Metabolomics of Siha Supernatant in Cervical Cancer Cells with Down-regulated HPV16 E6/E7 Expression
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摘要:
目的 基于核磁共振氢谱（1H NMR）代谢组学筛选抑制HPV16 E6/E7表达，检测宫颈癌Siha细胞中差异代谢物以及相关通路，以明确感染高危型HPV16宫颈癌发生的关键代谢标志物。 方法 通过RNAi片段转染Siha细胞下调E6/E7表达，分为正常对照组（Siha细胞）、空载组（si-NON）、si-E6 组与si-E7组，并验证其转染效率。利用1H NMR 代谢组学技术揭示干扰Siha细胞中E6/E7表达后所涉及的差异代谢物；结合MetaboAnalyst 5.0在线软件，得到改变的差异性代谢物和相关的代谢途径。 结果 荧光倒置显微镜观察细胞荧光存在；Western blotting检测结果显示，与Siha组比较，si-E6 组与si-E7组中E6/E7的表达量降低（F=145.8，P<0.001）；下调E6/E7表达后，检测13种共有差异代谢物，包括异亮氨酸（Isoleucine），亮氨酸（Leucine），缬氨酸（Valine）；MetaboAnalyst 5.0在线软件分析结果提示，以上代谢物主要涉及氨酰-tRNA生物化学合成途径；异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的生物化学合成途径；酪氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸的生物化学合成等10条代谢途径。 结论 HPV16感染后通过改变葡萄糖及氨基酸相关代谢促进宫颈癌的进展，为宫颈癌的防治提供理论依据。 -
关键词:
- HPV16 E6/E7 /
- 宫颈癌 /
- 代谢组学
Abstract:Objective To detecte the differential metabolites and related pathways in Siha cells of cervical cancer by screening the inhibition of HPV16 E6/E7 expression based on 1H NMR metabolomics so as to identify the key metabolic markers involved in the development of high-risk HPV16 cervical cancer. Methods Siha cells were transfected with RNAi fragments to down-regulate the expression of E6/E7, which were divided into the normal control group（Siha cells）, no-load group（si-NON）, si-E6 group and si-E7 group, and their transfection efficiency was verified. 1H NMR metabolomics was used to reveal the differential metabolites involved in interfering E6/E7 expression in Siha cells. Combined with MetaboAnalyst 5.0 online software, differential metabolites and related metabolic pathways were obtained. Results Fluorescence was observed by inverted fluorescence microscope. Western blotting results showed that compared with Siha group, the expression of E6/E7 in si-E6 group and si-E7 group was decreased（F=145.8, P < 0.001）. After down-regulating the expression of E6/E7, 13 common differential metabolites, including Isoleucine, Leucine and valine, were detected. The results of MetaboAnalyst 5.0 online software analysis suggested that the above metabolites were mainly involved in the biochemical synthesis pathway of