The Role of miRNA-15a/16 in Regulating Bmi-1 Protein in Ovarian Cancer Resistance to Cisplatin Chemotherapy
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摘要:
目的 探讨miRNA-15a和miRNA-16在逆转卵巢癌顺铂化疗耐药过程中的作用机制。 方法 使用miRNA-15a和miRNA-16模拟物转染人卵巢癌顺铂耐药细胞株CoC1/DDP，予顺铂处理，qRT-PCR检测正常培养CoC1/DDP细胞组、顺铂处理组、阴性对照组、转染miRNA-15a组、转染miRNA-16组和过表达的Bmi-1质粒的转染miRNA-15a和miRNA-16组的miRNA-15a、miRNA-16的表达水平，同时应用Western blot检测各组细胞中Bmi-1的表达水平，CCK-8法、Annexin V/PI法检测每组细胞的存活及凋亡情况、γ-H2AX免疫荧光检测细胞凋亡情况。 结果 卵巢癌顺铂耐药细胞株CoC1/DDP中miRNA-15a和miRNA-16低表达，Bmi-1蛋白高表达。过表达miRNA-15a、miRNA-16水平，Bmi-1蛋白下降（P < 0.05），细胞存活率下降（P < 0.05），DNA凋亡明显增加（P < 0.05），DNA损伤程度更严重（P < 0.05）。过表达Bmi-1质粒可提高细胞活度（P < 0.05），降低细胞凋亡率（P < 0.05）。 结论 Bmi-1蛋白可能是miRNA-15a和miRNA-16的调节蛋白靶点，高表达miRNA-15a和miRNA-16可以通过降低Bmi-1蛋白来提高顺铂对卵巢癌细胞的敏感性。通过对卵巢癌顺铂化疗耐药性分子标记的预测和对卵巢癌 肿耐药性目标的攻克提供了新的思路。 -
关键词:
- 卵巢癌 /
- miRNA-15a/16 /
- Bmi-1蛋白 /
- 化疗耐药 /
- 肿瘤恶性行为
Abstract:Objective To investigate the mechanisms of miRNA-15a and miRNA-16 in the process of reversing cisplatin resistance in ovarian cancer. Methods Human ovarian cancer cisplatin-resistant cell lines CoC1/DDP were transfected with miRNA-15a and miRNA-16 mimics and treated with cisplatin. qRT-PCR was used to detect the expression levels of miRNA-15a and miRNA-16 in normal CoC1/DDP cell group, cisplatin treated group, negative control group, miRNA-15a transfected group, miRNA-16 transfected group and overexpressed Bmi-1 plasmid. Western blot was used to detect the expression level of Bmi-1 in each group, CCK-8 and Annexin V/PI were used to detect cell survival and apoptosis, and γ-H2AX immunofluorescence was used to detect cell apoptosis. Results The CoC1/DDP ovarian cancer cell line shows low expression of miRNA-15a and miRNA-16, and high expression of Bmi-1 protein, which makes it resistant to cisplatin. When the levels of miRNA-15a and miRNA-16 are overexpressed, the Bmi-1 protein decreases（P < 0.05）, leading to a decrease in cell survival rate（P < 0.05）, a significant increase in DNA apoptosis（P < 0.05）, and more severe DNA damage（P < 0.05）. Overexpression of Bmi-1 plasmid can increase cell viability（P < 0.05） and reduce the rate of cell apoptosis（P < 0.05）. Conclusion The Bmi-1 protein may be a target for the regulation of miRNA-15a and miRNA-16, and overexpression of miRNA-15a and miRNA-16 can increase the sensitivity of ovarian cancer cells to cisplatin by reducing the Bmi-1 protein. This provides a new idea for predicting molecular markers of cisplatin resistance in ovarian cancer and overcoming drug resistance targets in ovarian cancer. -
