miR-148a-3p Targeting SMURF2 in Regulating Osteogenic Differentiation and Enamel Development during In Vitro Tooth Organogenesis
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摘要:
目的 探讨miR-148a-3p在体外牙齿发生中成骨分化和牙釉质发育中的作用，揭示其分子机制。 方法 获取人牙髓干细胞和口腔上皮细胞。将人牙髓干细胞转染miR-148a-3p mimics、miR-148a-3p抑制剂或阴性对照。通过在Matrigel基质凝胶上接种人牙髓干细胞并覆盖口腔上皮细胞，建立三维共培养系统。采用MTT实验评估miR-148a-3p对共培养细胞增殖和蛋白表达的影响，采用Western blotting实验检测成骨细胞分化（RUNX2）和牙釉质发育标志物（E-cadherin）蛋白表达水平，采用荧光素酶报告实验验证SMURF2（SMAD 特异性 E3泛素蛋白连接酶2）与miR-148a-3p的相互作用。 结果 在人牙髓干细胞中使用抑制剂下调miR-148a-3p后，3D共培养中的细胞活力降低（P < 0.05）。使用模拟物上调miR-148a-3p后，共培养中成骨标志物RUNX2和牙釉质发育标志物E-cadherin的表达增加 （P < 0.05）。TargetScan软件预测miR-148a-3p在SMURF2的3'-UTR中有结合位点。荧光素酶报告实验表明miR-148a-3p mimics抑制野生型载体的荧光素酶活性（P < 0.05），同时 Western blot 结果显示miR-148a-3p mimics下调SMURF2的表达（P < 0.05）。 结论 miR-148a-3p可能通过靶向SMURF2，调控RUNX2和E-cadherin的表达，参与了人牙髓干细胞成骨分化和上皮细胞牙釉质发育。为牙齿修复和治疗提供了潜在的治疗靶点。 -
关键词:
- miR-148a-3p /
- 牙源性间充质干细胞 /
- 成骨分化 /
- 牙釉质发育 /
- SMURF2
Abstract:Objective To explore the role of miR-148a-3p in osteogenic differentiation and enamel development during in vitro tooth organogenesis and uncover its underlying molecular mechanism. Methods Human dental pulp stem cells and oral epithelial cells were obtained. Human dental pulp stem cells were transfected with miR-148a-3p mimics, miR-148a-3p inhibitors, or a negative control. A three-dimensional co-culture system was established by seeding human dental pulp stem cells onto the Matrigel matrix and overlaying them with oral epithelial cells. The impact of miR-148a-3p on cell proliferation and protein expression was assessed using MTT assay. The expression levels of osteogenic marker RUNX2 and enamel development marker E-cadherin were determined through Western blotting. The interaction between SMURF2（SMAD-specific E3 ubiquitin-protein ligase 2） and miR-148a-3p was validated via a luciferase reporter assay. Results Downregulation of miR-148a-3p using its inhibitor in human dental pulp stem cells led to reduced cell viability in the 3D co-culture system（P < 0.05）. Conversely, upregulation of miR-148a-3p using its mimic increased the expression of osteogenic marker RUNX2 and enamel development marker E-cadherin