减弱（P < 0.05）。结果提示：木犀草素呈浓度依赖式抑制HASMCs的迁移。

图  1  木犀草素对HASMCs迁移率的影响

与0 μM组比较，^*P < 0.05。

Figure  1.  Effects of luteolin on migration rate of HASMCs

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2.2   木犀草素对HASMCs内质网应激的影响

蛋白BIP及CHOP与真核生物细胞内内质网应激水平密切相关，该两种蛋白的表达水平可反映细胞内内质网应激水平。为了探讨木犀草素是否对HASMCs细胞内内质网应激具有调控作用，使用内质网应激抑制剂4-PBA预处理HASMCs选择性抑制内质网应激信号通路，分别设置空白对照组（BC组）、阴性对照组（NC组）、25 μmol/L木犀草素组和木犀草素（25 μmol/L）+4-PBA（1 mmol/L）共处理组，处理12 h，提取细胞总蛋白，Western Blot检测内质网应激相关蛋白BIP和CHOP的表达水平。结果显示：与BC组和NC组相比较，木犀草素组可明显促进HASMCs内质网应激相关蛋白BIP和CHOP的表达（P < 0.05）；RT-qPCR法检测BIP和CHOP的RNA表达水平，与免疫印迹检测结果一致，即木犀草素组BIP和CHOP的RNA表达增加（P < 0.01）；同时与木犀草素组处理组比较，4-PBA预处理组明显减弱了BIP和CHOP蛋白和RNA的表达，表明4-PBA预处理HASMCs后木犀草诱导的内质网应激水平受到抑制。结果提示木犀草素促进了HASMCs细胞内内质网应激的发生，见图2。

图  2  木犀草素对HASMCs内质网应激的影响

A：空白对照组、阴性对照组、木犀草素组和木犀草素+4-PBA共处理组处理12 h进行Western Blot实验后BIP、CHOP、β-actin蛋白显影情况；B：Western Blot检测木犀草素组内质网应激相关蛋白BIP表达水平；C：Western Blot检测木犀草素组内质网应激相关蛋白CHOP表达水平；D： RT-qPCR检测木犀草素组内质网应激相关基因BIP表达水平；E：RT-qPCR检测木犀草素组内质网应激相关基因CHOP表达水平 与空白对照组及阴性对照组比较，^**P < 0.01；与木犀草+4-PBA处理组比较，^*P < 0.05。

Figure  2.  Effects of luteolin on endoplasmic reticulum stress in HASMCs

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2.3   内质网应激抑制剂4-PBA对木犀草素介导的HASMCs迁移的影响。

为进一步探讨木犀草素是否通过细胞内质网应激抑制HASMCs的迁移，分别设置BC组、NC组、木犀草素组（25 μmol/L）、木犀草素（25 μmol/L）+4-PBA（1 mmol/L）共处理组，处理12 h后，细胞划痕实验结果显示（图3）：（1）BC组和NC组HASMCs迁移无明显差异；（2）与BC组和NC组相比，木犀草素组HASMCs迁移能力下降（P < 0.01）；（3）与木犀草素组相比，木犀草素+4-PBA共处理组HASMCs迁移能力增强（P < 0.05），表明4-PBA预处理后，木犀草素对HASMCs迁移的抑制作用减弱。结果提示，木犀草素对HASMCs迁移的抑制作用能被内质网应激抑制剂4-PBA减弱。综合上述实验结果，可以得出结论：木犀草素对HASMCs迁移的抑制作用是通过细胞内质网应激实现的。

图  3  细胞划痕实验检测HASMCs迁移水平

与对照组比较，^**P < 0.01；与木犀草素组比较，^*P < 0.05。

Figure  3.  HASMCs migration was detected by cell scratch assay

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3.   讨论

木犀草素是一种具有抗动脉粥样硬化生物活性的天然黄酮类化合物，广泛存在于多种植物中。Hsuan、Zhang等^[11-12]研究发现木犀草素可以通过抑制NF-κB信号通路和NLRP3炎性体的激活来减轻炎症反应而发挥抗动脉粥样硬化作用。此外，木犀草素还可以通过维持细胞内氧化还原稳态、减少胆固醇吸收等减缓动脉粥样硬化的发生发展^[13-14]。本实验首次以HASMCs为研究对象，探讨木犀草素对HASMCs迁移的影响及可能的机制。笔者选取不同浓度的木犀草素处理HASMCs，细胞划痕法观察它们对HASMCs迁移的影响。实验结果显示：木犀草素处理后的HASMCs的迁移率均降低，该结果提示木犀草素对HASMCs的迁移具有抑制作用。

已有的研究表明，调控内质网应激水平，可影响结肠癌细胞、小细胞肺癌细胞等肿瘤细胞的增殖、迁移等功能^[15-17]。中成药成分五味子素能够通过激活内质网应激移植胃癌细胞的增殖、迁移^[18]。研究发现，木犀草素能上调内质网应激水平，引起NCI-H460肺癌细胞凋亡和非经典自噬，从而实现抑制肿瘤细胞的生长^[19]。本研究通过实验探讨木犀草素是否通过内质网应激途径对HASMCs的迁移产生影响。通过实验证实，木犀草素处理HASMCs能促进内质网应激相关蛋白BIP、CHOP的蛋白及RNA表达，上调内质网应激水平，并抑制HASMCs迁移，而内质网应激抑制剂4-PBA预处理后不仅下调了内质网应激相关蛋白BIP、CHOP的蛋白及RNA表达，下调内质网应激水平，同时还降低了木犀草素对HASMCs迁移的抑制作用。因此，根据实验结果可以推测木犀草素抑制HASMCs的迁移可能是通过促进内质网应激反应产生的。

综上所述，本研究显示木犀草素对HASMCs迁移有抑制作用，其内在机制与内质网应激相关。中成药是我国宝贵的医学知识宝库，云南省植物物种丰富，中成药数量储量巨大，质量优越，部分中成药富含的特有分子及蛋白，对细胞增殖、凋亡、自噬、迁移等生物学功能有明显调控作用，进而对肿瘤、感染性疾病、代谢异常疾病等发挥积极治疗作用，其中内在机制已被广泛关注和研究。笔者应该利用好中成药资源，充分发掘和应用中成药在动脉粥样硬化中的积极作用，阐明中成药成分对动脉粥样硬化影响的作用机制，为研发更多抗动脉粥样硬化药物提供有力的科学理论支持，进而为传统医学，特别是中成药治疗心血管疾病进行科学证明，为未来心血管疾病药物治疗突破提供新思路和新策略。笔者的研究结论，可为进一步研究和开发木犀草素相关防治动脉粥样硬化新药物的研发提供理论依据。但木犀草素是通过内质网应激的哪一条具体信号通路抑制HASMCs的迁移尚不清楚，在今后的研究工作中将继续深入及完善。