Role of Mertk-mediated NF-κb Pathway in Inflammatory Response of Schwann Cells
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摘要:
目的 探究Mertk表达水平对大鼠雪旺细胞NF-κb通路的调控作用及其可能的机制。 方法 体外培养大鼠雪旺细胞，免疫印迹法检测Mertk在高糖环境雪旺细胞中表达情况。免疫共沉淀法检测内源性Mertk与Ikbkb相互作用。免疫印迹法检测沉默Mertk后雪旺细胞内Ikbkb、P65、肿瘤坏死因子-α表达水平。免疫荧光法检测沉默Mertk后Mertk、Ikbkb、P65蛋白表达。 结果 Mertk在雪旺细胞中存在表达，且表达量随葡萄糖浓度增加而提高；免疫共沉淀实验表明Mertk与Ikbkb在大鼠雪旺细胞内相互作用；免疫印迹实验显示，将雪旺细胞内Mertk敲减表达后，与对照组相比，Mertk表达水平降低（P < 0.05），Ikbkb、P65、TNF-α明显升高（P < 0.05）；免疫荧光实验显示，沉默后的雪旺细胞内Mertk荧光减弱，Ikbkb、P65荧光增强。 结论 Mertk表达降低后，可以通过与Ikbkb进行相互作用，介导调控雪旺细胞NF-κb通路，上调P65和炎症因子TNF-α的表达。 Abstract:Objective To explore the regulatory effect of Mertk expression level on NF-κb pathway in rat Schwann cells and its possible mechanism. Methods Rat Schwann cells were cultured in vitro, and the expression of Mertk in Schwann cells exposed to high glucose was detected by Western blot. Co-immunoprecipitation was used to detect the interaction between endogenous Mertk and Ikbkb. Western blot was used to detect the expression levels of Ikbkb, P65 and tumor necrosis factor-α in Schwann cells after Mertk silencing. The protein expressions of Mertk, Ikbkb and P65 after silencing Mertk were detected by immunofluorescence. Results Mertk was expressed in Schwann cells, and the expression level increased with the increase of glucose concentration. Co-immunoprecipitation assay showed that Mertk interacted with Ikbkb in rat Schwann cells. Compared with the control group, the expression level of Mertk was significantly decreased（P < 0.05）, while Ikbkb, P65 and TNF-α were significantly increased（P < 0.05） after knock down expression of Mertk in Schwann cells. Immunofluorescence experiments showed that the fluorescence of Mertk was decreased, and the fluorescence of Ikbkb and P65 was increased in the silenced Schwann cells. Conclusion After the expression of Mertk is decreased, it can mediate the regulation of NF-κb pathway in Schwann cells through interaction with Ikbkb, and up-regulate the expression of P65 and inflammatory factor TNF-α. -
Key words:
- Mertk /
- Ikbkb /
- Nuclear factor kappa-b /
- Schwann cells /
- Diabetes peripheral neuropathy
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糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一组以慢性高血糖为特征的代谢性疾病。糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病最常见的并发症之一，国内患病率达67.6%，其中重度 DPN患病率达19.3%[1]。雪旺细胞作为周围神经系统中最重要的髓鞘细胞，参与维持周围神经的正常结构和功能[2-3]，炎症反应对雪旺细胞的损伤是DPN发生发展的重要因素[4]。核因子κB（nuclear factor kappa-b，NF-κb）级联反应是炎症反应的调控中心，抑制NF-κb通路，有望降低炎性细胞因子的表达，最终改善神经损伤[5]。
