Enhanceing Effect of EZH2 Inhibitors in Combination with GC Chemotherapeutic Agents in Bladder Cancer
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摘要:
目的 探究多梳蛋白zeste基因増强子类同源物2（histone methyltransferase enhancer of Zeke 2，EZH2）抑制剂对膀胱癌治疗中吉西他滨联合顺铂（gemcitabine and cisplatin，GC）化疗方案中的增敏作用。 方法 首先构建 EZH2 siRNA敲低系，然后使用qPCR与WB检测验证siRNA在膀胱癌UCC细胞中的表达水平。根据不同的处理分为对照组（膀胱癌T24细胞正常培养）、GC化疗组（T24细胞+GC化疗药物）、si EZH2转染组（T24细胞+si EZH2转染+GC化疗药物）、GSK126抑制剂组（T24细胞+GSK126 5 μM+GC化疗药物）、UNC1999抑制剂组（T24细胞+UNC1999 5 μM+GC化疗药物）、EI1抑制剂组（T24细胞+ EI1 5 μM+GC化疗药物）、DZNep1抑制剂（T24细胞+DZNep1 5 μM+GC化疗药物）与EPZ005687抑制剂（T24细胞+EPZ005687 5 μM+GC化疗药物），采用CCK-8、平板克隆形成与Annexin/PI等实验分别检测8组细胞增殖率、凋亡率及其对细胞周期影响。随后将30只BALB/C雌裸鼠随机分为对照组（膀胱癌T24细胞正常培养）、T24细胞+ EZH2抑制剂的溶媒缓冲液组、T24细胞+GC化疗组、T24细胞+UNC1999 EZH2抑制剂组与T24细胞+ UNC1999 EZH2抑制剂+GC化疗组，每组6只。裸鼠成瘤实验检测转染后各组UCC细胞移植瘤的生长情况，免疫组化染色法观察移植瘤组织中Ki67和EZH2的表达，血常规检测白细胞、红细胞及血小板数量裸鼠骨髓抑制情况。 结果 在已转染了siRNA质粒的T24细胞中，siEZH2-1与siEZH2-2在siRNA与蛋白表达水平上与对照组的差异有统计学意义（P < 0.01）。在细胞实验中，与对照组相比，上述7组实验组通过CCK-8、平板克隆与Annexin V/PI双染、Pi单染实验发现EZH2抑制剂可以抑制T24细胞的增殖、迁移和侵袭能力，早期凋亡细胞比例上调（ P < 0.01）。其中在平板克隆实验中，实验组T24细胞+EPZ005687 5 μM+GC化疗药物组细胞克隆数与对照组相比，差异有统计学意义（ P < 0.05）。小鼠体内实验表明，与对照组相比，经GC化疗药物或EZH2抑制剂的裸鼠瘤体重量减少（ P < 0.05），并且在血常规检测中血细胞含量也有所增高。 结论 EZH2抑制剂能够提高膀胱癌GC化疗方案的敏感性，从而降低膀胱癌细胞的增殖、迁移与裸鼠体内移植瘤的生长。同时，联合用药也能够显著减少其骨髓抑制情况。提示协同治疗在膀胱癌化疗增敏中具有一定的作用。 -
关键词:
- 膀胱癌 /
- 多梳蛋白zeste基因増强子类同源物2 /
- GC化疗
Abstract:Objective To explore the synergizing effect of histone methyltransferase enhancer of Zeke 2 （EZH2） inhibitors on Gemcitabine and Cisplatin （GC） chemotherapy regimen in bladder cancer treatment. Methods Firstly, EZH2 siRNA knockdown lines were constructed, and then the expression level of siRNA in bladder cancer UCC cells was verified using qPCR and WB. According to different treatments, these cells were divided into control group （bladder cancer T24 cells cultured normally）, GC chemotherapy group （T24 cells + GC）, siEZH2 transfection group （T24 cells + siEZH2 transfection + GC）, GSK126 inhibitor group （T24 cells + GSK126 5 μM + GC）, UNC1999 inhibitor group （T24 cells + UNC1999 5 μM + GC）, EI1 inhibitor group （T24 cells + EI1 5 μM + GC）, DZNep1 inhibitor group （T24 cells + DZNep1 5 μM + GC）, and EPZ005687 inhibitor group （T24 cells + EPZ005687 5 μM + GC）. CCK-8, plate clone formation, Annexin/PI, and other