Key words:
- Ovarian cancer /
- miRNA-15a/16 /
- Bmi-1 protein /
- Chemotherapy resistance /
- Malignant behavior of tumor
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胶质瘤是常见的原发性脑肿瘤。据报道，每年约有14000例新增的胶质瘤患者[1]，且老年人具有较高的发病率。尽管目前手术切除以及放化疗等医学技术取得了很大的进步，但患者的预后仍然较差，临床上仍无法彻底治愈恶性程度较高的胶质瘤。因此，探索胶质瘤的潜在发病机制，寻找新的预后标志物迫在眉睫。miRNA是由18～25个核苷酸组成的非编码RNA，已被广泛报道参与调节肿瘤细胞的生理过程[2-3]，通过与靶mRNA的异常表达和交叉调节可作为肿瘤的诊断和预后标志物。例如：miR-4319在甲状腺癌组织和细胞中下调，抑制甲状腺癌细胞的增殖、迁移和上皮间质转化[4]。miR-149是肿瘤中具有广泛调控作用的miRNA，由2q37.3上的MIR149基因编码。Xu B等[5]报道，促进miR-149-5p表达可增强替莫唑胺对胶质瘤细胞的毒性。但miR-149-5p在胶质瘤中的作用机制尚不清楚。因此，本研究将探讨miR-149-5p对胶质瘤细胞恶性生物学行为的调控作用及其具体作用机制。
1. 材料与方法
1.1 临床样本收集
收集在渭南市中心医院就诊并确诊为胶质瘤患者的肿瘤组织样本30例，在距肿瘤组织2 cm处获得相邻的癌旁组织样本（即对照组），在收样前患者知情并签署知情同意书。采集样本的患者除手术治疗外未接受其他治疗。本研究工作遵循世界医学协会赫尔辛基宣言进行，同时获得了渭南市中心医院伦理委员会的批准（2023研004-3）。
1.2 细胞系
胶质瘤细胞系A172（货号：CL-0012，Pricella，武汉）、U251（货号：CL-0237，Pricella，武汉）、HS683（货号：CL-0362，Pricella，武汉）、H4（货号：CBP60590，Cobioer，南京）。人正常星形胶质细胞HA1800（货号：AC340443）和293T细胞（货号：KMCC-001-0255）购自上海中乔新舟生物科技有限公司。
1.3 主要试剂
90%高糖DMEM培养基、DMEM培养基购自上海中乔新舟生物科技有限公司。PrimeScript™ RT试剂盒和gDNA Eraser购自Takara。NC mimic、miR-149-5p mimic、NC inhibitor和miR-149-5p inhibitor序列合成由吉玛基因提供技术支持。MSH5抗体购自ThermoFisher Scientific。GAPDH、GSK3β、β-catenin、AXIN2一抗购自Abcam。Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒、胰蛋白酶、CCK-8试剂盒和双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京Solarbio。Hoechst33342试剂、Wnt通路抑制剂Triptonide以及Wnt通路激活剂HLY78购自MedChemExpress。荧光显微镜购自莱卡。离心机购自深圳瑞沃德。细胞培养箱购自Eppendorf。Bio-RAD蛋白成像系统购自上海艾研。
1.4 细胞培养
A172、U251、HS683、H4细胞分别接种于含10% FBS、1% P/SH的DMEM培养基。A1800细胞接种于含10% FBS的高糖DMEM培养基中。293T细胞培养在含10% FBS、1% Glutamax和1%双抗的DMEM培养基内。培养基置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中。
1.5 细胞转染和处理
取生长良好的A172细胞，经胰蛋白酶消化后接种于不含抗生素的培养基中。次日，根据Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒说明书，分别将NC mimic、miR-149-5p mimic、NC inhibitor和miR-149-5p inhibitor、sh-NC、sh-MSH5、sh-MSH5+miR-149-5pinhibitor以及pcDNA-MSH5分别转染至A172细胞。待细胞培养48 h后，分别检测转染效率，成功转染的细胞用于后续实验。转染的pcDNA-MSH5的A172细胞再根据试剂说明分别用Triptonide和HLY78处理。
