Construction of Stable Transfected Cell Line A549 of Non-small Cell Lung Cancer by Overexpressing and Knocking Down LncRNA RP11-521C20.3
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摘要:
目的 构建过表达及敲减LncRNA RP11-521C20.3的非小细胞肺癌A549稳转细胞株。 方法 根据lncRNA RP11-521C20.3基因序列，设计合成引物并进行扩增。将目的基因与Sbf I和EcoRI酶切的载体连接，构建pcSLenti-pA-RP11-521C20.3-CMV-SFH-EGFP-P2A-Puro-WPRE重组质粒，转染293T细胞，包装含lncRNA RP11-521C20.3质粒重组体的慢病毒。构建shRNA（RP11-521C20.3），连接到AgeI和EcoRI双酶切后的pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE载体上，经鉴定后转染293T细胞。再利用慢病毒介导，构建重组质粒pcSLenti-pA-RP11-521C20.3-CMV-SFH-EGFP-P2A-Puro-WPRE和pSLenti-U6-shRNA（RP11-521C20.3）-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE，导入A549细胞。最后采用RT-qPCR技术在基因水平检测lncRNA RP11-521C20.3的表达。 结果 OV-lncRNA RP11-521C20.3组（过表达组）的lncRNA RP11-521C20.3 mRNA表达量高于NC-lncRNA RP11-521C20.3组（过表达对照组）（P < 0.001），差异倍数为（20.43±0.69）。sh-lncRNA RP11-521C20.3组（敲减组）的lncRNA RP11-521C20.3mRNA表达量低于sh-NC组（敲减对照组）（P < 0.001），差异倍数为（0.21±0.08）。 结论 成功构建了lncRNA RP11-521C20.3过表达及敲减稳转细胞株。为后续研究lncRNA RP11-521C20.3在慢性阻塞性肺疾病（COPD）发病机制中的作用奠定重要基础。 -
关键词:
- lncRNA RP11-521C20.3 /
- 非小细胞肺癌 /
- A549 /
- 慢病毒载体
Abstract:Objective To construct stable transfected cell lines of non-small cell lung cancer A549 with overexpression and knockdown LncRNA RP11-521C20.3. Methods According to lncRNA RP11-521C20.3 gene sequence, primers were designed and amplified. The target gene was then connected to a vector that had been cleaved with Sbf I and EcoRI enzymes to construct the recombinant plasmid pcSLenti-pA-RP11-521C20.3-CMV-SFH-EGFP-P2A-Puro-WPRE. This plasmid was transfected into 293T cells to package the Lentivirus containing the lncRNA RP11-521C20.3 plasmid. An shRNA （RP11-521C20.3） was constructed and connected to the pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE vector after being modified with AgeI and EcoRI enzymes. This vector was then transfected into 293T cells after verification. Recombinant plasmids pcSLenti-pA-RP11-521C20.3-CMV-SFH-EGFP-P2A-Puro-WPRE and pSLenti-U6-shRNA （RP11-521C20.3）-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE were then constructed using the lentivirus-mediated