Culture of Malignant Pleural Mesothelioma Cells and the Effects of CDKN2B on Cancer Cell
-
摘要:
目的 探讨不同培养条件（RPMI-1640、DMEM和DMEM/F12培养液）对人恶性胸膜间皮瘤（malignant pleural mesothelioma，MPM）组织中分离的MPM细胞传代的影响以及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B（cyclin dependent kinase inhibitor 2B，CDKN2B）对MPM细胞增殖、侵袭和凋亡的作用。 方法 从MPM组织中分离细胞分别用RPMI-1640、DMEM和DMEM/F12培养液培养。CCK-8检测细胞增殖，细胞核及染色体利用瑞氏-吉姆萨染色观察，免疫荧光实验检测MPM标志物Calretinin、CD141、CK5、EMA和WT-1荧光强度。RT-qPCR和Western blot分别检测CDKN2B的mRNA和蛋白表达能力。Transwell检测细胞侵袭能力，流式细胞术检测细胞凋亡率。 结果 建立的MPM细胞在RPMI-1640、DMEM和DMEM/F12培养液中传至第10代仍具有较好的活力，且MPM标志物Calretinin、CD141、CK5、EMA和WT-1在细胞中均表达，MPM细胞在RPMI-1640培养液中活力较为稳定。CDKN2B在MPM细胞中低表达（P < 0.05），过表达CDKN2B显著抑制MPM细胞的增殖（P < 0.05）、侵袭（P < 0.05）和上皮间质转化（P < 0.01），促进细胞凋亡（P < 0.01）。 结论 建立的MPM细胞可在RPMI-1640培养液中稳定传代，CDKN2B可作为MPM诊断和治疗的潜在靶标。 Abstract:Objective To investigate the effects of different culture conditions（RPMI-1640, DMEM and DMEM/F12 medium） on the passage of MPM cells isolated from the tissues of Malignant pleural mesothelioma（MPM）, and to study the effects of CDKN2B on the proliferation, invasion and apoptosis of MPM cells. Methods MPM cells were isolated from MPM tissues and cultured in RPMI-1640, DMEM and DMEM/F12 medium, respectively. Cell proliferation was examined by CCK-8, and the nuclei and chromosomes were observed by Wright-Giemsa staining. Fluorescence intensities of Calretinin, CD141, CK5, EMA and WT-1 were conducted by immunofluorescence assay. The mRNA and protein expression of CDKN2B were detected by RT-qPCR and Western blot, respectively. Transwell was used to detect cell invasion and flow cytometry was used to detect cell apoptosis. Results The established MPM cells showed good viability when passaged to the 10th generation in RPMI-1640, DMEM and DMEM/F12 cultures, and the MPM markers Calretinin, CD141, CK5, EMA and WT-1 were all expressed in the cells. The viability of MPM cells in RPMI-1640 culture medium was relatively stable. CDKN2B was downregulated in MPM cells（P < 0.05）, and overexpression of CDKN2B significantly suppressed the proliferation（P < 0.05）, invasion（P < 0.05） and epithelial interstitial transformation of MPM cells（P < 0.01）, and promoted the apoptosis（P < 0.01）. Conclusion The established MPM cells were stably passaged in RPMI-1640 culture medium, and CDKN2B may be a potential target for the diagnosis and treatment of MPM. -