aminoacyl-trNA, biochemical synthesis pathway of isoleucine, Leucine and valine; There were 10 metabolic pathways of tyrosine, phenylalanine and tryptophan biochemical synthesis. Conclusion After HPV16 infection, changes of glucose and amino acid metabolism can promote the progression of cervical cancer, which provide a theoretical basis for the prevention and treatment of cervical cancer. -
Key words:
- HPV E6/E7 /
- Cervical cancer /
- Metabolomics
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子宫颈癌（cervical cancer，CC）作为女性恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率持续上升且呈现低龄化，因而受到广泛关注[1]。宫颈癌恶性进展中主要是受到高危型人乳头瘤病毒HPV16、18型的持续感染，导致癌基因E6和E7蛋白的活化，进而影响多条信号途径，促进癌细胞持续增殖，最终形成宫颈癌[2-3]。研究表明，E6和E7对葡萄糖[4-5]、脂肪酸[6]、氨基酸[7]代谢具有有一定的影响，宫颈癌细胞的增殖、转移离不开代谢产能的供给。因此，本研究探讨HPV E6/E7蛋白的活化与宫颈癌相关能量代谢改变的关系，从而对宫颈癌的筛查、治疗、预后提供有利的理论依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 细胞
人源宫颈癌Siha（HPV16+）细胞，购买于武汉Pricella生命科技有限公司。
1.1.2 主要试剂
HPV16 E6抗体（sc-460）、HPV16 E7 ED17抗体 （sc-6981）购买于美国 Santa Cruz Biotechnology 公司。FBS 胎牛血清、青-链霉素、DMEM培养基购买于BI公司，X-tremeGENE™ HP DNA转染试剂盒购买于默克生命科学公司，每组质粒由海吉凯生物科技有限公司构建，RNAi片段引物序列如下，见表1。
表 1 E6 RNAi、E7 RNAi片段引物序列Table 1. Primer sequences of E6 RNAi and E7 RNAi fragments基因名 引物序列 E6 RNAi 上游 TGCTGATGTATAGTTGTTTGCAGCTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGCTGCACAACTATACAT 下游 CCTGATGTATAGTTGTGCAGCTCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGAGCTGCAAACAACTATACATC E7 RNAi 上游 TGCTGTTGTAATGGGCTCTGTCCGGTGTTTTGGCCACTGACTGACACCGGACAGCCCATTACAA 下游 CCTGTTGTAATGGGCTGTCCGGTGTCAGTCAGTGGCCAAAACACCGGACAGAGCCCATTACAAC 1.2 实验方法
1.2.1 建立宫颈癌细胞Siha的RNAi载体转染
siRNA片段、对照（si-NON）构建于由吉凯基因科技有限公司（上海）。本实验根据默克公司生产的质粒转染试剂（名称：X-tremeGENE HP DNA）说明书，其官网http://www.powerful-transfection.com/尚写的详细操作实验步骤，首先调整Siha细胞生长状态和所需的细胞数量进行试验。其次按照3 μL X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent添加至1 μg质粒DNA/100uL MEM培养基中的比例进行转染。48 h后应用莱卡荧光倒置显微镜（Leica DMIL LED）观察Siha细胞转染效率，应用Western blot验证。
1.2.2 细胞培养
宫颈癌Siha培养于DMEM完全培养基，包含10%FBS及2%PS，培养于37℃、5%的CO2培养箱内。
1.2.3 核磁共振检测细胞上清液
-80℃冰箱中取出样品，准备在室温中4℃的冰水混合物中逐渐解冻，准备无酶EP管，并加入450 μL的每组细胞上清液，并加入DSS缓冲溶液50 μl（配置比例：0.045MNaH2PO4+0.045MK2HPO4inD2O）。本实验中应用的实验仪器微波1HNMR，并采用NOESYPRESAT-ID脉冲序列进行上清液内的氢谱测定，内标为DSS，将化学位移设定值为0 ppm。最后采用预饱和方式进一步抑制水峰，其时间设置为2 s，采样点数为32 k，谱宽需为10 000 Hz，扫描次数设为为126次，采样时间平均1.64 s，测试温度为恒温（25℃）。