in the co-culture setting（P < 0.05）. TargetScan software predicted a binding site for miR-148a-3p within the 3’ -UTR of SMURF2. Luciferase report Experiments showed that miR-148a-3p mimics significantly inhibited the luciferase activity of wild-type（P < 0.05）, while Western blot results showed that miR-148a-3p mimics significantly down-regulated the expression of SMURF2（P < 0.05）. Conclusion The research findings suggest that miR-148a-3p potentially regulates the expression of RUNX2 and E-cadherin by targeting SMURF2, thereby participating in osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells and enamel development in oral epithelial cells during in vitro tooth organogenesis. This study provides promising therapeutic targets for dental repair and treatment. -
Key words:
- MiR-148a-3p /
- Dental pulp stem cells /
- Osteogenic differentiation /
- Enamel development /
- SMURF2
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青少年抑郁症状检出率较高，是自杀行为的重要预测因素。我国5省中学生抑郁情绪检出率为19.70%[1]，且有研究发现，近30 a我国青少年抑郁水平逐年上升[2]，青少年抑郁症状将成为中国重大的公共卫生挑战。由于中学生身心发展尚不成熟，易受家庭氛围、人际关系、学业压力等因素影响，更可能产生抑郁症状[3]。抑郁症状可能导致中学生学业失败、酗酒、药物滥用、自我伤害、自杀等行为问题的风险增加[4−5]。且青春期的抑郁症状是成年后抑郁发作的危险因素。有研究发现，存在不良饮食习惯、吸烟、网络成瘾等不健康生活行为方式的青少年更可能有抑郁症状[6−7]。同时，坚持健康的生活方式与抑郁症状负相关[8]。目前大量的研究关注了青少年抑郁症状，但鲜有研究关注云南边远多民族地区青少年抑郁症状。本研究在云南屏边苗族地区开展问卷调查，分析苗族地区农村中学生生活行为方式与抑郁症状的关联，为中学开展抑郁症状防控提供理论依据。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
于2023年7月，采用随机整群抽样方法，抽取云南省红河州屏边苗族自治县2所中学（第二中学和第五中学）的学生进行问卷调查。纳入标准：学校、监护人及中学生知情同意，自愿参与调查；问卷无逻辑错误和关键变量无缺失。排除标准：监护人或中学生知情不同意参与本调查、问卷有逻辑错误和关键变量缺失。共调查819名中学生，纳入分析有效问卷819份，有效回收率100%。其中，初一学生415人（50.67%），初二学生404人（49.33%）；男生393人（47.99%），女生426人（52.01%）；苗族544人（66.42%），其他民族275人（33.58%）；居住在农村802人（97.92%），居住在城镇17人（2.08%）。年龄12～18岁，平均年龄（13.90±0.82）岁。
1.2 研究方法
1.2.1 人口学变量
包括性别、民族、家庭居住地、独生子女、家庭类型、家庭经济条件、父/母文亲化程度、父/母亲职业、学习压力、家庭变故、住院经历、抑郁症家族史。
1.2.2 生活行为方式
调查中学生最近1个月学习日/休息日视屏时间、户外活动、吸烟、饮酒情况；最近1个月快餐（西式/中式/外卖快餐）、新鲜食物（新鲜水果蔬菜/肉类/牛奶）、腌制食品（腌制肉/菜）、饮料、甜食、零食、烧烤、罐头和奶酪等食物的消费情况；最近1周吃早餐/夜宵情况。视屏时间指看电视、使用手机、电脑（台式电脑、笔记本、平板等）、电子游戏机及其他设备的时间。户外活动指跑步、骑行、登山、打球等在室外进行的体育活动。
1.2.3 抑郁症状评估