1.6 RT-qPCR实验
TRIzol试剂提取总RNA，并使用PrimeScript™ RT试剂盒和gDNA Eraser将1000 ng RNA逆转录为cDNA。使用SYBR® Premix Ex Taq™ II和Applied Biosystems 7500实时PCR系统进行实时聚合酶链式反应。2-ΔΔCt法计算目标基因的相对表达。U6作为miRNA的内参。引物序列见表1。
表 1 引物序列Table 1. Primer sequences目的基因 引物序列 （F：正向序列，R：反向序列，5′-3′） miR-149-5p F: CTCTGGCTCCGTGTCTTCAC R: CTGCCCCAGCACAGCC U6 F: TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC R: CCAGTGCAGGGTCCGAGGT 1.7 CCK-8实验
CCK-8用于测定细胞活力。调整细胞密度，向96孔板的每孔中接种1000个A172细胞，每孔100 μL。培养板置于5% CO2细胞培养箱中培养。在培养的第0、24、48、72、96 h向每孔中添加10 μL CCK-8试剂，通过酶标仪测定细胞的光密度值。
1.8 Western blot实验
细胞在冰上含有蛋白酶抑制剂的RIPA溶液中裂解。BCA试剂盒检测蛋白质的浓度。将分离的蛋白质进行SDS-PAGE凝胶电泳，随后转移至PVDF膜上。将膜与一抗（MSH5：0.05 μg/mL；GAPDH：1∶2000；GSK3β：1∶2000；β-catenin：1∶4000；AXIN2：1 μg/mL）进行过夜孵育，再与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育2 h。经ECL化学发光底物曝光后用蛋白成像系统采集图像。Image J软件用于分析条带灰度值。
1.9 EDU实验
收集对数生长期的细胞培养在96孔板中，用100 μL含20 μmol/L EdU的培养基处理。在37 ℃、5% CO2环境中孵育2 h，用4%多聚甲醛分别固定各组细胞30 min，再置于含0.5% Triton-X-100的PBS溶液中孵育20 min。Hoechst33342溶液染细胞核。荧光显微镜观察染色结果并拍照记录。
1.10 Transwell检测迁移和侵袭
成功转染的细胞经胰蛋白酶消化后，收集细胞并计数。将4×104个细胞用100 μL无血清培养基悬浮制得细胞悬液并接种至Transwell小室上室，将含10% FBS的完全培养基加至小室下室。Transwell小室置于细胞培养箱中培养48 h。随后用4%多聚甲醛固定细胞0.1%结晶紫溶液染色。显微镜拍照并计数。侵袭实验接种细胞前在小室上室中加入稀释后的Matrigel基质胶，胶凝固后再接种细胞，其余步骤与迁移实验相同。
1.11 流式细胞术检测细胞周期
取生长良好的各组细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后，重悬于PBS中。然后在冰冷的70%乙醇中过夜固定。随后，1000 r/min条件下将细胞离心5 min，并重悬在50 μL RNase A中，于37 ℃下孵育30 min。将400 μL碘化丙啶（PI）细胞悬液中混匀，孵育30 min，通过流式细胞仪进行检测。
1.12 流式细胞术检测细胞凋亡率
采用双染法Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。将转染后的细胞接种至6孔板中，加入完全培养基培养24 h。收集细胞与Annexin V-FITC试剂在常温中避光孵育15 min，然后再与PI溶液避光孵育15 min。通过流式细胞仪测定细胞凋亡率。
1.13 双荧光素酶报告基因实验
经PCR扩增MSH5的3′-UTR（MSH5-WT）并插入p-GL3报告载体中，同时构建与miR-149-5p具有靶向结合位点的MSH5 3′-UTR突变序列（MSH5-MUT），并转入p-GL3报告载体。将NC mimic或miR-149-5p mimic分别与MSH5-WT或MSH5-MUT经Lipofectamine 2000共转染至293T细胞中。转染48 h后，通过双荧光素酶测定法分析荧光素酶活性。海肾荧光素酶活性作为内部参照。
1.14 统计学处理
每组实验均进行3次重复。GraphPad Prism8.0用于数据分析并作图。来自三个及以上独立重复实验的数据均表示为“均数±标准差”。非配对t检验用于分析2组间的差异。单因素方差分析用于分析多组间的差异，Tukey检验用于多组间的两两比较。P < 0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 miR-149-5p在胶质瘤组织和细胞中的表达
收集胶质瘤患者的肿瘤组织及其对应的癌旁组织，通过RT-qPCR检测显示，miR-149-5p肿瘤组织中的表达显著低于癌旁组织（图1A，P < 0.0001）。此外，miR-149-5p在人胶质瘤细胞系A172、U251、HS683、H4中的表达明显低于人正常星形胶质细胞HA1800（图1B，P < 0.0001）。由此，推测miR-149-5p在胶质瘤组织和细胞系中的低表达与胶质瘤的发展密切相关。