1.2.4 代谢谱数据分析方法
所有1HNMR谱需要经过相位和基线校正，并用增宽因子为0.5 Hz的指数窗函数进行处理。数据用SIMCA-P+11软件进行上清代谢数据的OPLS-DA分析。各组细胞上清中差异性的代谢物需要经过OPLS-DA分析，并确定从中得到其变量重要性的参数（variable importance in the projection，VIP）值，要求VIP>1。
1.3 统计学处理
本文所涉及的实验结果均经过3次独立实验的验证后取平均值。统计学分析采用SPSS17.0软件。定量资料以（$ {{ \bar x \pm s}} $）表示，多组数据间的对比需采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 E6-RNAi和E7-RNAi的细胞模型建立
通过荧光倒置显微镜对转染HPV16编码E6或E7基因序列特异性RNAi片段的宫颈癌细胞进行观察，明确转染效果见图1A。Western blotting 验证各组细胞E6/E7蛋白表达量。结果显示，与Siha组比较，si-E6 组与si-E7组中E6/E7的表达量降低（F=145.8，P<0.001，图1B，图1C）。
图 1 检测Siha细胞内E6-RNAi和E7-RNAi的转染效率A：RNAi细胞模型的激光共聚焦成像观察（48 h）；B：Western blot检测E6、E7蛋白表达量；C：E6、E7蛋白相对表达量；与Siha 组比较，***P < 0.001。Figure 1. The transfection efficiency of E6-RNAi and E7-RNAi in Siha cells was detected2.2 E6、E7蛋白表达下调对宫颈癌细胞上清代谢谱变化的影响
利用1H-NMR代谢谱分析细胞上清液，在si-E6、si-E7组和Siha组中共有差异代谢物13种，见图2。异亮氨酸，亮氨酸，缬氨酸，酪氨酸，β-羟丁酸，苯丙氨酸，甲酸酪氨酸，α-葡萄糖，β-葡萄糖，乙酸，苯丙氨酸含量下降（P < 0.05）；乳酸，丙氨酸，甲酸含量上升（P < 0.05），见表2。
图 2 RNA干扰后SiHa细胞上清1HNMR谱图A：Siha组1HNMR谱；B：si-NON组1HNMR谱；C：si-E6组1HNMR谱；D：si-E7组1HNMR谱；（1）异亮氨酸；（2）亮氨酸；（3）缬氨酸；（4）乳酸；（5）丙氨酸；（6）酪氨酸；（7）α-葡萄糖；（8）β-葡萄糖；（9）甲酸；（10）β-羟丁酸；（11）乙酸；（12）苯丙氨酸；（13）甲基组氨酸。Figure 2. 1HNMR spectra of SiHa suspention after RNAi表 2 RNA干扰组与非干扰租1HNMR谱经过OPLS-DA分析获得的主要差异性代谢物及其相关系数Table 2. Otherness metabolites of different cell samples using OPLS-DA based on different normalization methods and its correlation coefficients序号 代谢物 化学位移/（mg/L） 归属 相关系数r si-NON/si-/E6 si-NON/si-/E6 Siha/si-E6 Siha/si-E7 1 异亮氨酸 0.93（t） δ-CH3 −0.84 −0.74 −0.93 −0.77 2 亮氨酸 0.95（d），0.97（d） δ-CH3，δ-CH3 −0.88 −0.74 −0.94 −0.83 3 缬氨酸 0.98（d），1.04（d） CH3，CH3，α-CH2 −0.84 −0.79 −0.89 −0.85 4 丙氨酸 1.47（d），3.76（q） CH3，α-CH 0.72 0.47 0.55 0.56 5 酪氨酸 3.95（dd），6.89（d），7.18（d） CH2，α-CH，H3/H5 −0.59 −0.69 −0.92 −0.83 6 苯丙氨酸 7.32（d），7.37（m），7.42（m） H2/H6，H4，H3/H5 −0.59 −0.51 −0.91 −0.84 7 甲基组氨酸 7.03（s），7.74（s） H4，H2 0.65 0.45 0.96 0.91 8 α-葡萄糖 3.53（dd），3.72（dd），5.23（d），3.84（ddd） C-H2，halfCH2−CH6，C-H1 −0.80 −0.87 −0.83 −0.71 9 β-葡萄糖 3.24（t），3.40（t），3.47（ddd），3.70（dd），