Mer受体酪氨酸激酶（Mer receptertyroshin kinase，Mertk）是受体酪氨酸激酶家族TAM成员之一，作为一种单跨膜受体可以通过结合多种配体将信号从细胞外基质转导至细胞质，调节众多生理过程[6-8]。现有文献显示[9-10]，Mertk能够抑制促炎性细胞因子IL-12、干扰素和NF-κb的表达，从而抑制炎症信号转导。本课题前期利用公共数据库，发现并报道[11]Mertk基因表现出糖尿病周围神经病变的疾病特异性，但Mertk在雪旺细胞中的可能作用及其调控机制尚不清楚。为此，本研究通过沉默大鼠雪旺细胞内Mertk基因，探究Mertk是否通过调控炎症反应NF-κb通路相关蛋白B细胞κ轻肽基因增强子抑制因子激酶ε（inhibitor kappa B kinaseβ，Ikbkb）、P65、TNF-α，从而影响雪旺细胞炎症反应。
1. 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂
AI1600超灵敏化学发光成像仪（GE公司，美国）和正置荧光显微镜（Olympus公司，日本）来源于昆明医科大学科技成果孵化中心，垂直电泳及湿式转膜系统购自北京六一生物科技公司。葡萄糖浓度为4.5 g/L（25 mmol/L）的DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗和含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液均购自美国GIBCO公司，无水葡萄糖购自广州光华科技有限公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天公司，Mertk、Ikbkb抗体购自美国Abcam公司，P65抗体、TNF-α抗体、β-actin抗体、IgG抗体、抗兔/抗鼠第二抗体购自武汉Proteintech公司，免疫荧光试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，免疫共沉淀试剂盒购自上海爱必信科技有限公司。
1.2 细胞培养
大鼠雪旺氏细胞株（RSC96）来自昆明医科大学科技成果孵化中心，生长所需细胞培养基配比是DMEM培养基∶胎牛血清∶双抗=100∶10∶1，放置在37℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中静置培养。
1.3 Mertk在高糖环境雪旺细胞中表达
将RSC96细胞随机分为对照组（25 mmol/L组）和处理组（50、75、100及125 mmol/L组）。首先使用不添加胎牛血清的培养基进行饥饿处理4 h，再将DMEM培养基中葡萄糖浓度分别调整至50 mmol/L、75 mmol/L、100 mmol/L及125 mmol/L，继续培养48 h，Western blot检测细胞内Mertk蛋白表达水平。
1.4 免疫共沉淀检测内源性Mertk、Ikbkb相互作用
培养3瓶RSC96细胞。以Lysis buffer∶PMSF=100∶1配制裂解液，将RSC96细胞裂解、超声、离心、留取Input蛋白，所得产物分别加入Mertk、Ikbkb、IgG一抗1～5 µg，4℃孵育过夜后加入5 µL Protein A与Protein G，再经过孵育、洗涤、离心、SDS缓冲液重悬、变性得到终产物，最后利用免疫印迹法检测Mertk与Ikbkb的相互作用。
1.5 免疫印迹法检测沉默Mertk后RSC96内Ikbkb、P65、TNF-α表达水平
将3种Mertk siRNA试剂（siRNA1 /siRNA2 /siRNA3）及空载对照（NC）利用GP-Transfect-Mate试剂转染进入RSC96细胞。48 h后根据BCA试剂盒说明书所述提取总蛋白，免疫印迹法检测Mertk、Ikbkb、P65、TNF-α表达水平。siRNA核苷酸序列见表1。
表 1 Mertk小干扰核苷酸序列Table 1. Mertk-RNA oligo sequences寡核苷酸 正义序列（5′-3′） 反义序列（5′-3′） Mertk-Rat-1 GGGUCGUACAUCUGUAAGATT UCUUACAGAUGUACGACCCTT Mertk-Rat-2 CACCCACUGAAGUCCAUAUTT AUAUGGACUUCAGUGGGUGTT Mertk-Rat-3 GAGGAAAGAUACAUCUUAATT UUAAGAUGUAUCUUUCCUCTT 1.6 免疫荧光法检测沉默Mertk后炎症因子TNF-α表达
在玻璃爬片上培养RSC96细胞，随机分为对照组（Con组）和实验组（siRNA3组），按组别处理细胞。48 h后细胞经过固定、通透、封闭等步骤后，分别加入Mertk（1∶200）、Ikbkb（1∶200）、P65（1∶200）一抗4℃孵育过夜，第2天加入相对应种属的荧光二抗暗室内孵育；DAPI染细胞核10 min后，将细胞爬片倒扣在滴有荧光淬灭剂的载玻片上，使用正置荧光显微镜观察并拍照。
1.7 统计学处理
采用SPSS23.0统计软件。计量资料采用Kolmogorov-Smirnov法检验数据正态性，符合正态分布时以均数±标准差（$\bar x \pm s $）表示，多组间单因素比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 Mertk在雪旺细胞的表达
