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EV71阳性手足口病患儿131例临床特征及其EV71疫苗接种的预防效果

宋顺琪 蒋鸿超 马云超 冯星星 杜廷义 张红芳

王禹雪, 张华莉, 陈理军, 陆永萍. 一种经济的乳兔骨髓来源的肥大细胞诱导培养及鉴定[J]. 昆明医科大学学报, 2023, 44(6): 1-5. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20230622
引用本文: 宋顺琪, 蒋鸿超, 马云超, 冯星星, 杜廷义, 张红芳. EV71阳性手足口病患儿131例临床特征及其EV71疫苗接种的预防效果[J]. 昆明医科大学学报, 2023, 44(12): 139-143. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20231222
Yuxue WANG, Huali ZHANG, Lijun CHEN, Yongping LU. An Economical Method for Cultivation and Identification of Mast Cell Derived from Suckling Rabbit Bone Marrow[J]. Journal of Kunming Medical University, 2023, 44(6): 1-5. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20230622
Citation: Shunqi SONG, Hongchao JIANG, Yunchao MA, Xingxing FENG, Tingyi DU, Hongfang ZHANG. Clinical Characteristics of 131 Children with Hand,Foot,and Mouth Disease Infected with EV71 and Preventive Effect of EV71 Vaccination[J]. Journal of Kunming Medical University, 2023, 44(12): 139-143. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20231222

EV71阳性手足口病患儿131例临床特征及其EV71疫苗接种的预防效果

doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20231222
基金项目: 昆明市卫生健康委员会卫生科研课题基金资助项目(2022-11-01-008);昆明市儿童新发及诊断未明感染性疾病病原鉴定及致病机理医学研究机构(2023-SW研-02)
详细信息
    作者简介:

    宋顺琪(1973~ ),女,云南昆明人,医学学士,副主任医师,主要从事儿童感染性疾病病原体检测诊断及研究工作

    通讯作者:

    蒋鸿超,E-mail:hongchaojiang@aliyun.com

  • 中图分类号: R373.2

Clinical Characteristics of 131 Children with Hand,Foot,and Mouth Disease Infected with EV71 and Preventive Effect of EV71 Vaccination

  • 摘要:   目的  分析EV71阳性手足口病患儿临床特征及其EV71疫苗接种情况,探索重症发生和接种EV71疫苗的预防效果的关系。  方法   回顾性分析昆明市儿童医院2020年1月1日至2022年12月31日确诊的131例EV71阳性手足口病患儿临床资料,选取临床确诊手足口病患者的粪便做肠道病毒核酸检测,对结果为肠道病毒通用型阳性并且EV71阳性手足口病患儿的临床病例资料及其EV71疫苗接种情况进行分析。   结果  检出的131例阳性病例中包括116例轻症和15例重症,其中80例接受电话咨询其EV71疫苗接种情况的患儿中,17例接种疫苗,63例未接种疫苗,接种疫苗的患儿皆为轻症患者,未接种疫苗的患儿中有6例为重症患者。2020至2022年,每年4~9月为EV71阳性手足口病检出率高峰期(χ2 = 125.705,P = 0.000),小于1岁及大于5岁患儿阳性检出率高于1~5岁年龄段患儿(χ2 = 8.765,P = 0.033),男女阳性检出率无明显差异(χ2 = 1.221,P = 0.269)。   结论  接种EV71疫苗对减少重症病例出现具有重要意义。结合目前云南昆明地区该疫苗接种率仍然偏低的情况,提示相关机构仍需继续加大EV71疫苗接种的宣传力度。
  • 九十年代初期的研究表明,在动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)形成过程中,动脉内膜和外膜层聚集着肥大细胞(mast cells,MCs),首次提出MCs参与AS进程[1]

    血管的微环境一旦发生变化,炎性细胞便会从血管外膜的滋养血管中渗出,参与疾病的变化[2-3]。MCs激活时释放出来的趋化因子、细胞因子、组胺、白三烯等炎症因子[4]使血管的通透性增加,导致单核巨噬细胞和淋巴细胞聚集到斑块处[5],释放出大量的中性蛋白酶,可以加速低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)进入到血管内膜局部并聚集[6],促进AS斑块形成。

