Clinical Characteristics of 131 Children with Hand,Foot,and Mouth Disease Infected with EV71 and Preventive Effect of EV71 Vaccination
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摘要:
目的 分析EV71阳性手足口病患儿临床特征及其EV71疫苗接种情况,探索重症发生和接种EV71疫苗的预防效果的关系。 方法 回顾性分析昆明市儿童医院2020年1月1日至2022年12月31日确诊的131例EV71阳性手足口病患儿临床资料,选取临床确诊手足口病患者的粪便做肠道病毒核酸检测,对结果为肠道病毒通用型阳性并且EV71阳性手足口病患儿的临床病例资料及其EV71疫苗接种情况进行分析。 结果 检出的131例阳性病例中包括116例轻症和15例重症,其中80例接受电话咨询其EV71疫苗接种情况的患儿中,17例接种疫苗,63例未接种疫苗,接种疫苗的患儿皆为轻症患者,未接种疫苗的患儿中有6例为重症患者。2020至2022年,每年4~9月为EV71阳性手足口病检出率高峰期(χ2 = 125.705,P = 0.000),小于1岁及大于5岁患儿阳性检出率高于1~5岁年龄段患儿(χ2 = 8.765,P = 0.033),男女阳性检出率无明显差异(χ2 = 1.221,P = 0.269)。 结论 接种EV71疫苗对减少重症病例出现具有重要意义。结合目前云南昆明地区该疫苗接种率仍然偏低的情况,提示相关机构仍需继续加大EV71疫苗接种的宣传力度。 Abstract:Objective To analyze the clinical features of children with EV71 positive hand, foot, and mouth disease(HFMD) and EV71 vaccination, and to explore the relationship between the occurrence of severe disease and the preventive effect of EV71 vaccine. Methods From January 1, 2020 to December 31, 2022, the clinical data of 131 children with HFMD diagnosed with EV71 infection in Kunming Children's Hospital were retrospectively analyzed. The stool samples of patients with clinically confirmed HFMD were selected for enterovirus nucleic acid detection. The clinical data and EV71 vaccination status of children with universal enterovirus positive and EV71 positive HFMD were analyzed. Results Among the 131 positive cases detected, there were 116 mild cases and 15 severe cases. Among the 80 children who received phone consultations about their EV71 vaccine status, 17 were vaccinated, and 63 were not vaccinated. The vaccinated children were all mild cases, while among the unvaccinated children, 6 were severe cases. From 2020 to 2022, the period from April to September each year is the peak period for detecting EV71-positive hand, foot, and mouth disease(χ2 = 125.705, P = 0.000). The positive detection rate for children under 1 year old and over 5 years old was higher than that for children aged 1 to 5 years(χ2 = 8.765, P = 0.033), and there was no significant difference in the positive detection rate between boys and girls(χ2 = 1.221, P = 0.269). Conclusion EV71 vaccine is of great significance in reducing the occurrence of severe cases. Combined with the current low vaccination rate in Kunming, Yunnan Province, it is suggested that relevant institutions should continue to increase the publicity of EV71 vaccination. -
Key words:
- EV71 positive /
- Hand foot, and mouth disease /
- EV71 vaccine
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九十年代初期的研究表明,在动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)形成过程中,动脉内膜和外膜层聚集着肥大细胞(mast cells,MCs),首次提出MCs参与AS进程[1]。