使用简体中文版抑郁-焦虑-压力量表（depression anxiety stress scale，DASS-21）的抑郁分量表进行中学生抑郁症状筛查。采用4级计分，0（不符合）～4分（总是符合），7项抑郁条目得分之和×2为该分量表得分。评估结果分为5种情况：无抑郁（0～9分）、轻度抑郁（10～13分）、中度抑郁（14～20分）、重度抑郁（21～27分）、极重度抑郁（≥28分）。本研究中，将得分0～9分的中学生评估为无抑郁症状，得分≥10分的中学生评估为有抑郁症状。抑郁分量表在中国人群中测试Cronbach α系数为0.89[9]，本研究中Cronbach α系数为0.85，信效度较好。
1.3 问卷调查及质量控制
使用课题组自编的饮食行为调查问卷，Cronbach α系数为0.81。以班级为单位，将中学生集中在教室进行现场调查，经过统一培训的调查员向学生说明调查目的及相关注意事项后，学生独立填写纸质版问卷，调查员在现场随时解决学生提出来的问题。回收问卷后调查员立即审核，剔除不合格问卷。本次调查遵循匿名、自愿原则，获得学校、监护人和中学生的知情同意。本研究通过昆明学院医学院医学伦理委员会审批（批号：20210222）。
1.4 统计学处理
使用EpiData3.1建立数据库，并进行数据库核查。导入SPSS23.0对数据进行统计分析。使用$ {\chi }^{2} $检验比较不同人口学特征中学生抑郁症状检出率，使用广义线性模型分析生活行为方式与抑郁症状的关联。广义线性模型按性别分层分析，建立2个模型，模型1不控制变量，模型2控制性别、民族、家庭居住地等人口学变量以及可能影响抑郁症状的其他变量。检验水准α=0.05。
2. 结果
2.1 不同人口统计学特征中学生抑郁症状检出率比较
屏边苗族地区中学生检出抑郁症状的有272人，检出率为33.21%。不同性别（χ2=14.363，P < 0.05）、家庭类型（χ2=23.080，P < 0.05）、家庭经济条件（χ2=11.090，P < 0.05）、学习压力（χ2=31.817，P < 0.05）、抑郁症家族史（χ2=22.146，P < 0.05）组间中学生抑郁症状检出率差异有统计学意义；而民族、家庭居住地、独生子女、父/母文化程度、父/母职业、家庭变故、住院经历组间中学生抑郁症状检出率差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。
表 1 不同人口学特征中学生抑郁症状检出率比较 [n（%）]Table 1. Comparison of the detection rate of depressive symptoms in middle school students with different demographic characteristics [n（%）]人口统计学指标 选项 无抑郁症状 抑郁症状 χ2 P 年龄（岁） 12 9（75.00） 3（25.00） 1.256 0.869 13 175（68.36） 81（31.64） 14 247（66.22） 126（33.78） 15 106（65.84） 55（34.16） ≥16 10（58.82） 7（41.18） 性别 男 288（73.28） 105（26.72） 14.363 <0.001** 女 259（60.80） 167（39.20） 民族 苗族 359（65.99） 185（34.01） 0.463 0.496 其他民族 188（68.36） 87（31.64） 家庭居住地 农村 537（66.96） 265（33.04） 0.497 0.481 城镇 10（58.82） 7（41.18） 独生子女 是 38（60.32） 25（39.68） 1.289 0.256 否 509（67.33） 247（32.67） 家庭类型 双亲家庭a 431（68.63） 197（31.37） 23.080 <0.001** 单亲家庭 59（67.82） 28（32.18） 组合家庭b 50（65.79） 26（34.21） 其他 7（25.00） 21（75.00） 家庭经济条件 差 10（55.56） 8（44.44） 11.090 0.026* 较差 49（53.26） 43（46.74） 中等 395（69.06） 177（30.94） 较好 75（70.09） 32（29.91） 好 18（60.00） 12（40.00） 父亲文化程度 文盲 117（65.00） 63（35.00） 7.025 0.135 小学毕业 192（70.85） 79（29.15） 初中 199（62.78） 118（37.22） 高中/中专 35（77.78） 10（22.22） 大专及以上 4（66.67） 2（33.33） 母亲文化程度 文盲 220（66.07） 113（33.93） 1.595 0.810 小学毕业 171（66.02） 88（33.98） 初中 135（69.59） 59（30.41） 高中/中专 18（66.67） 9（33.33） 大专及以上 3（50.00） 3（50.00） 父亲职业 农民 397（68.80） 180（31.20） 4.617 0.329 公职人员c 8（57.14） 6（42.86） 工人 107（61.49） 67（38.51） 商人 11（73.33） 4（26.67） 其他 24（61.54） 