experiments were used to detect the proliferation rate, apoptosis rate, and the effect on the cell cycle of the eight groups of cells respectively. Then, 30 female BALB/C nude mice were randomly divided into control group （bladder cancer T24 cells cultured normally）, T24 cells + EZH2 inhibitor solvent buffer group, T24 cells + GC chemotherapy group, T24 cells + UNC1999 EZH2 inhibitor group, and T24 cells + UNC1999 EZH2 inhibitor + GC chemotherapy group, with 6 mice in each group. Tumor formation experiment in nude mice was used to detect the growth of transplanted tumors in each group after transfection, immunohistochemistry was used to observe the expression of Ki67 and EZH2 in the transplanted tumor tissues, and blood routine examination was used to detect the number of white blood cells, red blood cells, and platelets and the degree of bone marrow suppression in nude mice. Results In T24 cells transfected with siRNA plasmids, siEZH2-1 and siEZH2-2 showed statistically significant differences in siRNA and protein expression levels compared to the control group （P < 0.01）. Compared to the control group, the above experimental groups found that EZH2 inhibitors can inhibit the proliferation, migration, and invasion ability of T24 cells, and increase the proportion of early apoptotic cells through CCK-8, plate cloning, and Annexin V/PI double staining, and Pi single staining experiments （ P < 0.01）. Among them, in the plate cloning experiment, the difference in the number of cell clones between the experimental group T24 cells+EPZ005687 5 μM+GC chemotherapy drug group and the control group was statistically significant （ P < 0.05）. In vivo experiments in mice showed that the tumor weight of nude mice treated with GC chemotherapy drugs or EZH2 inhibitors decreased compared to the control group （ P < 0.05）, and the blood cell content also increased in the blood routine examination. Conclusion EZH2 inhibitors can enhance the sensitivity of bladder cancer GC chemotherapy regimen, thereby reducing the proliferation, migration, and growth of bladder cancer cells in nude mice xenografts. Additionally, combination therapy can significantly reduce bone marrow suppression. These findings suggest that combination therapy plays a role in sensitizing bladder cancer chemotherapy. -