Key words:
- Malignant pleural mesothelioma /
- Culture conditions /
- RPMI-1640 culture medium /
- CDKN2B /
- Proliferation /
- Invasion
-
艾滋病患者在病程较晚的阶段，尤其是CD4计数低于50/µL时容易发生多种机会性感染[1]。马尔尼菲篮状菌病是由马尔尼菲篮状菌（tlaromyces marneffei，TM）在免疫功能低下的患者中引起的系统性真菌病，是东南亚及华南地区较为常见的真菌病[2- 3]。作为艾滋病患者中一种常见的机会性感染，起病轻微且较为隐匿，临床症状不甚典型导致较晚被发现。当艾滋病患者合并TM时，可出现免疫功能缺陷所引发的多系统损害，患者病死率可达29.0%[4-5]。然而，免疫缺陷程度相似的艾滋病患者，同样易感于非结核分枝杆菌病（ non-tuberculous mycobacteria，NTM）。在临床工作中，新确诊HIV感染时即呈现出严重免疫缺陷的患者，若表现为发热、多发淋巴结肿大、全血细胞减少等，往往需要对马尔尼菲篮状菌病与非结核分枝杆菌病进行鉴别。但关于两种病例临床特征的对照性研究较为少见。本研究回顾性收集上海市公共卫生临床中心近5a来住院艾滋病患者中马尔尼菲篮状菌病与播散性非结核分枝杆菌病病例，对其临床特征以及治疗转归情况进行对比分析。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
回顾性收集上海市公共卫生临床中心住院患者病例，纳入2015年1月至2020年7月间血培养检出马尔尼菲篮状菌病例为TM组，2015年1月至2021年5月期间血培养分枝杆菌阳性且MPB64抗原阴性病例为NTM组。对2组患者的性别、年龄，以及血培养临近的血常规、生化、降钙素原以及住院期间病情转归进行分析。将死亡和未好转自动出院的患者定义为预后不良。纳入标准：（1） 经HIV确证实验室确诊为HIV感染，诊断标准符合中国艾滋病诊疗指南2021版[6]；（2）年龄大于18岁；（3） 血培养检出马尔尼菲篮状菌或血培养分枝杆菌阳性且MPB64抗原阴性。排除标准：马尔尼菲篮状菌与非结核分枝杆菌共感染者。伦理声明：本次研究采用回顾性、匿名的资料收集方法，不涉及患者隐私，故伦理审查中同意免除知情同意签字。
1.2 病原学检测
血培养流程：血培养采用全自动血培养仪和配套的需氧培养瓶和分枝杆菌培养瓶，抽血按照标准程序进行，严格执行无菌操作后抽取患者双侧前臂外周静脉血。外周静脉血经需氧培养后报阳，转种血、巧克力平板后培养鉴定；分枝杆菌瓶报阳后，采用抗酸染色涂片鉴定为分枝杆菌后，对其培养滤液进行MPB64抗原检测。因MPB64抗原是结核分枝杆菌在液体培养基中生长分泌的主要蛋白之一，NTM培养液中多不存在该分泌蛋白，故培养分枝杆菌阳性后经MPB64抗原检测显示阴性结果者判定为非结核分枝杆菌感染。研究显示MPB64抗原检测鉴定结核分枝杆菌与NTM的敏感度和特异度均大于97%[7]。
1.3 观察指标
所有实验室检查结果均选择血培养同期的检查结果。主要实验室指标有：白细胞、中性粒细胞、血红蛋白、C反应蛋白、白蛋白、降钙素原、血沉、真菌D葡聚糖、内毒素、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞。人口学指标：性别和年龄。结局指标：好转出院、自动出院、死亡。
1.4 统计学处理
EXCEL收集整理数据后使用SPSS 20.0进行统计分析。计量资料中服从正态分布的用
$ \bar x \pm s $ 描述，t检验比较2组间的差异；不服从正态分布的用M（P25，P75）描述，秩和检验比较各检验指标的差异。计数资料用n（%）描述，指标的比较用χ2检验。预后的影响因素用Logistic回归分析。检验水准α = 0.05，P < 0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 NTM组患者与TM组患者临床特征的比较
剔除1例NTM与TM共感染的患者后共纳入播散性NTM患者169例，平均年龄（38.0±11.1）岁，男性为主（95.3%）。TM患者87例，平均年龄（36.5±10.9）岁，男性为主（93.1%）。2组患者间的性别和年龄差异无统计学意义（P < 0.0.5）。NTM组患者预后不良者为41例（24.3%），TM组患者预后不良者为15例（17.2%），2组患者间差异没有统计学意义。对2组患者实验室指标进行比较：NTM组患者白蛋白高于TM组（P = 0.003），TM组降钙素原高于NTM组（P = 0.002），NTM组血沉快于TM组（P = 0.011），TM组真菌D葡聚糖显著高于NTM组（P < 0.001）。而2组患者在其他实验室检查指标（白细胞、中性粒细胞、血红蛋白、CD4计数、CD8计数、C反应蛋白、内毒素）方面没有统计学差异，见表1。