15（38.46） 母亲职业 农民 407（67.72） 194（32.28） 4.333 0.363 公职人员c 3（37.50） 5（62.50） 工人 93（65.03） 50（34.97） 商人 14（73.68） 5（26.32） 其他 30（62.50） 18（37.50） 学习压力 很重 43（44.79） 53（55.21） 31.817 <0.001** 重 158（62.95） 93（37.05） 一般 326（73.09） 120（26.91） 轻 17（77.27） 5（22.73） 很轻 3（75.00） 1（25.00） 家庭变故 是 105（60.69） 68（39.31） 3.673 0.055 否 442（68.42） 204（31.58） 住院经历 是 219（63.66） 125（36.34） 2.613 0.106 否 328（69.05） 147（30.95） 抑郁症家族史 是 4（19.05） 17（80.95） 22.146 <0.001** 否 543（68.05） 255（31.95） 注：（）内数字为检出率/%。a指均为生父母，b指有继父或继母，c指公务员及事业单位人员；*P < 0.05 ，**P < 0.01。 2.2 中学生生活行为方式与抑郁症状的关联
以抑郁症状评分为因变量，以生活行为方式为自变量进行广义线性模型分析。结果显示，在控制混杂因素后（模型2），最近1个月学习日视屏时间、白天户外活动时间、新鲜食物（新鲜水果蔬菜/肉类/牛奶）消费、零食消费、最近1周早餐行为均与中学生抑郁症状关联（P值均<0.05），β值（95%CI）分别为0.283（0.114～0.452）、-0.292（-0.512～-0.071）、-0.291（-0.529～-0.053）、0.294（0.019～0.569）、-0.263（-0.455～-0.071）。按性别分层分析结果显示，最近1个月学习日视屏时间、白天户外活动时间、新鲜食物（新鲜水果蔬菜/肉类/牛奶）消费、最近1周早餐行为与男生抑郁症状关联（P值均<0.05），β值（95%CI）分别为0.297（0.074～0.520）、-0.369（-0.673～-0.065）、-0.423（-0.735～-0.110）、-0.288（-0.567～-0.010）；最近1个月学习日视屏时间、抽烟、西式快餐消费、最近1周早餐行为与女生抑郁症状关联（P值均<0.05），β值（95%CI）分别为0.306（0.056～0.557）、0.679（0.044～1.314）、-1.278（-2.425～-0.131）、-0.304（-0.576～-0.031）。见表2、表3。
表 2 中学生生活行为方式与抑郁症状的关联（n=819）Table 2. Association between lifestyle behaviors and depressive symptoms among middle school students （n=819）模型 生活行为 标准误 Wald $ {\chi }^{2} $ P β（95%CI） 模型1 学习日视屏时间 0.090 10.807 0.001** 0.294（0.119～0.470） 休息日视屏时间 0.099 0.362 0.548 0.059（−0.134～0.252） 白天户外活动时间 0.117 6.728 0.009** −0.304（−0.534～−0.074） 抽烟支数 0.235 0.872 0.351 0.220（−0.242～0.681） 喝酒杯数 0.251 5.035 0.025* 0.563（0.071～1.055） 吃早餐天数 0.101 13.039 <0.001** −0.364（−0.561～−0.166） 吃夜宵天数 0.130 5.455 0.020* 0.304（0.049～0.560） 西式快餐 0.332 0.946 0.331 −0.323（−0.973～0.327） 中式快餐 0.203 0.09 0.764 −0.061（−0.458～0.336） 外卖快餐 0.334 0.002 0.961 −0.016（−0.670～0.638） 腌制肉 0.171 0.08 0.777 −0.049（−0.384～0.287） 新鲜水果蔬菜/肉类/牛奶 0.128 9.054 0.003** −0.384（−0.634～−0.134） 罐头、面包、奶酪 0.130 0.584 0.445 0.099（−0.155～0.354） 饮料 0.155 0.537 0.464 −0.114（−0.418～0.190） 甜食 0.149 6.478 0.011* 0.380（0.087～0.673） 零食 0.149 2.46 0.117 0.234（−0.058～0.527） 腌制菜 0.155 0.068 0.794 −0.041（−0.345～0.264） 烧烤 0.163 0.255 0.614 0.082（−0.236～0.400） 模型2 学习日视屏时间 0.086 10.726 0.001** 0.283（0.114～0.452） 