3.90（dd），4.64（d），C-H4，C-H5，halfCH2−CH6，C-H1 −0.72 −0.7 −0.81 −0.68 10 乳酸 1.33（d），4.11（q） CH3，CH 0.59 0.58 0.66 0.53 11 乙酸 1.91（s） CH3 −0.54 −0.94 −0.73 −0.69 12 甲酸 8.44（s） CH 0.49 0.41 0.91 0.63 13 β-羟丁酸 1.18（t），4.17（dd） γ-CH3，β-CH −0.63 −0.67 −0.65 s：单峰；d：双重峰；t：三重峰；q：四重峰；m：多重峰；dd：双重双重峰；ddd：双重双重双重峰。 2.3 E6、E7蛋白表达下调对相关代谢通路的影响
利用MetaboAnalyst 5.0在线软件分析，得到与13种差异代谢物相关的变化10条途径（P <0.05），主要分为糖代谢与氨基酸代谢2类。其中氨基酸代谢主要包含：（1）氨酰-tRNA生物合成途径；（2）缬氨酸、亮氨酸以及异亮氨酸生物化学代谢途径；（3）苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物化学合成途径；（4）苯丙氨酸合成途径;（5）缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解途径；（6）苯丙氨酸的代谢途径；（7）酮体的合成与降解途径；（8）泛醌和其他萜类-醌类生物的合成途径。而糖代谢途径主要包括：（1）糖酵解/糖异生途径；（2）丙酮酸的代谢途径，乙醛酸和二羧酸类的代谢途径，见图3，表3。
图 3 下调Siha细胞E6/E7蛋白代谢通路分析图Figure 3. Analysis of down-regulated E6/E7 protein metabolic pathways inSiha cells表 3 下调Siha细胞E6/E7蛋白后10条相关代谢通路Table 3. 10 metabolic pathways associated with down-regulation of E6/E7 protein in SIHA cells代谢通路名称 总计 表达 数目 原始P值 差异倍数 Holm校对 错误检出率 影响 氨酰-tRNA生物合成 48 0.37161 6 0.00000051598 6.2874 0.000043342 0.000043342 0 缬氨酸、亮氨酸和
异亮氨酸的生物合成8 0.061935 3 0.000019458 4.7109 0.001615 0.000817 0 苯丙氨酸、酪氨酸和
色氨酸的生物合成4 0.030968 2 0.000327 3.4854 0.026817 0.009157 1 糖酵解/糖异生 26 0.20129 3 0.000835 3.0784 0.067623 0.017532 0.35714 苯丙氨酸合成途径 10 0.077419 2 0.00239 2.6216 0.19121 0.040153 0.02399 缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解 40 0.30968 3 0.002983 2.5254 0.23565 0.04176 0 苯丙氨酸代谢途径 22 0.17032 2 0.01165 1.9337 0.90873 0.1398 0.06065 丙酮酸代谢途径，
乙醛酸和
二羧酸代谢32 0.24774 2 0.023961 1.6205 1 0.25159 0 酮体的合成与降解 5 0.03871 1 0.038163 1.4184 1 0.35619 0 泛醌和其他萜类-醌生物合成 9 0.069677 1 0.067728 1.1692 1 0.56891 0 3. 讨论
宫颈癌位居女性妇科恶性肿瘤第2位，其不但威胁身心健康也会造成一定的经济负担。新疆地区高发肿瘤包括子宫颈癌，其发病率正呈现为年轻化[8-9]。宫颈癌诱发的主要原因是高危型的人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）2a以上的持续性感染，其中常见于HPV16和18的感染[10]。其机制为HPV的DNA与宿主细胞的DNA整合，通过诱导致癌基因 E6、E7 和调控细胞周期得蛋白存在相互作用，紊乱细胞的周期，从而促进它无限增殖，演变为癌细胞[11]。
近年来，代谢重编程作为癌症标志之一，快速生长的癌细胞可以适应其不断增长的能量需求。癌细胞的是从缺乏营养的环境中获得必要的营养物质，并利用这些营养物质来维持细胞的活力、增殖。癌细胞的异常代谢功能最初是由奥托·瓦博格提出的，对于正常细胞而言，其肿瘤细胞偏向于消耗较多葡萄糖，提出“Warburg effect”[12-13]。自此，众多科学研究集中在与癌症相关其它类型的代谢重编程，如葡萄糖的氧化磷酸化、氨基酸合成和脂质氧化等代谢变化，为寻找癌症进展中其余的潜在的治疗靶点。课题组前期研究发现异常的糖代谢，脂代谢等会影响宫颈癌恶性进展[14-15]。