慢性阻塞性肺疾病急性加重（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）是COPD患者病程变化中一个重要的临床分期，常以严重的呼吸系统症状为特征，是COPD患者肺功能进一步的恶化、生活质量降低和死亡的主要原因之一[1]。再入院是指前次住院诊疗结束，患者在出院后无法预测的再次入院，且患者再次入院的原因是相同或相关的疾病[2]。据研究表明，AECOPD患者30 d内的再入院率为24%，90 d内的再入院率为35.1%～43%[3]，AECOPD患者发生再次入院的风险较高，且AECOPD患者再次入院对其生理、心理、生活质量等方面均产生消极影响，同时伴有严重的经济负担。目前关于AECOPD患者再入院的研究多为影响因素研究，患者年龄、文化水平、既往住院史、共病个数等因素均为AECOPD患者再入院的影响因素[4]；但目前尚未形成完整、全面、通用的评估工具来预测AECOPD患者再次入院。故本研究采用病例回顾性研究方法，构建AECOPD患者再入院疾病风险预测模型，为早期识别并筛选AECOPD再入院高风险患者提供评估工具，为延长再入院间隔时间、降低AECOPD患者致死率及致残率、医护人员调整高风险患者的治疗和护理提供参考依据。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
选取云南省某三甲医院2016年1月1日至2021年1月1日诊断为AECOPD且符合纳入、排除标准的414例患者为研究对象，随机选取其中307例（70%）患者作为建模组，根据患者是否再入院分为再入院组102例和非再入院组205例，剩余的107例（30%）患者作为验证组。
纳入标准[5-6]：（1）首要诊断为AECOPD；（2）住院时间 > = 24 h；（3）经住院治疗后好转出院。排除标准：（1）患者再次入院的原因不是COPD或AECOPD；（2）患者病历资料记录不完全；（3）患者因病情严重而死亡或未愈且自动退院；（4）患者在住院期间合并严重并发症，并转科治疗；（5）患者再次入院的地点不是首次入院的医院。
本研究共纳入414例研究对象，其中再入院患者有139例，非再入院患者有275例，其再入院率为33.6%。男性患者351例（84.8%），女性患者63例（15.2%）；平均年龄为（68.52±9.344）岁；首次平均住院时长为（10.12±3.601）d；平均COPD病程为（9.63±9.132）a；体重指数平均值为（22.06±4.043）；文化程度多为小学110例（26.6%）及初中130例（31.8%）；其中吸烟史有285例（68.8%）。
1.2 研究方法
1.2.1 病例资料调查表
通过文献查阅初步制定病例资料调查表，在与3名呼吸内科的副主任医师及5名从事10 a以上呼吸内科临床护理工作主管及以上的护士共同进行专家小组会议对初步制定的病例资料调查表的可行性及科学性进行充分讨论，最终确定其内容包括：（1）社会人口学资料：性别、年龄、文化程度、COPD病程、是否为少数民族、BMI、吸烟史、饮酒史、粉尘接触史、体力劳动史，首次住院时间等；（2）患者入院时的观察指标：入院时未吸氧下的氧饱和度、二氧化碳分压、氧分压、氧合指数等；（3）实验室检查结果：血常规、痰培养是否伴真菌感染、凝血功能等；（4）治疗因素：鼻导管吸氧浓度、是否使用无创机械通气、是否使用雾化激素药物及种类数、是否使用抗生素及种类数、是否使用面罩给氧等；（5）患者既往病史：是否合并高血压、糖尿病、支气管扩张等合并症，是否并发呼吸衰竭、肺心病等；（6）肺功能检查结果：FEV1预计值、FEV1/FVC预计值、FEF25预计值、FEF50预计值、FEF75预计值、MMEF75/25预计值、FEV1实测值、FEV1/FVC实测值、FEF25实测值、FEF50实测值、FEF75实测值、MMEF75/25实测值等。
1.2.2 资料收集方法与质量控制
利用医院的电子病例系统，根据前期设计好的病例资料调查表进行数据的收集，由2名研究者进行数据的收集，收集过程中严格按照纳入排除标准进行，病例数据收集完成后进行数据的核对与录入，最后用SPSS26.0版本进行数据的统计与分析。
1.3 统计学处理
采用 SPSS26.0 进行统计学分析，符合正态分布的连续变量用均数±标准差（ $ \bar x \pm s $）表示，不符合正态分布的连续变量用中位数和四分位数（median 和 IQR）表示，计数资料以频数、百分比表示。计量资料组间比较，如果服从正态分布采用 t 检验、不服从正态分布采用 Mann-Whitney U 秩和检验，计数资料组间比较，采用卡方检验，以P < 0.05为差异具有统计学意义，根据二元Logistic回归构建疾病风险预测模型，以受试者操作特征曲线下面积（AUC）来判断模型的预测效能。
2. 结果
2.1 AECOPD患者发生再入院的单因素分析
将307例AECOPD患者分为再入院组（n = 102）和非再入院组（n = 205 ）进行单因素分析；其中年龄、文化程度、FEV1/FVC预计值、雾化吸入激素种类、戒烟时长、鼻导管吸入氧气浓度、COPD病程、并发症个数、入院时二氧化碳分压、FEF25预计值、FEF75预计值、FEV1实际值、FEV1/FVC实际值、FEF25实际值、FEF50实际值、MMEF75/25实际值、是否体力劳动、是否鼻导管吸氧、是否伴有呼吸衰竭、是否并发肺心病共20个因素，差异具有统计学意义（P < 0.05），见 表1。