休息日视屏时间 0.096 0.206 0.650 0.044（−0.145～0.232） 白天户外活动时间 0.112 6.733 0.009** −0.292（−0.512～−0.071） 抽烟支数 0.228 1.133 0.287 0.243（−0.204～0.690） 喝酒杯数 0.244 1.345 0.246 0.283（−0.195～0.762） 吃早餐天数 0.098 7.215 0.007** −0.263（−0.455～−0.071） 吃夜宵天数 0.123 3.523 0.061 0.232（−0.010～0.473） 西式快餐 0.325 0.188 0.665 −0.141（−0.778～0.496） 中式快餐 0.193 0.332 0.564 −0.111（−0.490～0.267） 外卖快餐 0.329 0.053 0.817 −0.076（−0.721～0.569） 腌制肉 0.164 0.894 0.344 −0.155（−0.475～0.166） 新鲜水果蔬菜/肉类/牛奶 0.122 5.721 0.017* −0.291（−0.529～−0.053） 罐头、面包、奶酪 0.123 0.178 0.673 0.052（−0.189～0.293） 饮料 0.149 0.185 0.668 −0.064（−0.355～0.227） 甜食 0.144 2.413 0.120 0.223（−0.058～0.504） 零食 0.140 4.402 0.036* 0.294（0.019～0.569） 腌制菜 0.148 0.008 0.929 −0.013（−0.303～0.277） 烧烤 0.154 1.999 0.157 0.218（−0.084～0.519） 注：模型1未控制变量，模型2控制民族、家庭居住地、是否独生子女、家庭类型、家庭经济条件、父/母文化程度、父/母职业、学习压力、家庭变故、住院经历、抑郁症家族史；*P < 0.05 ，**P < 0.01。 表 3 中学生生活行为方式与抑郁症状的分性别分析（n=819）（1）Table 3. Gender analysis of lifestyle behaviors and depressive symptoms in middle school students （n=819）（1）模型 分层 生活行为 标准误 Wald $ {\chi }^{2} $ P β（95%CI） 模型1 男生 学习日视屏时间 0.116 6.601 0.010* 0.298（0.071～0.525） 休息日视屏时间 0.134 0.086 0.769 0.039（−0.222～0.301） 白天户外活动时间 0.160 6.570 0.010* −0.409（−0.722～−0.096） 抽烟支数 0.328 0.816 0.366 −0.296（−0.938～0.346） 喝酒杯数 0.324 2.796 0.094 0.542（−0.093～1.177） 吃早餐天数 0.144 6.059 0.014* −0.353（−0.635～−0.072） 吃夜宵天数 0.175 5.771 0.016* 0.421（0.077～0.764） 西式快餐 0.384 0.003 0.956 −0.021（−0.774～0.732） 中式快餐 0.285 0.188 0.665 0.123（−0.435～0.682） 外卖快餐 0.406 0.155 0.694 0.160（−0.635～0.955） 腌制肉 0.223 0.393 0.531 −0.140（−0.577～0.298） 新鲜水果蔬菜/肉类/牛奶 0.167 10.919 0.001** −0.552（−0.879～−0.225） 罐头、面包、奶酪 0.175 2.202 0.138 0.260（−0.083～0.604） 饮料 0.211 0.012 0.914 −0.023（−0.437～0.391） 甜食 0.205 6.491 0.011* 0.523（0.121～0.925） 零食 0.208 0.140 0.708 0.078（−0.330～0.487） 腌制菜 0.197 0.129 0.720 0.071（−0.315～0.456） 烧烤 0.207 0.002 0.966 0.009（−0.397～0.414） 女生 学习日视屏时间 0.133 5.614 0.018* 0.316（0.055～0.577） 休息日视屏时间 0.143 0.842 0.359 0.132（−0.149～0.412） 白天户外活动时间 0.166 1.008 0.315 −0.167（−0.493～0.159） 抽烟支数 0.336 3.698 0.054 0.646（−0.012～1.305） 喝酒杯数 0.383 3.015 0.083 0.665（−0.086～1.416） 吃早餐天数 0.143 7.513 0.006** −0.392（−0.672～−0.112） 吃夜宵天数 0.191 0.679 0.410 0.158（−0.217～0.532） 