method and introduced into A549 cells. Finally, RT-qPCR technology was used to detect the expression of lncRNA RP11-521C20.3 at the gene level. Results The expression level of lncRNA RP11-521C20.3 mRNA in the OV-lncRNA RP11-521C20.3 group （overexpression group） was higher than that in the NC-lncRNA RP11-521C20.3 group （overexpression control group） （P < 0.001）, with a fold change of （20.43±0.69）. The expression level of lncRNA RP11-521C20.3 mRNA in the sh-lncRNA RP11-521C20.3 group （knockdown group） was lower than that in the sh-NC group （knockdown control group） （P < 0.001）, with a fold change of （0.21±0.08）. Conclusion In this study, a stable cell line with overexpression and knockdown of lncRNA RP11-521C20.3 was successfully constructed, which laid an important foundation for the subsequent study of the role of lncRNA RP11-521C20.3 in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease （COPD）. -
Key words:
- lncRNA RP11-521C20.3 /
- Non-small cell lung cancer /
- A549 /
- Lentiviral vector
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炎症性肠病（inflammatory bowel disease， IBD）包括克罗恩病（Crohn’ s disease，CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC），是一组累及回肠和结肠甚至全消化道的慢性非特异炎症性疾病[1]，病因尚不明确，可能与遗传和环境等因素有关[2]，IBD作为常见的慢性消化系统心身疾病，近20 a来在中国的患病率显著増加，南方地区IBD、UC、CD 标化后发病率分别为 3.14/10 万、 2.05/10 万、1.09/10 万[3]；这种“西方疾病”如今已成为全球性疾病[4]。IBD多发生于青少年，患病后需反复、多次住院，严重影响患者的生理、心理、社会健康及生活质量，常引起生活质量及工作效率下降，甚至出现抑郁等症状[5-6]。传统的测量方法如药物治疗评估已经不能满足健康的定义，患者自身的抑郁、焦虑以及来自社会的歧视等相对于躯体带来了更多的痛苦。研究者万崇华等在慢性病生命质量测定量表体系（QLICD）[7-8]的基础上进一步研制了慢性病患者报告结局测定量表体系PROISCD，初步完成了共性模块以及10多种慢性病特异量表的研制 [9-10]，该量表体系主要针对慢性病的共性模块和针对消化系统疾病的特异模块构成，因此本文主要围绕IBD的特殊心理、消化系统症状、全身症状、肠外症状、饮食受限、治疗副作用6个侧面的特异症状研制特异模块量表，以形成适合我国炎症性肠病的PRO测定量表。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
本调查选取昆明医科大学第一附属医院消化科门诊和住院的IBD确诊患者作为研究对象， 时间为2020年10月至2021年3月。纳入标准：（1）符合诊断标准[11]，确诊３个月以上；（2）小学及其以上文化；（3）有独立的思维能力；（4）无并发其他严重疾患，无严重精神疾患；（5）非病危、自愿合作者。排除标准：（1）文盲；（2）精神疾病患者；（3）不愿意合作者；（4）病危，并发其它严重疾病，如慢性阻塞性肺病、严重肺部感染、心功能不全、严重肝肾功能不全、糖尿病、甲状腺功能亢进、严重精神疾患等；本研究遵照患者自愿、信息保密、无伤害的原则，已通过昆明医科大学伦理委员会审核。
1.2 研究步骤