首先明确Mertk在雪旺细胞中是否表达，以及模拟糖尿病高糖环境下Mertk表达水平的变化情况。免疫印迹结果显示，Mertk在雪旺细胞中存在表达，且随葡萄糖浓度增加，细胞Mertk表达水平增加（P < 0.05），见表2和图1。
表 2 不同葡萄糖水平RSC96内Mertk蛋白表达Table 2. Mertk protein expression within RSC96 at different glucose levels灰度值
比值组别 F P 25 mmol/L 50 mmol/L 75 mmol/L 100 mmol/L 125 mmol/L Mertk/β-actin 0.60 ± 0.20 0.78 ± 0.19 0.81 ± 0.06 0.95 ± 0.09* 0.87 ± 0.11* 4.452 0.0098* 与对照组（25 mmol/L组）比较，*P < 0.05。 
图 1 不同葡萄糖水平RSC96内Mertk蛋白表达A：Mertk蛋白在不同葡萄糖水平下的表达；B：对Mertk/β-actin结果进行统计分析；ns表示差异无统计学意义，*P < 0.05。Figure 1. Mertk protein expression within RSC96 at different glucose levels2.2 Mertk与Ikbkb内源性相互作用
以非特异免疫的同源抗体IgG作为阴性对照，以Input作为阳性对照，免疫共沉淀结果显示，RSC96细胞内同时表达Mertk、Ikbkb，且二者之间存在相互作用关系，见图2。
图 2 Mertk与Ikbkb免疫共沉淀A：以Mertk抗体调取Ikbkb的免疫沉淀物；B：以Ikbkb抗体调取Mertk的免疫沉淀物。Figure 2. Co-Immunoprecipitation of Mertk with Ikbkb2.3 沉默Mertk对雪旺细胞Ikbkb、P65、TNF-α蛋白表达的影响
免疫印迹实验结果显示，3种siRNA均使Mertk表达含量下降（P < 0.05），同时Ikbkb、P65、TNF-α表达水平随Mertk表达水平的降低而升高（P < 0.05），见表3和图3。
表 3 沉默Mertk后Ikbkb、P65、TNF-α蛋白表达量Table 3. Ikbkb，P65，and TNF-α protein expression after silencing Mertk组别 Mertk
/β-actinIkbkb
/β-actinP65
/β-actinTNF-α
/β-actinCON 1.13 ± 0.22 0.38 ± 0.11 0.60 ± 0.12 0.60 ± 0.09 NC 1.28 ± 022 0.44 ± 0.22 0.57 ± 0.16 0.62 ± 0.19 siRNA1 0.68 ± 0.08* 1.10 ± 0.18* 1.22 ± 0.18* 1.05 ± 0.25* siRNA2 0.60 ± 0.24* 1.12 ± 0.02* 1.02 ± 0.09* 0.85 ± 0.04* siRNA3 0.60 ± 0.12* 1.18 ± 0.28* 0.95 ± 0.11* 1.19 ± 0.09* F 8.927 13.76 12.62 8.646 P 0.0025* 0.0004* 0.0006* 0.0028* 与CON组比较，*P < 0.05。 2.4 免疫荧光检测Mertk、Ikbkb、P65蛋白
以siRNA3转染RSC96细胞后，Mertk、Ikbkb、P65蛋白免疫荧光结果与免疫印迹实验一致，见图4。
图 3 沉默Mertk后Ikbkb、P65、TNF-α蛋白表达水平A：siRNA处理后Mertk、Ikbkb、P65、TNF-α的蛋白表达；B：对Mertk/β-actin结果进行统计分析；C：对Ikbkb/β-actin结果进行统计分析；D：对P65/β-actin结果进行统计分析；E：对TNF-α/β-actin结果进行统计分析；ns表示差异无统计学意义，*P < 0.05。Figure 3. Ikbkb，P65，and TNF-α protein expression levels after silencing Mertk
图 4 免疫荧光检测siRNA3转染后Mertk、Ikbkb、P65蛋白表达（200x）Figure 4. Immunofluorescence detection of Mertk，Ikbkb，and P65 protein expression after siRNA3 transfection（200x）3. 讨论
糖尿病周围神经病是糖尿病患者最常见的慢性并发症，是导致糖尿病患者截肢，生活质量下降及死亡的主要原因之一，加重社会负担[12]。糖尿病周围神经病变以神经纤维脱髓鞘、神经传导速度受损为特征[13]，而雪旺细胞正是周围神经系统中最重要的髓鞘细胞；雪旺细胞损伤与凋亡是糖尿病周围神经病变的重要病理学特征之一，也是导致糖尿病髓鞘功能不良的主要因素[14]。因此，本研究以大鼠雪旺细胞作为研究对象，以此作为糖尿病周围神经病变研究的重要切入点，并且首先明确了Mertk在雪旺细胞中的表达，即随着细胞生长环境内葡萄糖浓度的提高，Mertk表达量也随之提高。
蛋白质通常不是作为单一物质发挥作用，而是以蛋白质-蛋白质相互作用的方式在活细胞生物过程中发挥作用。本研究结果通过免疫共沉淀实验，验证了雪旺细胞内Mertk与Ikbkb的内源性相互作用。Ikbkb（也称IKKβ、IKK2）是IKK复合体的催化亚基之一，而IKK复合体是NF-κb信号转导通路的关键调节因子，可迅速激活NF-κb，以协调大多数靶基因的表达[15-16]。因此，本实验试图进一步探究Mertk是否间接调控NF-κb通路，对雪旺细胞炎症反应产生影响。