西式快餐 0.591 2.259 0.133 −0.889（−2.047～0.270） 中式快餐 0.284 0.933 0.334 −0.274（−0.831～0.282） 外卖快餐 0.555 0.183 0.668 −0.238（−1.326～0.850） 腌制肉 0.255 0.004 0.951 0.016（−0.485～0.516） 新鲜水果蔬菜/肉类/牛奶 0.192 0.911 0.340 −0.184（−0.561～0.193） 罐头、面包、奶酪 0.190 0.417 0.519 −0.123（−0.496～0.250） 饮料 0.238 0.001 0.980 0.006（−0.46～0.472） 甜食 0.217 0.109 0.741 0.072（−0.353～0.497） 零食 0.219 1.991 0.158 0.310（−0.120～0.740） 腌制菜 0.241 0.132 0.717 −0.087（−0.560～0.385） 烧烤 0.247 0.628 0.428 0.195（−0.288～0.679） 注：模型1未控制变量，模型2控制民族、家庭居住地、是否独生子女、家庭类型、家庭经济条件、父/母文化程度、父/母职业、学习压力、家庭变故、住院经历、抑郁症家族史；*P < 0.05 ，**P < 0.01。 表 3 中学生生活行为方式与抑郁症状的分性别分析（n=819）（2）Table 3. Gender analysis of lifestyle behaviors and depressive symptoms in middle school students （n=819）（2）模型 分层 生活行为 标准误 Wald χ2 P β（95%CI） 模型2 男生 学习日视屏时间 0.114 6.815 0.009** 0.297（0.074～0.520） 休息日视屏时间 0.130 0.005 0.945 0.009（−0.245～0.263） 白天户外活动时间 0.155 5.672 0.017* −0.369（−0.673～−0.065） 抽烟支数 0.332 0.905 0.341 −0.316（−0.966～0.335） 喝酒杯数 0.323 1.232 0.267 0.359（−0.275～0.992） 吃早餐天数 0.142 4.112 0.043* −0.288（−0.567～−0.010） 吃夜宵天数 0.167 3.065 0.080 0.292（−0.035～0.618） 西式快餐 0.381 0.744 0.389 0.328（−0.418～1.074） 中式快餐 0.270 <0.001 0.986 −0.005（−0.534～0.525） 外卖快餐 0.394 0.214 0.643 0.182（−0.589～0.954） 腌制肉 0.214 0.994 0.319 −0.214（−0.634～0.206） 新鲜水果蔬菜/肉类/牛奶 0.160 7.017 0.008** −0.423（−0.735～−0.110） 罐头、面包、奶酪 0.169 0.104 0.747 0.054（−0.276～0.385） 饮料 0.205 0.198 0.657 −0.091（−0.492～0.310） 甜食 0.195 3.109 0.078 0.344（−0.038～0.726） 零食 0.202 1.194 0.274 0.221（−0.175～0.616） 腌制菜 0.186 0.424 0.515 0.121（−0.243～0.485） 烧烤 0.198 0.454 0.501 0.134（−0.255～0.522） 女生 学习日视屏时间 0.128 5.736 0.017* 0.306（0.056～0.557） 休息日视屏时间 0.141 0.014 0.907 −0.016（−0.292～0.259） 白天户外活动时间 0.159 0.951 0.329 −0.155（−0.466～0.156） 抽烟支数 0.324 4.397 0.036* 0.679（0.044～1.314） 喝酒杯数 0.369 0.470 0.493 0.253（−0.470～0.976） 吃早餐天数 0.139 4.779 0.029* −0.304（−0.576～−0.031） 吃夜宵天数 0.183 0.449 0.503 0.122（−0.236～0.480） 西式快餐 0.585 4.771 0.029* −1.278（−2.425～−0.131） 中式快餐 0.271 0.791 0.374 −0.241（−0.773～0.290） 外卖快餐 0.563 0.192 0.661 −0.247（−1.349～0.856） 腌制肉 0.253 0.019 0.890 −0.035（−0.531～0.461） 新鲜水果蔬菜/肉类/牛奶 0.184 0.003 0.960 −0.009（−0.369～0.351） 罐头、面包、奶酪 0.184 0.008 0.930 −0.016（−0.376～0.344） 饮料 0.225 0.089 0.765 0.067（−0.374～0.509） 甜食 0.207 0.025 0.875 0.033（−0.373～0.438） 零食 0.206 3.269 0.071 0.373（−0.031～0.778） 腌制菜 0.230 0.986 0.321 −0.229（−0.680～0.223） 烧烤 0.233 0.566 0.452 0.175（−0.281～0.632） 注：模型1未控制变量，模型2控制民族、家庭居住地、是否独生子女、家庭类型、家庭经济条件、父/母文化程度、父/母职业、学习压力、家庭变故、住院经历、抑郁症家族史；*P < 0.05 ，**P < 0.01。 3. 讨论