血管的微环境一旦发生变化,炎性细胞便会从血管外膜的滋养血管中渗出,参与疾病的变化[2-3]。MCs激活时释放出来的趋化因子、细胞因子、组胺、白三烯等炎症因子[4]使血管的通透性增加,导致单核巨噬细胞和淋巴细胞聚集到斑块处[5],释放出大量的中性蛋白酶,可以加速低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)进入到血管内膜局部并聚集[6],促进AS斑块形成。
在骨髓细胞向MCs分化及活化过程中白细胞介素3(interleukin-3,IL-3)和干细胞因子(stem cell factor,SCF)起到重要作用[7-8]。本研究旨在通过提取乳兔骨髓细胞,利用IL-3、SCF、β-巯基乙醇联合作用诱导培养骨髓来源肥大细胞并鉴定其纯度与活性,为进一步研究肥大细胞与AS的关系提供依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
IL-3、SCF(美国Peprotech公司);FBS、DMEM、DMEM/F12、RPMI-1640(美国Gibco公司);实验动物:2周龄乳兔,昆明医科大学实验动物学部,环境条件符合国家实验动物环境及设施标准要求,室内保持安静、清洁、干燥和通风。自由饮水。实验动物使用许可证号:SCXK(滇)2015-0002。
1.2 方法
1.2.1 兔骨髓细胞的获取
麻醉:(经2周龄乳兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠,1 mL/kg)→浸泡(75%C2H5OH,10 min)→剥离(后肢皮肤切开,逐层分离,剥离肌肉)→暴露股骨→取出→浸泡(75% C2H5OH的无菌培养皿中浸泡3~5 min)→股骨两端剪去→吹打骨髓(吸取DMEM高糖培养基后吹打骨髓,股骨变白)→获取细胞(1000 r/min,5 min。如果在获取的细胞中有较多红细胞,则应用红细胞裂解液进行处理)→培养体系(含84 mL DMEM高糖培养基、15 mL FBS、1 mL双抗)。
1.2.2 细胞的培养
接种到T25瓶中(含DMEM高糖培养基)→隔天换液→细胞铺满→消化细胞→新培养瓶→贴壁→改用F12诱导培养基(含84 mL DMEM/F12、15 mL FBS、1 mL双抗、10 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3及0、10×10-5 mol/L的β-巯基乙醇)→放置37 ℃、5% CO2 饱和湿度环境→隔天换液→镜下观察细胞有变圆→更换为1640促成熟培养基(含84 mL RPMI 1640、15 mFBS、1 mL双抗、10 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3及0、10×10-5 mol/L的β-巯基乙醇)→7 d换液→直至细胞诱导成熟。
1.2.3 肥大细胞功能学鉴定
诱导成熟的重悬细胞液→载玻片→干燥→甲苯胺蓝染色→95% C2H5OH脱色→清洗→镜下观察。
1.2.4 肥大细胞形态学鉴定
通过光镜下观察不同培养时间的细胞形态,直至诱导成熟。
消化细胞→洗2次(PBS)→细胞密度1×10 7个/mL→每管100 μL→单染管各加入5.0 μL的 CD117-PE抗体及FcεR1α-FITC抗体→双染管加两种抗体→空白对照管(无抗体)→避光孵育30 min→每管加1 mL PBS→离心10 min(400 g)→去上清→上法洗涤1次→去上清→每管加100 μL PBS→检测。
2. 结果
2.1 光镜下观察肥大细胞生长形态
2 d后开始出现以形态为长梭形的贴壁细胞;7 d时:细胞基本将培养瓶铺满;2周时:细胞逐渐变形;4周时:细胞基本变为圆形,悬浮细胞变多;6周时:细胞基本变为类圆形,且形态均匀具有折光性(图1)。
2.2 肥大细胞的甲苯胺蓝染色
培养6周细胞成熟后利用甲苯胺蓝染色:可以观察到细胞质为紫红色,细胞核为蓝色。异染颗粒的细胞加入β-巯基乙醇比不加入β-巯基乙醇的能得到更多(图2)。
2.3 流式细胞术检测肥大细胞
培养6周收集细胞,利用流式细胞术检测细胞表面CD117及FcεR1α的表达情况,加入β-巯基乙醇双阳性细胞的比例达96.2%,大于不加入β-巯基乙醇的(图3),且与不加β-巯基乙醇相比有统计学意义(P < 0.05),见表1。
表 1 不同浓度β-巯基乙醇诱导后CD117+ FcεRIα+肥大细胞的比例Table 1. The proportion of CD117+ FcεRIα+ mast cells induced by different concentrations of β-mercaptoethanolβ-巯基乙醇
(mol/L)实验次数 CD117+ FcεRIα+
肥大细胞的比例(%)P 0 5 48.97 ± 3.12 0.7069 10×10−5 5 95.64 ± 4.66# 与β-巯基乙醇浓度为0 mol/L比较,#P < 0.05。 3. 讨论
在正常人的心脏、主动脉及脂肪组织中有少量的MCs存在,当人类发生疾病时MCs的数量就会增多,比如AS。近年来,研究表明MCs在AS的发生、发展及斑块稳定性中有着重要作用[9]。
当下有研究认为MCs是利用其表面的趋化因子受体-3与AS斑块中表达的嗜酸细胞活化CC趋化因子亚族中趋化因子配体-11结合而向病变部位聚集[10]。MCs起源于骨髓造血干细胞[11],促进MCs成熟的分子主要有SCF和神经生长因子(nerve growthfactor,NGF)[17],SCF可能在MCs向受累区域聚集发挥作用,而MCs侵入受累区域可能会进一步导致更多的炎性细胞浸润,促进AS斑块形成。
IL-3又被叫做肥大细胞生长因子,在MCs的生长、分化、迁移和效应中具有重要作用。活化T细胞、天然杀伤(NK)细胞和MCs都可产生IL-3,且对于SCF在MCs前体的发生、发展、扩增具有促进意义[12-13]。SCF的配体CD117(c-kit)除在其表面外,各种造血祖细胞中均可存在。MCs发挥重要表面标志的是FcεRIα,但FcεRIα还表达于嗜酸性粒细胞等细胞表面,只有MCs同时表达CD117和FcεRIα[14]。甲苯胺蓝染色是一种常用于识别及判断MCs功能状态的方法,同时也是MCs的特异性染色,可染细胞核为蓝色,胞质内为异染性紫红色颗粒,说明其具有吞噬功能[15]。通过甲苯胺蓝染色和流式细胞仪检测结果对诱导获得的MCs的纯度进行鉴定,就目前来说,利用兔的骨髓间质干细胞来诱导培养MCs的报道是极少的。