先由研究者查阅大量文献，提出条目池，将特异模块条目进行整理归纳，每个条目需说明其侧面（如疾病症状）、子侧面（如消化系统症状）、序号、条目计分/回答选项、提出的依据和理由，然后集合消化内科、统计学、心理学、社会学和PRO研究领域专家进行第一次讨论，再根据专家意见筛选和增加炎症性肠病患者较为重要的条目和进行语言表述方面的修改，形成初步量表。选取昆明医科大学附属医院作为研究现场，调查者以医生的身份在门诊对69名IBD患者进行调查，同时调查和访谈了31位消化内科医生，患者填写的上述形成的初步量表和医生填写的访谈表由调查者收回并检查和剔除，应用经典测量理论进行条目初筛。再次进行专家讨论，并进行语言调试，确定最终特异模块量表条目。
1.3 调查工具与条目计分
调查工具为IBD患者报告临床结局量表特异模块初步量表，条目计分釆用Likert５分法[12]，反应尺度分为五个等级，最好为1分，最不好为5分，分别记为1、2、3、4、5分。条目筛选方法见表1。
表 1 条目筛选和统计方法Table 1. Item selection and statistical methods评价方法 方法解释 入选标准 临界比值法 从条目的区分度来筛选；得分最低的28%为低分组，得分最高的28％为高分组，各条目得分做差异性分析。 2组得分有差异（P < 0.05） 离散趋势法 敏感度角度筛选；标准差越大，说明条目越敏感。 SD≥0.8 克朗巴赫a系数法 计算总量表的克朗巴赫a系数，每删除一个条目再计算克朗巴赫a系数。 α1 > α 因子分析法 采用主成分分析法，按照特征根 > 1提取公因子，做最大正交旋转，选取在对应公因子上载荷最大的条目。 因子负荷系数≥0.5，或该条目除了所归属的因子外，在其他因子的载荷数值≤0.5 相关系数法 从代表性筛选条目。计算总分与每个条目的线性相关系数。 相关系数≥0.5 医生重要性评分 医生重要性评分的平均数。 $\bar X $≥3.5分 1.4 统计学处理
应用Epidata3.0创立数据库，将数据导入SPSS22.0进行数据处理，检验水准选取0.05。
2. 结果
2.1 调查对象基本情况
此次调查共发放70份炎症性肠病PRO特异量表进行患者现场填写，收回70份问卷，回收率100％，1人未填写完整，共69份有效问卷，有效率98.57％。预调查对象的最小年龄8岁，最大年龄75岁，中位年龄40岁，36～50岁年龄段最多，29人，占比42.0%；其余基线资料见表2。
表 2 患者基线资料[n（%）]Table 2. Baseline data of patients [n（%）]项目 病例数 性别 男 40（58.0） 女 29（42.0） 民族 汉族 56（81.2） 少数民族 13（18.8） 年龄组 0～20岁 3（4.3） 21～35岁 22（31.9） 36～50岁 29（42.0） 51～65岁 11（15.9） 66岁以上 4（5.8） 婚姻情况 已婚 55（79.7） 未婚 12（17.4） 离婚 1（1.4） 丧偶 1（1.4） 文化程度 小学及以下 7（10.1） 初中 18（26.1） 高中/专科 22（31.9） 本科及以上 22（31.9） 高血压、糖尿病等家族史 有 6（8.7） 无 63（91.3） 除消化道以外的其他既往病史 有 19（27.5） 无 50（72.5） 近2周药物治疗情况 有 58（84.1） 无 11（15.9） 近2周手术治疗情况 有 4（5.8） 无 65（94.2） 近2周心理健康治疗情况 有 3（4.3） 无 66（95.7） 2.2 条目筛选结果
按照以上6种方法进行条目综合筛选，删除２项及以上不符合的条目，结果15个条目均入选。其中临界值法显示每项条目的高低分组在得分上均有差异（P < 0.05），说明具有很好的区分度，不予以删除条目，见表3；离散趋势法中5、8条目的SD < 0.8，应该予以删除；Cronbach系数α法中分别删除条目14、15计算得到的领域Cronbach系数α < 0.890，予以删除。因子分析法中得到KMO = 0.797，巴特利特球形度检验P < 0.05，满足因子分析条件，按特征根 > 1，选取了3个公因子，其累计载荷值为64.505%，做最大正交旋转，刪除各因子上负荷 < 0.5的条目及在两个及以上因子负荷系数相近且无特异性的条目，结果所有条目均满足条件，不予以删除。线性相关系数结果显示总分与每个条目的相关系数都 > 0.5，不予以删除任何条目；医生重要性评分所有条目平均分为3.57～4.36分，大于 3.5 分，不删除条目，最终所有条目都入选，见表4。