在宫颈癌进展中，参与糖酵解过程中关键酶如HK2等呈现过表达，促进宫颈癌细胞的生长、转移等恶性行为[16]。研究显示，在肿瘤细胞中，抑制烯醇化酶1（enolase 1，ENO1）表达将抑制宫颈癌Hela细胞发生典型上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）样形态学改变[17]。前期研究发现RACK1通过IGF1R/Akt/mTOR信号通路激活糖酵解途径促进宫颈癌发生淋巴结转移[18]。另1个常见的代谢变化是氨基酸代谢增加，特别是谷氨酰胺代谢。谷氨酰胺是1种主要的能量底物，为癌细胞提供额外的能量来源[19]。在肿瘤细胞中多种特定的氨基酸转运体均过表达，如钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白2（sodium-dependent neutral amino acid transporter 2，SNAT2）、丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运蛋白2（alanine-serine-cysteine transporter 2，ASCT2）溶、质载体家庭6成员14（solute carrier family 6 member 14，SLC6A14）等[20]。若靶向一些氨基酸的转运体，将会抑制其转运氨基酸，记忆布减弱其细胞捏ATP能量代谢。
HPV基因组转录本还含有非编码蛋白，通过蛋白质-蛋白质相互作用，在病毒与宿主的相互作用和感染的发展中发挥关键用途。E6/E7直接促进糖酵解关键蛋白HK2表达[21]，或HPV E6/p53信号通路诱导的miR-34a/LDHA轴调控宫颈癌Warburg效应促进肿瘤的生长和侵袭[22]。故靶向HR-HPV感染对抗糖酵解水平也可成为宫颈癌治疗的有效策略。研究显示，2型转谷氨酰胺酶（transglutaminase 2，TG2）与宫颈癌细胞内HPV16-E6蛋白的表达水平存在相关性，可作为早期识别的重要指标以及判断预后的重要的分子标记物[23]。本次研究通过下调Siha细胞中E6、E7蛋白后，利用1H-NMR对转染后的细胞上清液进行代谢组学分析，筛选出13种共有的并变化的差异代谢物，其中，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，酪氨酸，β-羟丁酸，苯丙氨酸，酪氨酸，α-葡萄糖，β-葡萄糖，乙酸，苯丙氨酸含量下降，乳酸，丙氨酸，甲酸含量上升。以上差异代谢物涉及10条代谢通路，见图3和表3。其主要影响氨基酸代谢以及葡萄糖代谢。提示E6/E7的表达异常与氨基酸代谢和糖代谢紊乱存在相关性。
综上所述，HPV16感染导致宫颈癌发生是一个复杂的过程，本研究结果表明， E6、E7蛋白下调对葡萄糖代谢与氨基酸代谢相关的物质含量有影响，提示HPV16感染与葡萄糖、氨基酸代谢改变之间存在着相互的关联，随着对E6/E7蛋白诱导HPV相关癌症的分子机制研究的不断深入，其可能会成为临床宫颈癌治疗的新靶点。本研究不足是缺少对E6、E7影响葡萄糖、氨基酸代谢的调控机制的研究，后续实验将会继续探索其存在的主要调控机制。
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图 1 检测Siha细胞内E6-RNAi和E7-RNAi的转染效率
A：RNAi细胞模型的激光共聚焦成像观察（48 h）；B：Western blot检测E6、E7蛋白表达量；C：E6、E7蛋白相对表达量；与Siha 组比较，***P < 0.001。
Figure 1. The transfection efficiency of E6-RNAi and E7-RNAi in Siha cells was detected
图 2 RNA干扰后SiHa细胞上清1HNMR谱图
A：Siha组1HNMR谱；B：si-NON组1HNMR谱；C：si-E6组1HNMR谱；D：si-E7组1HNMR谱；（1）异亮氨酸；（2）亮氨酸；（3）缬氨酸；（4）乳酸；（5）丙氨酸；（6）酪氨酸；（7）α-葡萄糖；（8）β-葡萄糖；（9）甲酸；（10）β-羟丁酸；（11）乙酸；（12）苯丙氨酸；（13）甲基组氨酸。
Figure 2. 1HNMR spectra of SiHa suspention after RNAi
图 3 下调Siha细胞E6/E7蛋白代谢通路分析图
Figure 3. Analysis of down-regulated E6/E7 protein metabolic pathways inSiha cells
表 1 E6 RNAi、E7 RNAi片段引物序列
Table 1. Primer sequences of E6 RNAi and E7 RNAi fragments
基因名 引物序列 E6 RNAi 上游 TGCTGATGTATAGTTGTTTGCAGCTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGCTGCACAACTATACAT 下游 CCTGATGTATAGTTGTGCAGCTCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGAGCTGCAAACAACTATACATC E7 RNAi 上游 TGCTGTTGTAATGGGCTCTGTCCGGTGTTTTGGCCACTGACTGACACCGGACAGCCCATTACAA 下游 CCTGTTGTAATGGGCTGTCCGGTGTCAGTCAGTGGCCAAAACACCGGACAGAGCCCATTACAAC 