表 1 AECOPD患者再入院单因素分析（ $ \bar x \pm s $）Table 1. Single Factor analysis of patient readmission in AECOPD （ $ \bar x \pm s $）变量 均数 ± 标准差
χ2/t P 变量 分组 再入院组
（n = 102）非再入院组
（n = 205）χ2/t P 年龄（岁） 68.48 ± 9.553 2.877 0.004* 体力劳动 是 24 78 5.314 0.021* FEV1/FVC
预计值（%）75.45 ± 5.00 −2.227 0.027* 否 75 130 吸入雾化
激素种类（种）1.07 ± 0.54 −2.909 0.004* 鼻导管吸氧 是 82 20 11.17 0.001* 戒烟时长（a） 1.42 ± 5.044 9406 0.025* 否 126 79 鼻导管吸入
氧浓度（L/min）1.66 ± 1.251 8232.5 0.001* 呼吸衰竭 是 61 41 13.618 < 0.001 * COPD病程（a） 9.50 ± 8.66 7950 0.001* − 否 77 128 并发症个数（个） 1.18 ± 1.061 8526 0.006* 肺心病 是 37 65 6.105 0.013* 入院时二氧化碳
分压（mmHg）41.34 ± 19.94 8807 0.024* 否 47 158 FEF25预计值（L/min） 5.81 ± 1.81 13383.5 < 0.001 * 文化程度 文盲 13 27 17.37 0.002* FEF75预计值（L/min） 1.73 ± 1.83 7716 < 0.001 * 小学 16 67 FEV1实际值（L/min） 1.38 ± 0.64 13146 < 0.001 * 初中 39 53 FEV1/FVC实际值（%） 52.9 ± 21.2 12051 0.029* 高中 10 32 FEF25实际值（L/min） 1.79 ± 1.55 14665 < 0.001 * 大专及以上 24 26 FEF50实际值（L/min） 0.82 ± 0.62 12796 0.001* − − − − − − MMEF75/25实际值（L/min） 0.63 ± 0.57 13498 < 0.001 * − − − − − − *P < 0.05。 2.2 AECOPD患者发生再入院的多因素分析
在进行Logistic回归分析前将上述具有统计学差异的因素进行多重共线性的检验，根据Kleinbaum DG的容忍值 < 0.10，方差膨胀因子 > 10.0 即达到“多重共线性”的标准 [7]，纳入的各变量间均没有多重共线性。将上述单因素分析具有统计学意义的20个因素纳入Logistic回归中，采用逐步向前法，以α入为0.05，α出为0.05进行回归分析，其结果表明年龄、雾化吸入激素种类、FEF75预计值、FEV1实际值、是否伴有呼吸衰竭为AECOPD患者非计划性再入院的独立影响因素，见表2。
表 2 AECOPD患者再入院Logistic回归分析Table 2. Logistic regression analysis of patient readmissions in AECOPD变量 B值 标准误 Wald χ2 P OR 95% CI 常数 3.361 1.325 6.434 0.011* 28.83 − 年龄 −0.043 0.016 6.721 0.01* 0.958 0.928～0.99 吸入雾化激素种类 0.638 0.282 5.111 0.024* 1.893 1.089～3.291 FEF75预计值 −0.539 0.116 21.439 < 0.001 * 0.583 0.464～0.733 FEV1实际值 0.666 0.267 6.229 0.013* 1.947 1.154～3.285 是否伴有呼吸衰竭 −0.691 0.294 5.519 0.019* 0.501 0.282～0.892 *P < 0.05。 2.3 AECOPD患者再入院风险预测模型的构建
根据预测模型公式制订AECOPD患者非计划性再入院风险预测模型：P = 1/{1 + exp［−（3.361 + （−0.043）×年龄 + 0.638×吸入雾化激素种类 + （−0.539）×FEF75预计值 + 0.666 ×FEV1实际值 + （−0.691）×呼吸衰竭）］}，其中伴有呼吸衰竭赋值为0，不伴呼吸衰竭赋值为1。采用受试者特征工作曲线下面积（AUC）来衡量模型的区分度，以约登指数最大值判断模型的最佳临界值。本模型受试者特征工作曲线下面积为0.777，其灵敏度和特异度分别为0.898和0.549，见图1。
图 1 预测模型在建模组中的ROC曲线Figure 1. Predict the ROC curve of the model in the modeling group2.4 AECOPD患者再入院风险预测模型的效能验证
将剩余的107例患者作为研究对象，对模型进行验证。其中男性患者87例 （81.3% ）， 女性患者20例 （18.7% ）；平均年龄（68.64±8.758）岁。 实际发生再入院的有37例，发生率为34.6%。验证组受试者特征工作曲线下面积（AUC）为0.821，其灵敏度和特异度分别为0.857和0.7，见图2。