为达到这一目的，本研究使用siRNA敲减沉默表达Mertk后，发现P65及其下游炎症因子TNF-α表达水平升高，表明NF-κb通路受到正向调控，雪旺细胞内炎症反应加重。经典的NF-κb系统是由亚基p50和P65组成的复合体，在大多数静息细胞中，NF-κb以抑制物IκB的形式存在。糖尿病病理过程产生的刺激，可导致IKK特异性地磷酸化IκB，进而允许p50和P65向细胞核发出信号，激活大量有关基因[17]。NF-κb通路调控的促炎细胞因子是神经血管损伤和神经传导速度受损的主要原因，抑制NF-κb通路，有望降低炎性细胞因子的表达，最终改善神经损伤[5]。由此，课题组推测，以Mertk基因为靶点进行研究可能为糖尿病周围神经病的治疗提供新的思路。
综上所述，本研究以雪旺细胞为研究对象，发现Mertk与Ikbkb相互作用，沉默Mertk可上调Ikbkb，继而激活NF-κb信号转导通路，上调P65及其下游炎症因子TNF-α表达水平。本研究对糖尿病周围神经病变的发病机制、临床药物的治疗、靶向药物的研发都有非常积极的作用，这些体外细胞实验也为进一步的动物体内实验以及临床血清分子标记验证打下了基础。
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图 1 不同葡萄糖水平RSC96内Mertk蛋白表达
A：Mertk蛋白在不同葡萄糖水平下的表达；B：对Mertk/β-actin结果进行统计分析；ns表示差异无统计学意义，*P < 0.05。
Figure 1. Mertk protein expression within RSC96 at different glucose levels
图 2 Mertk与Ikbkb免疫共沉淀
A：以Mertk抗体调取Ikbkb的免疫沉淀物；B：以Ikbkb抗体调取Mertk的免疫沉淀物。
Figure 2. Co-Immunoprecipitation of Mertk with Ikbkb
图 3 沉默Mertk后Ikbkb、P65、TNF-α蛋白表达水平
A：siRNA处理后Mertk、Ikbkb、P65、TNF-α的蛋白表达；B：对Mertk/β-actin结果进行统计分析；C：对Ikbkb/β-actin结果进行统计分析；D：对P65/β-actin结果进行统计分析；E：对TNF-α/β-actin结果进行统计分析；ns表示差异无统计学意义，*P < 0.05。
Figure 3. Ikbkb，P65，and TNF-α protein expression levels after silencing Mertk
图 4 免疫荧光检测siRNA3转染后Mertk、Ikbkb、P65蛋白表达（200x）
Figure 4. Immunofluorescence detection of Mertk，Ikbkb，and P65 protein expression after siRNA3 transfection（200x）
表 1 Mertk小干扰核苷酸序列
Table 1. Mertk-RNA oligo sequences
寡核苷酸 正义序列（5′-3′） 反义序列（5′-3′） Mertk-Rat-1 GGGUCGUACAUCUGUAAGATT UCUUACAGAUGUACGACCCTT Mertk-Rat-2 CACCCACUGAAGUCCAUAUTT AUAUGGACUUCAGUGGGUGTT Mertk-Rat-3 GAGGAAAGAUACAUCUUAATT UUAAGAUGUAUCUUUCCUCTT 
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表 2 不同葡萄糖水平RSC96内Mertk蛋白表达
Table 2. Mertk protein expression within RSC96 at different glucose levels
灰度值
比值组别 F P 25 mmol/L 50 mmol/L 75 mmol/L 100 mmol/L 125 mmol/L Mertk/β-actin 0.60 ± 0.20 0.78 ± 0.19 0.81 ± 0.06 0.95 ± 0.09* 0.87 ± 0.11* 4.452 0.0098* 与对照组（25 mmol/L组）比较，*P < 0.05。
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表 3 沉默Mertk后Ikbkb、P65、TNF-α蛋白表达量
Table 3. Ikbkb，P65，and TNF-α protein expression after silencing Mertk
组别 Mertk
/β-actinIkbkb
/β-actinP65
/β-actinTNF-α
/β-actinCON 1.13 ± 0.22 0.38 ± 0.11 0.60 ± 0.12 0.60 ± 0.09 NC 1.28 ± 022 0.44 ± 0.22 0.57 ± 0.16 0.62 ± 0.19 siRNA1 0.68 ± 0.08* 1.10 ± 0.18* 1.22 ± 0.18* 1.05 ± 0.25* siRNA2 0.60 ± 0.24* 1.12 ± 0.02* 1.02 ± 0.09* 0.85 ± 0.04* siRNA3 0.60 ± 0.12* 1.18 ± 0.28* 0.95 ± 0.11* 1.19 ± 0.09* F 8.927 13.76 12.62 8.646 P 0.0025* 0.0004* 0.0006* 0.0028* 与CON组比较，*P < 0.05。
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