图 1 miR-149-5p在胶质瘤组织和细胞中的表达A：RT-qPCR检测胶质瘤组织中miR-149-5p的表达，与Para-cancer组相比，****P < 0.0001；B：RT-qPCR检测miR-149-5p在人正常星形胶质细胞阿和人胶质瘤细胞中的表达，与HA1800组相比，**P < 0.01，****P < 0.0001。Figure 1. miR-149-5p was downregulated in glioma tissues and cells2.2 miR-149-5p对A172细胞恶性生物学行为的影响
为进一步探索miR-149-5p对胶质瘤细胞的作用机制，分别在A172细胞中转染NC mimic、miR-149-5p mimic、NC inhibitor和miR-149-5p inhibitor。检测显示，转染miR-149-5pmimic明显增加miR-149-5p的表达，转染miR-149-5p inhibitor组中miR-149-5p表达降低。CCK-8、EDU、Transwell以及流式细胞术检测表明，过表达miR-149-5p明显抑制A172细胞的增殖（图2B、2C和2F，P < 0.01）、迁移（图2D和2G，P < 0.05）和侵袭（图2E和2H，P < 0.01），促进G1期细胞比例（图3A和3B，P < 0.01）以及凋亡率（图3C和3D，P < 0.01）。与NC inhibitor组相比，敲降miR-149-5p组中细胞的增殖活力（P < 0.05）、迁移（P < 0.05）和侵袭（P < 0.05）能力显著升高，G1期细胞比例（P < 0.05）以及凋亡水平（P < 0.05）降低。综上可知。过表达miR-149-5p可显著抑制A172细胞的增殖、转移和细胞周期，诱导细胞凋亡。敲降miR-149-5p可明显促进A172细胞的恶性生物学行为。
图 2 miR-149-5p对A172细胞恶性生物学行为的影响A：RT-qPCR检测miR-149-5p的表达；B：CCK-8检测细胞活力；C和F：EDU检测细胞增殖；D和G：Transwell检测细胞迁移能力；E和H：Transwell检测细胞侵袭能力；与NC mimic组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，****P < 0.000 1；与NC inhibitor组相比，#P < 0.05。Figure 2. Effect of miR-149-5p on malignant biological behavior of A172 cells
图 3 miR-149-5p对A172细胞恶性生物学行为的影响A和B：流式细胞术检测细胞周期；C和D：流式细胞术检测细胞凋亡率；与NC mimic组相比，**P < 0.01；与NC inhibitor组相比，#P < 0.05。Figure 3. Effect of miR-149-5p on malignant biological behavior of A172 cells2.3 miR-149-5p靶向MSH5
通过starbase数据库预测发现，MSH5与miR-149-5p具有靶向结合序列，见图4A。双荧光素酶报告基因实验验证证实，过表达miR-149-5p可明显抑制MSH5野生型载体的荧光素酶活性见图4B，P < 0.05），而对MSH5突变型载体的荧光素酶活性无显著作用（P > 0.05。通过GEPIA数据库预测显示，MSH5在胶质瘤组织中表达降低（图4C，P < 0.01）。RT-qPCR发现，过表达miR-149-5p可抑制MSH5的蛋白表达（图4D，P < 0.01），而敲降miR-149-5p组A172细胞中MSH5表达显著增加（图4E，P < 0.01）。由此证实，miR-149-5p靶向负调控MSH5。
图 4 miR-149-5p靶向MSH5A：starbase数据库预测miR-149-5p和MSH5的结合序列；B：双荧光素酶报告基因实验验证miR-149-5p和MSH5的靶向关系，与NC mimic组相比，*P < 0.05；C：GEPIA数据库预测MSH5在胶质瘤组织中的表达，与Para-cancer组相比，**P < 0.01；D：Western blot检测MSH5的蛋白表达，与NC组相比，**P < 0.01。Figure 4. miR-149-5p targeted MSH52.4 miR-149-5p靶向MSH5调控A172细胞的恶性生物学行为
为进一步探索miR-149-5p调控MSH5对A172细胞恶性生物学行为的影响，分别在A172细胞中转染sh-NC、sh-MSH5和sh-MSH5+miR-149-5pinhibitor。Western blot结果见图5A和5B，转染sh-MSH5组A172细胞中MSH5的蛋白表达低于sh-NC组（P < 0.001），转染sh-MSH5+miR-149-5pinhibitor组中MSH5的蛋白表达高于sh-MSH5转染组（P < 0.05）。通过CCK-8、EDU、Tranwell和流式细胞术检测表明，敲降MSH5可显著抑制A172细胞的增殖活力（图5C～5E，均P < 0.01）、迁移（图5F和5G，P < 0.01）和侵袭（图5H和5I，P < 0.05），促进G1期细胞比例（图6A和6B，P < 0.01）以及细胞凋亡率（图6C和6D，P < 0.001）。同时敲降miR-149-5p和MSH5组中细胞的增殖（P < 0.05）、迁移（P < 0.05）和侵袭（P < 0.05）能力高于敲降MSH5组，G1期细胞比例（P < 0.05）和凋亡（P < 0.05）水平低于仅敲降MSH5组。综上所述，敲降miR-149-5p靶向MSH5，可逆转敲降MSH5对A172细胞恶性生物学行为的抑制作用。