图 2 预测模型在验证组中的ROC曲线Figure 2. Predict the ROC curve of the model in the validation group3. 讨论
3.1 AECOPD患者再次入院的发生率较高
本研究结果显示，AECOPD患者再入院率为33.6%，而美国、台湾和澳大利亚的研究表明COPD患者30d内的再入院率分别为7%、16.7%和25%[8-10]，在英国COPD再入院率为32.2%[11]，各地区间存在着较大的差异，目前关于AECOPD患者再入院的研究较少。据国内学者张瑞等[12]研究表明，COPD患者急性加重期再入院率为21.5%，与本研究结果存在差异，这可能与纳入研究人群有关，本研究纳入的人群为AECOPD患者，而其再入院的原因是COPD或AECOPD；AECOPD患者的肺功能损害较为严重且常伴有细菌及病毒的感染，可能增加了其发生再次入院的风险[13]。AECOPD患者经治疗好转出院后，咳嗽、咳痰症状有明显缓解，但肺功能已出现不可逆进行性下降，是AECOPD患者死亡的主要原因之一，故减少COPD患者急性加重期的发生是患者治疗过程中的关键环节，识别并预防AECOPD的发生，对改善患者肺功能、提高患者生活质量、 缓解患者痛苦、减少家庭社会负担、提高护理服务质量具有重要意义[14]。
3.2 AECOPD患者再入院预测模型影响因素分析
3.2.1 高龄易引发AECOPD患者发生再入院
本研究结果显示患者年龄越大，其再次入院的风险越高。据研究表明，随着年龄的不断增长、机体功能的降低、免疫防御机制的衰弱、咳嗽反射能力减弱、多种慢病共存等原因导致老年人成为非计划性再入院的高危人群[15-16]；且此类患者患病时间较长，病情迁延反复，易造成患者心理负担，不利于疾病的预后。COPD常见患病人群多为老年人，但由于现代年轻人生活方式的转变、居住环境的改变等原因，患病人群逐渐趋于年轻化；在关注老年慢病共病问题的同时也应积极预防慢病年轻化的趋势。
3.2.2 首次住院时使用激素类药物雾化吸入可有效降低AECOPD患者再入院的发生
糖皮质激素的应用在COPD治疗中具有重要作用，应根据COPD急性加重异质性，选择糖皮质激素给药途径、剂量和疗程[17]。全身使用糖皮质激素会对患者产生诸多不良反应，例如高血压、消化性溃疡、机会性感染、激素停用后的反跳现象等，雾化吸入糖皮质激素与静脉应用糖皮质激素在改善患者肺功能等方面效果相当，且具有副作用小、安全性强、方便、价格低廉等特点[18]，因此，激素类药物雾化吸入是COPD治疗过程中常见的治疗方法。雾化吸入糖皮质激素可改善小气道的痉挛状态，降低气道阻力，改善呼吸功能[19]。临床上首选布地奈德混悬液联合异丙托溴铵等支气管舒张剂缓解气流受限的症状[20]，据研究表明布地奈德混悬液其抗感染效力是丙酸倍氯米松的2倍，据有显著的局部抗感染效果[21]。
3.2.3 AECOPD合并呼吸衰竭的患者易发生再次入院
本研究结果显示，AECOPD合并呼吸衰竭患者发生再入院的风险较不合并呼吸衰竭的要高。据研究表明，约20%的COPD患者由于呼吸肌功能受损和呼吸中枢调控能力异常，而存在或可能进展为Ⅱ型呼吸衰竭[22]，而无创通气治疗被认为是有效降低合并呼吸衰竭的COPD患者死亡率的治疗措施之一[23-24]，在COPD患者入院时应尽快进行血气分析，以筛查患者是否合并呼吸衰竭，确诊后应尽早进行无创通气等治疗手段的早期干预，以提高COPD急性加重期的存活率，防止肺功能的恶化，减少患者再次入院的发生[25-26]。而家庭无创通气治疗对于伴有持续性高碳酸血症的患者来说，可以有效的降低其死亡率和再入院率[26]。这提示护理人员对COPD患者健康教育内容应包括家庭无创通气治疗的重要性，且如何对呼吸衰竭等并发症进行早期识别，并告知患者定期随访，及早就医的重要性。
3.2.4 肺功能对AECOPD患者发生再入院的影响
本研究结果显示FEF75预计值越高、FEV1实际值越小，AECOPD患者发生再入院的风险越大。肺功能检查是疾病诊断、气流受限程度、治疗效果判断、疾病预后及防控管理的关键指标[27]。AECOPD患者由于病情的加重其肺功能大部分已经达到中重度损害，进而导致其住院频率及死亡风险的增加。在这种情况下，应根据GOLD2020指南[28]的推荐在有症状和（或）有危险因素的人群中早期开展肺功能检查。FEV1实际值越小提示肺功能受损越严重，FEF75预计值越大提示小气道阻塞程度越大，气流受限越严重；均表明肺功能的进一步恶化，同时增加患者再入院的风险。据国外研究表明，慢阻肺患者每日监测呼气峰值流量（peak expiratory flow，PEF）有助于早期识别慢阻肺急性加重的发生[29]。可将PEF监测纳入慢阻肺患者的居家管理中，来早期识别急性加重期的发生，阻止肺功能的恶化。
3.3 AECOPD患者再入院风险预测模型预测效能较好