表 3 临界比值法高低分组各条目差异性分析[（$\bar x \pm s $ ），分]Table 3. Analysis of the difference of each item of high and low grouping by critical ratio method [（$\bar x \pm s $ ，points）]条目序号 低分组 高分组 t P 1.大便次数 1.47 ± 0.612 2.68 ± 1.293 −3.688 0.001* 2.大便带有脓血 1.26 ± 0.562 2.47 ± 1.172 −4.059 < 0.001* 3.按压腹部，腹痛加剧 1.11 ± 0.315 2.26 ± 1.098 −4.42 < 0.001* 4.腹部不适 1.47 ± 0.513 3.05 ± 0.848 −6.944 < 0.001* 5.因肠道问题致粪尿渗出 1.05 ± 0.229 1.68 ± 1.003 −2.676 0.011* 6.肛周疼痛、脓肿、肛裂 1.00 ± 0.01 2.21 ± 1.084 −4.867 < 0.001* 7.想排便又排不尽 1.42 ± 0.692 3.00 ± 0.943 −5.883 < 0.001* 8.感觉发热 1.00 ± 0.00 1.79 ± 1.273 −2.704 0.013* 9.头昏或感觉贫血 1.32 ± 0.582 2.47 ± 1.124 −3.987 < 0.001* 10.肠外症状 1.16 ± 0.375 2.68 ± 1.565 −4.133 < 0.001* 11.怕找不到洗手间困扰 1.16 ± 0.375 2.47 ± 1.429 −3.883 < 0.001* 12.担心疾病影响婚姻 1.53 ± 0.697 2.95 ± 1.471 −3.806 < 0.001* 13.饮食限制的影响 1.74 ± 0.653 3.68 ± 1.057 −6.832 < 0.001* 14.因做肠镜而烦恼 1.58 ± 0.692 3.47 ± 1.429 −5.202 < 0.001* 15.药物副作用影响 1.63 ± 0.597 3.32 ± 1.336 −5.018 < 0.001* *P < 0.05。 表 4 6种统计方法条目筛选情况（$\bar x \pm s $ ）Table 4. Selection of items of 6 statistical methods （$\bar x \pm s $ ）条目序号及简述 临界比法 离散趋势法 克朗巴赫
a系数因子分析法 相关系数法 医生重要性
评分医生评分
满分比（%）入选 特异模块 0.890 1.大便次数 P < 0.05* 1.96 ± 0.91* 0.881* 0.653* 0.699* 4.26 ± 1.01* 50.0 √ 2.大便带有脓血 P < 0.05* 1.71 ± 0.90* 0.883* 0.675* 0.603* 4.45 ± 0.99* 64.3 √ 3.按压腹部，腹痛加剧 P < 0.05* 1.54 ± 0.81* 0.880* 0.736* 0.691* 4.07 ± 0.95* 35.7 √ 4.腹部不适 P < 0.05* 2.1 ± 0.89* 0.879* 0.527* 0.708* 4.19 ± 0.77* 38.1 √ 5.因肠道问题致粪尿渗出 P < 0.05* 1.33 ± 0.65 0.884* 0.783* 0.610* 3.79 ± 1.03* 26.2 √ 6.肛周疼痛、脓肿、肛裂 P < 0.05* 1.65 ± 0.85* 0.880* 0.711* 0.701* 4.26 ± 1.06* 54.8 √ 7.想排便又排不尽 P < 0.05* 2.22 ± 0.99* 0.882* 0.715* 0.648* 4.07 ± 1.09* 45.2 √ 8.感觉发热 P < 0.05* 1.28 ± 0.765 0.886* 0.800* 0.564* 4.17 ± 1.10* 52.4 √ 9.头昏或感觉贫血 P < 0.05* 1.8 ± 0.90* 0.880* 0.739* 0.697* 3.9 ± 1.14* 38.1 √ 10.肠外症状 P < 0.05* 1.77 ± 1.11* 0.880* 0.813* 0.678* 4.36 ± 1.06* 61.9 √ 11.怕找不到洗手间困扰 P < 0.05* 1.8 ± 0.99* 0.871* 0.757* 0.667* 3.57 ± 0.99* 19.0 √ 12.担心疾病影响婚姻 P < 0.05* 2.07 ± 1.15* 0.881* 0.529* 0.664* 3.64 ± 1.06* 23.8 √ 13.饮食限制的影响 P < 0.05* 2.68 ± 1.16* 0.882* 0.882* 0.673* 3.93 ± 1.05* 33.3 √ 14.因做肠镜而烦恼 P < 0.05* 2.67 ± 1.26* 0.892 0.815* 0.543* 3.79 ± 1.14* 31.0 √ 15.药物副作用影响 P < 0.05* 2.39 ± 1.16* 0.892 0.775* 0.501* 3.9 ± 1.14* 40.5 √ *代表对应的筛选方法选入，√表示被综合选入。 2.3 专家德尔菲法结论和以患者为主的筛选结果对比