图 5 miR-149-5p靶向MSH5调控A172细胞的恶性生物学行为A和B：Western blot检测MSH5蛋白表达；C：CCK-8检测细胞活力；D和E：EDU实验检测细胞增殖；F和G：Tranwell实验检测细胞迁移能力；H和I：Tranwell实验检测细胞侵袭能力；与sh-NC组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；与sh-MSH5组相比，#P < 0.05。Figure 5. miR-149-5p targeted MSH5 to regulate the malignant biological behavior of A172 cells
图 6 miR-149-5p靶向MSH5调控A172细胞的恶性生物学行为A和B：流式细胞术检测细胞周期；C和D：流式细胞术检测细胞凋亡率；与sh-NC组相比，**P < 0.01，***P < 0.001；与sh-MSH5组相比，#P < 0.05。Figure 6. miR-149-5p targeted MSH5 to regulate the malignant biological behavior of A172 cells2.5 MSH5调控Wnt信号通路对A172细胞的作用
Wnt信号通路被报道在胶质瘤的发展进程中发挥着重要作用，因此，笔者进一步探讨miR-149-5p/MSH5分子轴是否通过Wnt信号通路而调控胶质瘤的进程。分别用Wnt通路抑制剂Triptonide以及Wnt通路激活剂HLY78处理转染pcDNA-MSH5的A172细胞。检测结果见图7A，与pcDNA-NC作用相比，pcDNA-MSH5组中MSH5（图7B，P < 0.001）、GSK3β表达降低（图7C，P < 0.001），β-catenin（图7D，P < 0.05）和AXIN2（图7E，P < 0.01）表达升高。与pcDNA-MSH5组相比，pcDNA-MSH5+Triptonide组中GSK3β表达升高（P < 0.001），β-catenin（P < 0.05）和AXIN2（P < 0.01）表达降低；而pcDNA-MSH5+HLY78组中GSK3β表达降低（P < 0.001），β-catenin（P < 0.05）和AXIN2（P < 0.05）表达升高。过表达MSH5且经Triptonide处理可显著下调过表达MSH5对A172细胞的增殖（图7F～7H，均P < 0.01）、迁移（图7I～7J，P < 0.01）和侵袭（图7K～7L，P < 0.01）的促进作用以及对A172细胞的G1期细胞比例（图8A～8B，P < 0.05）和凋亡水平（图8C～8D，P < 0.05）的抑制作用。过表达MSH5且经HLY78处理可显著上调过表达MSH5对A172细胞的增殖（均P < 0.05）、迁移（P < 0.05）和侵袭（P < 0.05）的促进作用以及对A172细胞的G1期细胞比例（P < 0.05）和凋亡水平（P < 0.05）的抑制作用。综上表明，过表达MSH5通过激活Wnt信号通路促进A172细胞的恶性表型。
图 7 MSH5调控Wnt信号通路对A172细胞的作用A：Western blot检测MSH5，B：GSK3β，C：β-catenin，D：和AXIN2，E：的蛋白表达；F：CCK-8检测细胞活力；G和H：EDU检测细胞增殖；I和J：Transwell检测细胞迁移能力；K和L：Transwell检测细胞迁移能力；与pcDNA-NC组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；与pcDNA-MSH5组相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001。Figure 7. Effect of MSH5 regulating Wnt signaling pathway on A172 cells
图 8 MSH5调控Wnt信号通路对A172细胞的作用A和B：流式细胞术检测细胞周期；C和D：流式细胞术检测细胞凋亡率；与pcDNA-NC组相比，*P < 0.05；与pcDNA-MSH5组相比，#P < 0.05。Figure 8. Effect of MSH5 regulating Wnt signaling pathway on A172 cells3. 讨论
胶质瘤占原发性脑肿瘤的80%，由于有空间占位效应，使患者的颅内压升高，可能导致患者呕吐、视力丧失或出现癫痫症状[6]。同时，胶质瘤具有较强的侵袭性，手术很难将病灶完全切除[7]。因此，越来越多的研究者开始研究靶向治疗，以期通过寻找有效的生物标志物为胶质瘤提供新的治疗方案。