从模型的区分度来看，受试者特征工作曲线下面积（AUC）作为一种评估模型优劣的指标，其值在0.7～0.9，表示预测效能中等[30]，该模型内部验证的受试者特征工作曲线下面积为0.777，特异度为54.9%，灵敏度为89.8%，表明该风险预测模型具有较好的区分度，能有效区分发生再入院的高风险人群和低风险人群。将本预测模型进行外部验证，结果显示受试者特征工作曲线下面积为 0.821，灵敏度为85.7%，特异度为70%。本研究所构建的慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者非计划性再入院风险预测模型具有良好的预测效果，可为再入院风险评估与临床防治工作提供评估工具。由于 C 反应蛋白、降钙素原、家庭无创呼吸机的使用等因素非调查医院常规检查项目，故本研究可能导致影响因子存在一定程度上的缺失和完善。
本研究发现，年龄、雾化吸入激素种类、FEF75预计值、FEV1实际值、合并呼吸衰竭等因素，可增加AECOPD患者再入院的风险。 本研究所构建的AECOPD患者再入院预测模型具有良好的预测效能，为早期识别并筛选高风险患者提供了评估工具，并为医护人员调整高风险患者的治疗和护理措施提供了参考依据，为减少患者再次入院、提高生存质量、加强COPD的防治及节省护理资源提供指导性意见。
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图 2 5组膀胱癌T24细胞中EZH2的蛋白相对表达量分析
A～B：各组EZH2相关蛋白表达。与对照组比较，**P < 0.01。
Figure 2. Analysis of relative protein expression of EZH2 in five groups of bladder cancer T24 cells
图 3 CCK-8 实验检测24 h与48 h EZH2抑制剂对膀胱癌T24细胞增殖的影响
A：CCK-8实验24 h UCC细胞活力百分比；B：CCK-8实验48 h UCC细胞活力百分比 。与T24细胞正常培养比较，**P < 0.01；与T24细胞 + GC化疗药物组比较，**P < 0.01。
Figure 3. CCK-8 assay to detect the effect of 24 h and 48 h EZH2 inhibitors on the proliferation of bladder cancer T24 cells
图 4 平板克隆形成实验检测使用EZH2抑制剂对膀胱癌T24细胞增殖的影响
A：对照组与7组实验组平板克隆形成实验；B：细胞克隆数统计图。T24细胞 + DZNep1 5 μM + GC化疗药物组与T24细胞正常培养比较，**P < 0.01；T24细胞 + EPZ005687 5 μM + GC化疗药物组与T24细胞正常培养比较，*P < 0.05。
Figure 4. Effect of using EZH2 inhibitor on the proliferation of bladder cancer T24 cells detected by plate clone formation assay
图 5 PI单染试验检测EZH2抑制剂对膀胱癌T24细胞其细胞周期的影响
A：对照组与7组实验组细胞周期；B：细胞周期百分比；C：对照组、GC化疗组与UNC1999组统计图。与T24细胞正常培养比较，**P < 0.01；与T24细胞 + GC化疗药物比较，**P < 0.01。
Figure 5. Effect of EZH2 inhibitor on bladder cancer T24 cells and their cell cycle detected by PI single staining assay
图 6 Annexin V/PI 实验检测EZH2抑制剂对GC化疗中的膀胱癌T24细胞凋亡的影响
A：对照组与7组实验组细胞凋亡； B：细胞早期凋亡比例统计图。与T24细胞正常培养比较，**P < 0.01；与T24细胞 + GC化疗药物比较，**P < 0.01。
Figure 6. Annexin V/PI assay to detect the effect of EZH2 inhibitor on apoptosis of bladder cancer T24 cells in GC chemotherapy
图 7 EZH2抑制剂对小鼠体内T24细胞移植瘤生长的影响
A：各组小鼠2周与4周小鼠移植瘤图片；B：各组2周与4周移植瘤重量；C：免疫组化染色法观察肿瘤组织2周与4周EZH2、Ki67表达（比例尺：50 μm×200）；D：5组实验组的裸小鼠2周与4周血常规检测结果。与T24细胞 + GC化疗组相比，*P < 0.05。
Figure 7. Effect of EZH2 inhibitors on the growth of T24 cell transplanted tumours in mice
表 1 EZH2 引物序列
Table 1. Primer sequences of EZH2
基因名称 序列 （5′→3′） 长度（bp） GAPDH（H）-F TTGCCCTCAACGACCACTTT 120 GAPDH（H）-R TGGTCCAGGGGTCTTACTCC 120 EZH2（H）-F AAGAAGAAGAAGAGAAGAA 161 EZH2（H）-R ATAGTAAGTGCCAATGAG 161 F：上游引物、正向；R：下游引物、反向。 
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