通过量表程序化研制过程：（1）提出特异模块条目池；（2）召集专家讨论；（3）将医生和患者的数据采用以上6种方法进行条目综合筛选，其中专家德尔菲法结果提示15个条目均保留：所有条目重要性评分最小平均数为3.57分（> 3.5 分），满分比为19.0%～61.9 %，说明专家对各条目重要性的意见集中，而所有条目的变异系数（CV）在0.19～0.32之间（< 0.7），可认为专家意见的协调程度高，由此通过专家和患者角度所筛选的条目一致；（4）再次进行专家讨论，最终形成了涵盖6个侧面，15个条目炎的症性肠病特异模块的PRO测试量表，并将6个侧面的条目经系统聚类分析聚成4类，其中消化系统症状和IBD11聚在第1类，全身症状和肠外症状聚在第2类，饮食受限和治疗副作用聚在第3类，IBD12：对恋爱或婚姻生活的影响聚在第4类，见表5和图1。
表 5 通过德尔菲法和聚类分析共同确定的炎症性肠病PRO特异模块量表Table 5. Inflammatory bowel disease PRO specific module scale jointly determined by Delphi method and cluster analysis专家德尔菲法 系统聚类法 侧面 条目编号与条目内容描述 类别 条目编号 消化系统症状 IBD1.您的大便次数频繁吗？ Cluster 1 IBD1 IBD2.您的大便带有脓血吗？ IBD2 IBD3按压腹部，您有腹痛或腹痛会加剧吗？ IBD3 IBD4.您有腹部不适（腹痛、腹胀等）吗？ IBD4 IBD5.您有因为肠道问题导致粪便和尿渗出吗？ IBD5 IBD6.您有肛周疼痛、脓肿、肛裂吗？ IBD6 IBD7.您有想排便又排不尽的感觉吗？ IBD7 全身症状 IBD8.您有发热吗？ IBD11 IBD9.您有头晕、心慌、乏力吗？ Cluster 2 IBD8 肠外症状 IBD10.您有肠外症状（如关节疼痛、红斑等）吗？ IBD9 特殊心理 IBD11.您有因为害怕找不到洗手间而感到困扰吗？ IBD10 IBD12.您有担心疾病影响了您的恋爱或婚姻生活吗？ Cluster 3 IBD13 饮食受限 IBD13.饮食方面的限制对您影响大吗？ IBD14 治疗副作用 IBD14.您有因经常服药或进行肠镜检查而感到苦恼吗？ IBD15 IBD15.药物副作用（如脱发、痤疮等）对您影响大吗？ Cluster 4 IBD12 
图 1 各条目使用组间平均链接的谱系图Figure 1. The pedigree diagram of each item using the average link between groups3. 讨论
目前中国关于IBD的西医临床治疗效果评价主要依据《中国IBD诊断与治疗的共识意见（2012 年·广州）》的评价标准[13]，包括2种：（1）临床疗效评定：主要适用于临床工作， ①缓解：临床症状消失，结肠镜复查黏膜大致正常或无活动性的炎性反应； ②有效：临床症状基本消失，结肠镜复查黏膜轻度炎性反应；③无效：临床症状和结肠镜复查都无改善；（2）改良的 Mayo 评分：包括血便、排便次数、内镜发现以及医师总体评价4个方面，适用于科研，也可用于临床；但无法全面反映患者自我感觉症状、治疗满意度、副作用等[14]。因此本研究采用IBD患者报告结局量表，全面评估患者的生理、心理、社会功能和生活状态满意度，对临床疗效评价、治疗方法调整等具有借鉴意义，因此从患者自我感受出发，采用PRO综合评价其治疗措施及其影响因素是较好的方法[15-16]。
当前国内外医学领域已开发的PRO量表均基于中医症状或一病多表，消化系统 PRO 量表主要包括慢性胃炎、慢性肠炎、消化性溃疡和IBS等[17-18]；但对症性肠病的生命质量或PRO量表研究却较少见，目前国内主要采用普适性量表或研制汉化版量表对IBD患者进行生命质量的测定，如学者朱丹玲、徐红文等[19-20]将瑞典Henrik博士研制的IBD简明健康量表汉化修订后进行信度、效度、区分度检验，并用于临床上IBD患者生活质量的测定，余卓文等[21]研制了汉化版本的儿童IBD生活质量量表（IMPACT-Ⅲ），尚星辰等编制出包含 36 个条目，7 个维度的IBD患者自我管理行为量表[22]，普适性量表虽然应用较广，可用于不同疾病以及同种疾病不同治疗方法间生命质量的对比研究，但针对性较差，内容效度欠佳，针对IBD患者一些特异的自觉症状很难准确测量，缺乏代表性[23]。