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表 2 RNA干扰组与非干扰租1HNMR谱经过OPLS-DA分析获得的主要差异性代谢物及其相关系数
Table 2. Otherness metabolites of different cell samples using OPLS-DA based on different normalization methods and its correlation coefficients
序号 代谢物 化学位移/（mg/L） 归属 相关系数r si-NON/si-/E6 si-NON/si-/E6 Siha/si-E6 Siha/si-E7 1 异亮氨酸 0.93（t） δ-CH3 −0.84 −0.74 −0.93 −0.77 2 亮氨酸 0.95（d），0.97（d） δ-CH3，δ-CH3 −0.88 −0.74 −0.94 −0.83 3 缬氨酸 0.98（d），1.04（d） CH3，CH3，α-CH2 −0.84 −0.79 −0.89 −0.85 4 丙氨酸 1.47（d），3.76（q） CH3，α-CH 0.72 0.47 0.55 0.56 5 酪氨酸 3.95（dd），6.89（d），7.18（d） CH2，α-CH，H3/H5 −0.59 −0.69 −0.92 −0.83 6 苯丙氨酸 7.32（d），7.37（m），7.42（m） H2/H6，H4，H3/H5 −0.59 −0.51 −0.91 −0.84 7 甲基组氨酸 7.03（s），7.74（s） H4，H2 0.65 0.45 0.96 0.91 8 α-葡萄糖 3.53（dd），3.72（dd），5.23（d），3.84（ddd） C-H2，halfCH2−CH6，C-H1 −0.80 −0.87 −0.83 −0.71 9 β-葡萄糖 3.24（t），3.40（t），3.47（ddd），3.70（dd），
3.90（dd），4.64（d），C-H4，C-H5，halfCH2−CH6，C-H1 −0.72 −0.7 −0.81 −0.68 10 乳酸 1.33（d），4.11（q） CH3，CH 0.59 0.58 0.66 0.53 11 乙酸 1.91（s） CH3 −0.54 −0.94 −0.73 −0.69 12 甲酸 8.44（s） CH 0.49 0.41 0.91 0.63 13 β-羟丁酸 1.18（t），4.17（dd） γ-CH3，β-CH −0.63 −0.67 −0.65 s：单峰；d：双重峰；t：三重峰；q：四重峰；m：多重峰；dd：双重双重峰；ddd：双重双重双重峰。
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表 3 下调Siha细胞E6/E7蛋白后10条相关代谢通路
Table 3. 10 metabolic pathways associated with down-regulation of E6/E7 protein in SIHA cells
代谢通路名称 总计 表达 数目 原始P值 差异倍数 Holm校对 错误检出率 影响 氨酰-tRNA生物合成 48 0.37161 6 0.00000051598 6.2874 0.000043342 0.000043342 0 缬氨酸、亮氨酸和
异亮氨酸的生物合成8 0.061935 3 0.000019458 4.7109 0.001615 0.000817 0 苯丙氨酸、酪氨酸和
色氨酸的生物合成4 0.030968 2 0.000327 3.4854 0.026817 0.009157 1 糖酵解/糖异生 26 0.20129 3 0.000835 3.0784 0.067623 0.017532 0.35714 苯丙氨酸合成途径 10 0.077419 2 0.00239 2.6216 0.19121 0.040153 0.02399 缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解 40 0.30968 3 0.002983 2.5254 0.23565 0.04176 0 苯丙氨酸代谢途径 22 0.17032 2 0.01165 1.9337 0.90873 0.1398 0.06065 丙酮酸代谢途径，
乙醛酸和
二羧酸代谢32 0.24774 2 0.023961 1.6205 1 0.25159 0 酮体的合成与降解 5 0.03871 1 0.038163 1.4184 1 0.35619 0 泛醌和其他萜类-醌生物合成 9 0.069677 1 0.067728 1.1692 1 0.56891 0
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