本研究选用2周龄的乳兔来获取骨髓间质干细胞,因为当兔龄大于或者小于2周龄时,笔者发现细胞生长速度变得缓慢,可能是2周龄的骨髓间质干细胞的活性更好,更有利于细胞的培养。当IL-3浓度10 ng/mL、SCF浓度为10 ng/mL,加入β-巯基乙醇时:甲苯胺蓝染色及流式检测均较不加入β-巯基乙醇时可以获取更多、双阳性率更高的MSc,原因可能为β-巯基乙醇作为一种还原剂,在降低氧对细胞产生氧化损伤的同时促进干细胞生长。所以该培养体系是一种良好的体外诱导培养体系,其操作简单,且能获得更加成熟、更具有典型特征的MCs,为下一步对兔行进炎性损伤研究提供了优势。综上所述,本研究利用形态学、功能学2个方面对诱导的兔骨髓来源MCs进行鉴定,培养出的细胞不仅具有成熟MCs的生物学特性,还具有其功能,这便为后续的基础研究及临床研究奠定基础。
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表 1 2020至2022年EV71阳性手足口病患儿检出例数分布情况
Table 1. Distribution detected cases of HFMD children with EV71 positive from 2020 to 2022
年份 检测数(n) 阳性数(n) 阳性率(%) χ2 P 2020 6462 3 0.046 136.055 0.000* 2021 3006 77 2.562 2022 3638 51 1.402 合计 13106 131 1.000 *P < 0.05。 表 2 2020~2022年各月份EV71阳性手足口病患儿检出例数分布情况
Table 2. Distribution detected cases of HFMD children with EV71 positive in different months from 2020 to 2022
月份 检测数
(n)阳性数
(n)阳性率
(%)χ2 P 1月 714 2 0.280 125.705 <0.001* 2月 151 1 0.662 3月 145 0 0.000 4月 267 9 3.371 5月 620 25 4.032 6月 1549 30 1.937 7月 1722 22 1.278 8月 655 9 1.374 9月 1128 16 1.418 10月 2373 11 0.464 11月 2467 4 0.162 12月 1315 2 0.152 合计 13106 131 1.000 *P < 0.05。 表 3 2020至2022年EV71阳性手足口病患儿年龄分布情况
Table 3. Age distribution of HFMD children with EV71 positive from 2020 to 2022
年龄(岁) 检测数(n) 阳性数(n) 阳性率(%) χ2 P <1 824 12 1.456 8.765 0.033* 1~3 8657 77 0.889 4~5 2605 24 0.921 6~17 1020 18 1.765 合计 13106 131 1.000 *P < 0.05。 表 4 2020至2022年EV71阳性手足口病患儿性别分布情况
Table 4. Sex distribution of HFMD children with EV71 positive from 2020 to 2022
性别 检测数(n) 阳性数(n) 阳性率(%) χ2 P 男 7827 72 0.920 1.221 0.269 女 5279 59 1.118 合计 13106 131 1.000 表 5 131例EV71阳性手足口病患儿临床表现
Table 5. Clinical manifestations of 131 HFMD children with EV71 positive
临床表现 阳性数(n) 发生率(%) 皮疹 130 99.237 发热 50 38.168 易惊 15 11.450 四肢抖动 10 7.634 呕吐(非喷射性) 9 6.870 嗜睡 2 1.527 心率增快 32 24.427 高血压 5 3.817 表 6 EV71阳性手足口病患儿是否接种EV71疫苗的情况分析
Table 6. Analysis of whether HFMD children with EV71 positive have been vaccinated with EV71 vaccine
是否接种EV71疫苗 患儿人数(n) 构成比(%) 接种 17 21.250 未接种 63 78.750 合计 80 100 表 7 EV71阳性手足口病患儿临床表现与是否接种EV71疫苗的比较分析[n(%)]
Table 7. Comparative analysis of clinical manifestations and whether EV71 vaccine is administered in HFMD children with EV71 positive [n(%)]
临床表现 接种疫苗 未接种疫苗 χ2 P 皮疹部位 手皮疹 16(94.118) 56(88.889) 0.406 0.939 足皮疹 11(64.706) 40(63.492) 口皮疹 11(64.706) 47(74.603) 其他部位皮疹 1(5.882) 6(9.524) 神经系统 易惊 1(5.882) 8(12.698) 2.046 0.724 四肢抖动 1(5.882) 6(9.524) 发热 7(41.176) 21(33.333) 呕吐(非喷射性) 2(11.765) 5(7.937) 嗜睡 1(5.882) 1(1.587) 心血管系统 高血压 0(0.000) 5(7.937) 0.691 1.000 心率增快 2(11.765) 14(22.222) 表 8 EV71阳性手足口病患儿病情与是否接种EV71疫苗的比较分析
Table 8. Comparative analysis between clinical condition of HFMD children with EV71 positive with the vaccination of EV71 vaccine
临床病情 接种(n) 未接种(n) χ2 P 轻症病例 17 57 1.750 0.333 重症病例 0 6 合计 17 63 -
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