    在骨髓细胞向MCs分化及活化过程中白细胞介素3(interleukin-3,IL-3)和干细胞因子(stem cell factor,SCF)起到重要作用[7-8]。本研究旨在通过提取乳兔骨髓细胞,利用IL-3、SCF、β-巯基乙醇联合作用诱导培养骨髓来源肥大细胞并鉴定其纯度与活性,为进一步研究肥大细胞与AS的关系提供依据。

    IL-3、SCF(美国Peprotech公司);FBS、DMEM、DMEM/F12、RPMI-1640(美国Gibco公司);实验动物:2周龄乳兔,昆明医科大学实验动物学部,环境条件符合国家实验动物环境及设施标准要求,室内保持安静、清洁、干燥和通风。自由饮水。实验动物使用许可证号:SCXK(滇)2015-0002。

    1.2.1   兔骨髓细胞的获取

    麻醉:(经2周龄乳兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠,1 mL/kg)→浸泡(75%C2H5OH,10 min)→剥离(后肢皮肤切开,逐层分离,剥离肌肉)→暴露股骨→取出→浸泡(75% C2H5OH的无菌培养皿中浸泡3~5 min)→股骨两端剪去→吹打骨髓(吸取DMEM高糖培养基后吹打骨髓,股骨变白)→获取细胞(1000 r/min,5 min。如果在获取的细胞中有较多红细胞,则应用红细胞裂解液进行处理)→培养体系(含84 mL DMEM高糖培养基、15 mL FBS、1 mL双抗)。

    1.2.2   细胞的培养

    接种到T25瓶中(含DMEM高糖培养基)→隔天换液→细胞铺满→消化细胞→新培养瓶→贴壁→改用F12诱导培养基(含84 mL DMEM/F12、15 mL FBS、1 mL双抗、10 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3及0、10×10-5 mol/L的β-巯基乙醇)→放置37 ℃、5% CO2 饱和湿度环境→隔天换液→镜下观察细胞有变圆→更换为1640促成熟培养基(含84 mL RPMI 1640、15 mFBS、1 mL双抗、10 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3及0、10×10-5 mol/L的β-巯基乙醇)→7 d换液→直至细胞诱导成熟。

    1.2.3   肥大细胞功能学鉴定

    诱导成熟的重悬细胞液→载玻片→干燥→甲苯胺蓝染色→95% C2H5OH脱色→清洗→镜下观察。

    1.2.4   肥大细胞形态学鉴定

    通过光镜下观察不同培养时间的细胞形态,直至诱导成熟。

    消化细胞→洗2次(PBS)→细胞密度1×10 7个/mL→每管100 μL→单染管各加入5.0 μL的 CD117-PE抗体及FcεR1α-FITC抗体→双染管加两种抗体→空白对照管(无抗体)→避光孵育30 min→每管加1 mL PBS→离心10 min(400 g)→去上清→上法洗涤1次→去上清→每管加100 μL PBS→检测。

    2 d后开始出现以形态为长梭形的贴壁细胞;7 d时:细胞基本将培养瓶铺满;2周时:细胞逐渐变形;4周时:细胞基本变为圆形,悬浮细胞变多;6周时:细胞基本变为类圆形,且形态均匀具有折光性(图1)。

    图  1  肥大细胞变形过程(100×)
    A:7 d时长梭形贴壁细胞;B:2周时细胞逐渐变形;C:4周时细胞逐渐变圆;D:6周时变为类圆形细胞。
    Figure  1.  Changes in mast cells(100×)

    培养6周细胞成熟后利用甲苯胺蓝染色:可以观察到细胞质为紫红色,细胞核为蓝色。异染颗粒的细胞加入β-巯基乙醇比不加入β-巯基乙醇的能得到更多(图2)。

    图  2  甲苯胺蓝染色(100×)
    A:β-巯基乙醇浓度0 mol/L;B:β-巯基乙醇浓度10×10-5 mol/L。
    Figure  2.  Toluene blue staining(100×)