本研究结果显示，云南屏边苗族地区农村中学生抑郁症状检出率为33.21%，略低于涂巍等[10]调查的农村中学生抑郁状况（36.6%），高于云南多民族中学生抑郁症状检出率（28.3%）[11]。女生（39.2%）抑郁症状检出率高于男生（26.7%），差别有统计学意义，与以往研究一致[12]。
分析结果显示，学习日视屏时间长、户外活动时间少、吃早餐天数少、摄入新鲜食物不足、喜欢吃零食会增加中学生抑郁症状发生风险。可能是由于新鲜水果蔬菜、新鲜肉类、新鲜牛奶摄入不足，色氨酸缺乏导致血清素生成量减少，低水平的大脑血清素与抑郁有关[13]。有研究表明，微营养素能降低抑郁风险[14]，而不吃早餐的人较吃早餐的人每日微营养素摄入量更少[15]。学习日视屏时间长可能导致学习成绩下降，学习成绩较差的中学生更可能有抑郁症状[16]。抑郁与较小的海马体积有关，而运动可以增加海马区体积，因此，户外活动时间少可能是中学生抑郁的危险因素[17]。同时，身体活动不足的人花在视屏上的时间更长[18]。不吃早餐与水果蔬菜摄入不足、身体活动不足有关[19]。这些危险因素间的相互作用更增加了抑郁症状发生率。因此，学校应教育中学生养成良好的生活行为方式，预防和改善中学生的抑郁症状。建议学校定期对中学生进行抑郁症状筛查，针对有抑郁症状的中学生加强心理疏导。
按性别分层分析显示，学习日视屏时间长和吃早餐天数少是男生和女生抑郁症状共同的风险性因素，在差异性因素方面，户外活动时间少和新鲜食物摄入不足是男生抑郁症状的风险性因素，抽烟和吃西式快餐是女生抑郁症状的风险性因素。抑郁症状影响因素存在性别差异的可能机制如下：首先，相较于女生，运动能力及体型较差、不擅长运动的男生被边缘化和遭受奚落的风险更高[20]，因此男生户外活动时间与抑郁有很大关系；其次，有研究表明营养知识和食物选择之间存在相关性，女生的营养知识知晓率高于男生[21]，这可能是男生水果和蔬菜消费低于女生的原因[22]；再次，女生容易因快餐摄入过多导致肥胖[23]，但女生更强烈地认同女性需要苗条，她们对自己体型的不满增加了抑郁的风险[24]；最后，与男生相比，女生在消极情绪的诱导下更快地开始吸烟[25]，且戒烟率低于男生[26]，而尼古丁的依赖会增加患抑郁症的风险[27]，所以女生更容易因吸烟导致抑郁。因此，在进行中学生心理健康的干预时，应考虑到性别差异，制定针对性的干预措施。
本研究的优点：首先，目前关于云南苗族地区青少年生活行为方式与抑郁症状的关联的文献未见报道，具有一定的创新性。其次，本研究深入云南边远的苗族地区面对面调查农村青少年生活行为与抑郁症状，研究数据有一定的参考价值。本研究也存在一些局限性：（1）回顾性问卷调查不可避免地存在一定的信息偏倚，比如回忆不清、提供错误信息等；（2）本研究对象均为初中生，年龄范围较窄，且样本量较少，今后需扩宽人群扩大样本量进一步研究，为改善中学生抑郁症状提供更可靠的依据；（3）笔者已经尽量控制混杂因素，但影响抑郁症状的因素还有很多，如社交、睡眠等，可能会夸大研究变量与中学生抑郁症状的关联性；（4）横断面研究仅限于关联性分析，抑郁症状与各变量间的因果关系将在队列研究中确认。
综上所述，云南屏边苗族农村中学生抑郁症状与视屏时间、户外活动、抽烟、早餐行为、西式快餐、新鲜食物和零食消费等多种因素有关联。鉴于不同性别的中学生抑郁症状的影响因素不同，应有针对性地采取相应措施，减少抑郁症状的发生，促进中学生健康成长。
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图 2 Western blotting法检测miR-148a-3p对RUNX2和N-cadherin蛋白表达水平的影响
A：RT-PCR检测miR-148a-3p表达水平；B：Western blotting法检测RUNX2和N-cadherin蛋白表达水平；C：灰度值分析RUNX2和N-cadherin蛋白相对表达量。与Con比较，*P < 0.05。
Figure 2. The effects of miR-148a-3p on the expression levels of RUNX2 and N-cadherin proteins were detected by Western blotting
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