本研究主要从患者角度，综合采用多种方法来进行炎症性肠病PRO量表条目的筛选，再次通过专家德尔菲法：专家意见的集中程度和协调程度对条目进行再筛选；关于条目筛选当前国内外还未有统一的统计分析方法，且每种统计方法保留的界限也没有规定[23]。本研究显示通过专家（德尔菲法）和患者（统计分析）2个角度所筛选出的条目一致，在预调查阶段，临床纳入69例 IBD患者填写此PRO特异模块量表；临界比法显示各条目2组得分都有统计学差异，区分度较高；离散趋势法结果显示：有13个条目的SD大于0.8，条目敏感度较高，总的来说如果离散程度高，区分能力越高[24] ，本特异量表总的克朗巴赫ａ系数法为 0.890，每删除一个条目再计算克朗巴赫系数α1，除IBD14、IBD15以外，α1均大于α，说明有较好的内部一致性信度，一般认为α大于 0.7表示信度较好[25]。从内容效度方面来看，此量表编制前期查阅大量国内外相关文献，对患者进行面对面的访谈，并且采用德尔菲法经过反复专家意见咨询，最终按照专家意见而筛选得来，且严格按量表编制过程进行，由此能保证量表条目的内容效度；本研究应用因子分析法，主要从结构效度来筛选，其基本思想是对相关的多个可测变量进行分类，通过降维将其化为相互无关的变量；因子分析结果显示:一共选取了3个公因子，其累计载荷值为64.505％，做最大正交旋转，各条目50% 以上的变量能被提取的公因子解释，也不存在两个或两个以上因子载荷系数相近的情况；采用相关系数法，是从代表性来筛选条目，相关关系数显示总分与各条目相关系数均大于0.5（P < 0.05），由以上两种方法表明该量表的代表性结构效度较好；此外本本研究中医生重要性评分的入选标准是3.5分，有些文献的评价标准为分80分，按照5分制换算为4分[23]，有些文献则按照医生重要性评分满分比来作为入选标准[26]，与本研究存在差异。从量表的可行性方面来看，量表回收率为100%，面对面访谈中仅有一人未填写完成，有效率为98.57%，完成问卷平均时间为3 min，说明量表的可行性较强；此外本研究还采用了聚类分析来考察量表结构的设计和条目分类是否合理，结果提示:除了全身症状和肠外症状聚为同一类，饮食受限和治疗副作用聚为同一类外，其结果与德尔菲法结果基本一致，提示该特异模块量表结构设计较合理[27]。
本次研究通过６种统计方法筛选出的条目具有较好的信度、效度、代表性，该特异量表适合我国文化和国情，条目少，医生对每个条目的语言表述赞成率均较高，患者易理解，使用方便，可为我国IBD患者临床疗效评估、治疗方案调整等提供参考依据，用于评价我国 IBD 患者的健康状况和生活质量具有一定可行性。本量表研究也存在一些不足之处：接下来的研究需要进一步考核该特异量表的推广性；将其与其他适用于我国临床应用并公认的关于炎症性肠病的量表进行对比，以考核量表的校标关联效度，并检验其在临床中的应用价值。
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图 2 LncRNA RP11-521C20.3敲减表达质粒图谱
Figure 2. LncRNA RP11-521C20.3 knockdown expression plasmid map
图 3 lncRNA RP11-521C20.3过表达重组质粒测序结果
Figure 3. Sequencing results of lncRNA RP11-521C20.3 overexpressed recombinant plasmid
图 4 lncRNA RP11-521C20.3敲减重组质粒测序结果
Figure 4. Sequencing results of lncRNA RP11-521C20.3 knockdown recombinant plasmid
图 5 293T细胞中慢病毒滴度检测荧光图片（100×）
Figure 5. Fluorescent image of lentivirus titer detection in 293T cells （100×）
图 6 LncRNA RP11-521C20.3过表达慢病毒载体转染A549细胞明场图像和荧光图像（100×）
Figure 6. LncRNA RP11-521C20.3 overexpressed lentiviral vector transfected A549 cells with bright field image and fluorescence image （100×）
图 7 RT-qPCR检测A549稳转株中lncRNA RP11-521C20.3表达量
*** P<0.001。
Figure 7. The expression of lncRNA RP11-521C20.3 in stable A549 strain was detected by RT-qPCR
图 8 RP11-521C20.3敲减慢病毒载体转染A549细胞明场图像和荧光图像（100×）
Figure 8. RP11-521C20.3 knockdown virus vector transfected A549 cells bright field image and fluorescence image（100×）
图 9 RT-qPCR检测A549稳转株中lncRNA RP11-521C20.3表达量
***P < 0.001。
Figure 9. The expression of lncRNA RP11-521C20.3 in stable A549 strain detected by RT-qPCR