    培养6周收集细胞,利用流式细胞术检测细胞表面CD117及FcεR1α的表达情况,加入β-巯基乙醇双阳性细胞的比例达96.2%,大于不加入β-巯基乙醇的(图3),且与不加β-巯基乙醇相比有统计学意义(P < 0.05),见表1

    图  3  流式细胞仪检测细胞的双阳性率
    A:β-巯基乙醇为0 mol/L;B:β-巯基乙醇为10×10-5 mol/L。
    Figure  3.  Double positive rate of cells detected by flow cytometry
    表  1  不同浓度β-巯基乙醇诱导后CD117+ FcεRIα+肥大细胞的比例
    Table  1.  The proportion of CD117+ FcεRIα+ mast cells induced by different concentrations of β-mercaptoethanol
    β-巯基乙醇
    (mol/L)
    实验次数CD117+ FcεRIα+
    肥大细胞的比例(%)
    P
    0548.97 ± 3.120.7069
    10×10−55 95.64 ± 4.66#
      与β-巯基乙醇浓度为0 mol/L比较,#P < 0.05。
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    在正常人的心脏、主动脉及脂肪组织中有少量的MCs存在,当人类发生疾病时MCs的数量就会增多,比如AS。近年来,研究表明MCs在AS的发生、发展及斑块稳定性中有着重要作用[9]

    当下有研究认为MCs是利用其表面的趋化因子受体-3与AS斑块中表达的嗜酸细胞活化CC趋化因子亚族中趋化因子配体-11结合而向病变部位聚集[10]。MCs起源于骨髓造血干细胞[11],促进MCs成熟的分子主要有SCF和神经生长因子(nerve growthfactor,NGF)[17],SCF可能在MCs向受累区域聚集发挥作用,而MCs侵入受累区域可能会进一步导致更多的炎性细胞浸润,促进AS斑块形成。

    IL-3又被叫做肥大细胞生长因子,在MCs的生长、分化、迁移和效应中具有重要作用。活化T细胞、天然杀伤(NK)细胞和MCs都可产生IL-3,且对于SCF在MCs前体的发生、发展、扩增具有促进意义[12-13]。SCF的配体CD117(c-kit)除在其表面外,各种造血祖细胞中均可存在。MCs发挥重要表面标志的是FcεRIα,但FcεRIα还表达于嗜酸性粒细胞等细胞表面,只有MCs同时表达CD117和FcεRIα[14]。甲苯胺蓝染色是一种常用于识别及判断MCs功能状态的方法,同时也是MCs的特异性染色,可染细胞核为蓝色,胞质内为异染性紫红色颗粒,说明其具有吞噬功能[15]。通过甲苯胺蓝染色和流式细胞仪检测结果对诱导获得的MCs的纯度进行鉴定,就目前来说,利用兔的骨髓间质干细胞来诱导培养MCs的报道是极少的。

    本研究选用2周龄的乳兔来获取骨髓间质干细胞,因为当兔龄大于或者小于2周龄时,笔者发现细胞生长速度变得缓慢,可能是2周龄的骨髓间质干细胞的活性更好,更有利于细胞的培养。当IL-3浓度10 ng/mL、SCF浓度为10 ng/mL,加入β-巯基乙醇时:甲苯胺蓝染色及流式检测均较不加入β-巯基乙醇时可以获取更多、双阳性率更高的MSc,原因可能为β-巯基乙醇作为一种还原剂,在降低氧对细胞产生氧化损伤的同时促进干细胞生长。所以该培养体系是一种良好的体外诱导培养体系,其操作简单,且能获得更加成熟、更具有典型特征的MCs,为下一步对兔行进炎性损伤研究提供了优势。综上所述,本研究利用形态学、功能学2个方面对诱导的兔骨髓来源MCs进行鉴定,培养出的细胞不仅具有成熟MCs的生物学特性,还具有其功能,这便为后续的基础研究及临床研究奠定基础。