miRNA在基因表达中具有重要的调控作用，据估计，约有三分之一的蛋白表达受miRNA的调控[8-9]。miR-149-5p被证实在多种肿瘤细胞中作为抑癌因子抑制肿瘤的进程。Li Q等[10]证明，在胃癌组织和细胞系中miR-149-5p低表达，过表达miR-149-5p显著抑制胃癌细胞的增殖和转移并诱导细胞凋亡。在乳腺癌细胞中，circ-0072995通过靶向下调miR-149-5p可促进乳腺癌细胞的恶性表型和无氧糖酵解[11]。miR-149-5p靶向下调RGS17，抑制前列腺癌细胞的活力、增殖和迁移[12]。在本研究中，笔者发现miR-149-5p在胶质瘤组织和细胞系中表达降低，过表达miR-149-5p显著抑制胶质瘤A172细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞G1期的比例并诱导细胞凋亡。而敲降miR-149-5p可促进A172细胞的增殖和转移，抑制G1期细胞比例以及细胞凋亡率。此外，miR-149-5p也被报道参与炎症及代谢类疾病的调控[13-15]。例如：miR-149-5p可抑制骨关节炎和类风湿性关节炎中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平[15]。黄芪多糖通过上调miR-149-5p的表达，改善高糖和棕榈酸诱导的小鼠胰腺β细胞的增殖和胰岛素的分泌[13]。过表达miR-149-5p显著聚集尿酸诱导的干细胞中甘油三酯的积累[16]。
MutS同源物5（MutS Homolog 5，MSH5）是MutS蛋白家族的成员，与MSH4形成异二聚体复合物，参与DNA配错修复和减数分裂重组，在DNA双链断裂的同源重组修复过程中发挥重要作用[17]。研究发现，MSH4和MSH5中的遗传变异是男性不育的相关原因[18]。MSH5突变可损害DNA同源重组修复，可能导致非综合性原发性卵巢功能不全[19]。敲低lncRNA HCP5抑制YB1与MSH启动子在的结合，抑制MSH5的转录激活，进而抑制DNA双链断裂的修复过程，促进卵巢颗粒细胞的凋亡[20]。本研究中，笔者发现MSH5是miR-149-5p的靶基因，MSH5在胶质瘤组织和细胞中高表达，敲降miR-149-5p靶向上调MSH5促进A172细胞恶性表型。
糖原合成酶激酶3-β（glycogen Synthase Kinase 3-β，GSK3β）是GSK3的两种异构体之一，可通过介导Wnt/β-catenin信号通路参与调节糖原合成、蛋白质合成、细胞增殖、细胞分化以及免疫功能和炎症等过程[21-23]。本研究中，笔者证明，过表达MSH5通过抑制GSK3β，促进β-catenin和AXIN2表达，从而促进胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，抑制细胞凋亡。
综上所述，本研究发现miR-149-5p在胶质瘤组织和细胞系中低表达，敲降miR-149-5p通过靶向上调MSH5，抑制GSK3β，促进β-catenin和AXIN2通路蛋白表达，进而促进胶质瘤细胞的生长和转移，并抑制细胞凋亡。
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图 1 不同浓度顺铂处理的细胞活度
Figure 1. Cell activity was treated at different concentrations of cisplatin
图 2 miRNA-15a在各组细胞中的表达水平
与NC组比较，*P < 0.05。
Figure 2. The expression level of miRNA15a in each group of cells
图 3 miRNA-16在各组细胞中的表达水平
与NC组比较，*P < 0.05。
Figure 3. The expression level of miRNA16 in each group of cells
图 4 Bmi-1在各组细胞中的表达水平
与CoC1/DDP组、NC组比较，*P < 0.05。
Figure 4. The expression level of Bmi-1 in each group of cells
图 6 各组细胞的细胞存活度
与CoC1/DDP组、NC组、过表达质粒组比较，*P < 0.05。
Figure 6. Cell survival of each group
图 7 各组细胞的凋亡率水平
与CoC1/DDP组、NC组、过表达质粒组比较，*P < 0.05。
Figure 7. The apoptosis rate of cells in each group
图 8 各组细胞的凋亡率图谱
A：CoC1/DDP细胞组；B：5.0 µM/mL顺铂处理组；C：NC组；D：转染miRNA-15a模拟物组；E：miRNA-16模拟物组；F：过表达的Bmi-1质粒的转染miRNA-15a组；G：过表达的Bmi-1质粒miRNA-16组。
Figure 8. Apoptotic rate atlas of each group
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