表 1 LncRNA RP11-521C20.3 PCR扩增引物序列步骤
Table 1. LncRNA RP11-521C20.3 PCR amplification primer sequence
步骤 引物与试剂 扩增引物Forward 5′-CCCTGCTTTGGGGTTGTGA-3′ Reverse 5′-GGAGGCTTTGTGGCTTGCT-3′ PCR扩增体系 5×PrimeSTAR®Buffer 10 µL，dNTP Mixtur 4 µL，正、反向引物各1 µL，模板
DNA < 200 ng，PrimeSTAR® HS DNA Polymerase 0.5 µL，灭菌蒸馏水加至50 µL反应条件 98℃ 10sec，55℃ 5sec，72℃ 1 min/kb，30个循环 扩增产物凝胶电泳 1.5%琼脂糖凝胶电泳 胶回收 TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0 
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表 2 过表达重组载体构建酶切反应体系
Table 2. Enzyme digestion reaction system for construction of overexpressed recombinant vectors
试剂 体积 质粒 2 μg 10 x反应Buffer 5 µL SbfI 1 µL EcoRI 1 µL ddH2O Up to 50 µL
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表 3 过表达重组质粒反应体系
Table 3. Overexpressed recombinant plasmid reaction system
试剂 体积 5x反应Buffer 4 µL 插入片段 2 µL 线性化体 1 µL 无缝克隆酶 2 µL CCH2O Up to 20 µL
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表 4 过表达重组质粒鉴定体系
Table 4. Identification system of overexpressed recombinant plasmid
试剂 体积 Premix Tag 25 µL 模板 1 µL 引物1（20 µM） 1 µL 引物2（20 µM） 1 µL 超纯水 Up to 50 µL
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表 5 慢病毒包装试剂
Table 5. Lentivirus packaging reagent
试剂 体积 载体质粒 20 μg pHelper 1. 0载体质粒 15 μg pHelper2. 0载体质粒 10 μg 转染试剂 Up to 1mL
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表 6 shRNA序列
Table 6. shRNA sequence
名称 序列（5′-3′） Y16185-F CcggCCAGATCTGTTGACCAACTTTCAAGAGAAGTTGGTCAACAGATCTGGTTTTTTg Y16185-R aattcaaaaaaCCAGATCTGTTGACCAACTTCTCTTGAAAGTTGGTCAACAGATCTGG GL427NC2-F CcggCCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGGTTTTTTg GL427NC2-R aattcaaaaaaCCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG
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表 7 敲减载体构建酶切反应体系
Table 7. Enzyme digestion reaction system for knockdown vector construction
试剂 体积 质粒 2 μg 10x反应Buffer 5 μL AgeI 1 μL EcoRI 1 μL ddH2O Up to 50 μL
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表 8 敲减重组体PCR鉴定体系
Table 8. Knock-down recombinant PCR identification system
试剂 体积 Premix Tag 2 μg 模板 1 μL 引物1（20 μM） 1 μL 引物2（20 μM） 1 μL ddH2O Up to 50 μL
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