  • 表  1  2020至2022年EV71阳性手足口病患儿检出例数分布情况

    Table  1.   Distribution detected cases of HFMD children with EV71 positive from 2020 to 2022

    年份检测数(n阳性数(n阳性率(%)χ2P
    2020646230.046136.0550.000*
    20213006772.562
    20223638511.402
    合计131061311.000
      *P < 0.05。
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    表  2  2020~2022年各月份EV71阳性手足口病患儿检出例数分布情况

    Table  2.   Distribution detected cases of HFMD children with EV71 positive in different months from 2020 to 2022

    月份检测数
    n
    阳性数
    n
    阳性率
    (%)
    χ2P
    1月 714 2 0.280 125.705 <0.001*
    2月 151 1 0.662
    3月 145 0 0.000
    4月 267 9 3.371
    5月 620 25 4.032
    6月 1549 30 1.937
    7月 1722 22 1.278
    8月 655 9 1.374
    9月 1128 16 1.418
    10月 2373 11 0.464
    11月 2467 4 0.162
    12月 1315 2 0.152
    合计 13106 131 1.000
      *P < 0.05。
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    表  3  2020至2022年EV71阳性手足口病患儿年龄分布情况

    Table  3.   Age distribution of HFMD children with EV71 positive from 2020 to 2022

    年龄(岁)检测数(n阳性数(n阳性率(%)χ2P
    <1824121.4568.7650.033*
    1~38657770.889
    4~52605240.921
    6~171020181.765
    合计131061311.000
      *P < 0.05。
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    表  4  2020至2022年EV71阳性手足口病患儿性别分布情况

    Table  4.   Sex distribution of HFMD children with EV71 positive from 2020 to 2022

    性别检测数(n阳性数(n阳性率(%)χ2P
    7827720.9201.2210.269
    5279591.118
    合计131061311.000
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    表  5  131例EV71阳性手足口病患儿临床表现

    Table  5.   Clinical manifestations of 131 HFMD children with EV71 positive

    临床表现阳性数(n发生率(%)
    皮疹 130 99.237
    发热 50 38.168
    易惊 15 11.450
    四肢抖动 10 7.634
    呕吐(非喷射性) 9 6.870
    嗜睡 2 1.527
    心率增快 32 24.427
    高血压 5 3.817
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    表  6  EV71阳性手足口病患儿是否接种EV71疫苗的情况分析

    Table  6.   Analysis of whether HFMD children with EV71 positive have been vaccinated with EV71 vaccine

    是否接种EV71疫苗患儿人数(n构成比(%)
    接种1721.250
    未接种6378.750
    合计80100
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    表  7  EV71阳性手足口病患儿临床表现与是否接种EV71疫苗的比较分析[n(%)]

    Table  7.   Comparative analysis of clinical manifestations and whether EV71 vaccine is administered in HFMD children with EV71 positive [n(%)]

    临床表现接种疫苗未接种疫苗χ2P
    皮疹部位 手皮疹 16(94.118) 56(88.889) 0.406 0.939
    足皮疹 11(64.706) 40(63.492)
    口皮疹 11(64.706) 47(74.603)
    其他部位皮疹 1(5.882) 6(9.524)
    神经系统 易惊 1(5.882) 8(12.698) 2.046 0.724
    四肢抖动 1(5.882) 6(9.524)
    发热 7(41.176) 21(33.333)
    呕吐(非喷射性) 2(11.765) 5(7.937)
    嗜睡 1(5.882) 1(1.587)
    心血管系统 高血压 0(0.000) 5(7.937) 0.691 1.000
    心率增快 2(11.765) 14(22.222)
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    表  8  EV71阳性手足口病患儿病情与是否接种EV71疫苗的比较分析

    Table  8.   Comparative analysis between clinical condition of HFMD children with EV71 positive with the vaccination of EV71 vaccine

    临床病情接种(n未接种(nχ2P
    轻症病例17571.7500.333
    重症病例06
    合计1763
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出版历程
  • 收稿日期:  2023-10-12
  • 网络出版日期:  2023-12-22
  • 刊出日期:  2023-12-25

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