表 1 艾滋病合并马尔尼菲篮状菌与非结核分枝杆菌患者临床特征比较[$ \bar x \pm s $ /M（P25，P75）/n（%）]Table 1. Comparison of the clinical characteristics of Talaromyces Marneffei and disseminated Nontuberculosis Mycobacterium disease in AIDS patients . [$ \bar x \pm s $ /M（P25，P75）/n（%）]指标 正常范围 NTM组（n = 169 ） TM组（n = 87） F/U/χ2 P 年龄 （岁） − 38.0 ± 11.1 36.5 ± 10.9 0.001 0.976 男性 − 161（95.3） 81（93.1） 0.52 0.471 白细胞 （×109/L） 3.5～9.5 4.0（2.6，5.5） 3.4（2.4，5.1） 6.84 0.396 中性粒细胞 （×109/L） 1.80～6.30 2.9（1.8，4.5） 2.9（1.7，4.2） 6.93 0.493 血红蛋白 （g/L） 115～150 87.5（68.2，105.7） 94（81，107） 8.31 0.071 CD4 （/µL） 410～1590 8（3，19） （n = 168） 7（4，19） （n = 84） 7.09 0.938 CD8 （/µL） 190～1140 261（121，468）（n = 160） 202（98，335）（n = 82） 5.67 0.085 CD4/CD8比值 0.9～3.6 0.03（0.0，0.08）（n = 160） 0.04（0.02，0.09）（n = 82） 7.51 0.066 白蛋白 （g/L） 40～55 30.0（26.0，33.5） 27.0（23.4，31.0）（n = 86） 5.62 0.002* C反应蛋白 （mg/L） 0～10 39.9（17.9，93.7）（n = 140） 53.7（26.3，88.2）（n = 76） 5.83 0.245 降钙素原 （ng/mL） 0～0.05 0.24（0.1，0.8） （n = 154） 0.63（0.2，1.7） （n = 74） 6.96 0.002* 血沉 （mm/h） 0～15 78（54，96） （n = 103） 64.0（41.0，83.7） （n = 54） 2.09 0.011* 真菌D葡聚糖 （pg/mL） < 60 10（10，128） （n = 155） 199.0（48.5，272.5）（n = 76） 8.71 < 0.001* 内毒素（pg/mL） < 10 6.0（5.0，20.8） （n = 142） 5.1（5.0，10.2） （n = 66） 4.39 0.435 预后不良（%） − 41（24.3） 15（17.2） 1.66 0.198 *P < 0.05。 2.2 2组患者预后不良的影响因素分析
分别对2组患者进行预后影响因素的Logistic回归分析，把单因素分析结果中P < 0.01的变量纳入多因素分析。定义结局变量：1 = 自动出院和死亡，0 = 好转出院；自变量：年龄（1： < 35岁，2：≥35岁），性别（1 = 男，2 = 女），白细胞（1： < 4×109/L，2：≥4×109/L），中性粒细胞（1： < 3.5×109/L，2：≥3.5×109/L），血红蛋白（1： < 90 g/L，2：≥90 g/L），白蛋白（1： < 30 g/L，2：≥30 g/L），C反应蛋白（1： < 50 mg/L，2：≥50 mg/L），降钙素原（1： < 0.25 ng/mL，2：≥0.25 ng/mL），血沉（1： < 75 mm/h，2：≥75 mm/h），CD4（1： < 10/µL，2：≥10/µL），CD8（1： < 250/µL，2：≥250/µL），NTM组真菌D葡聚糖（1： < 11 pg/mL，2：≥11 pg/mL），TM组真菌D葡聚糖（1： < 200 pg/mL，2：≥200 pg/mL），内毒素（1： < 6 pg/mL，2：≥6 pg/mL）。
NTM组纳入的变量为：白细胞、血红蛋白、白蛋白、CD8计数和内毒素。最终，内毒素越低，预后不良的风险越高（P = 0.022）；白蛋白 < 30 g/L的患者预后不良的风险高于白蛋白 > 30 g/L的患者（P = 0.017）；CD8 < 250/µL的患者预后不良的风险高于CD8 > 250/µL的患者（P = 0.049），见表2。TM组纳入的变量为：血红蛋白、白蛋白、C反应蛋白、CD8计数和真菌D葡聚糖。最终，CD8 < 250/µL的患者预后不良的风险高于CD8 > 250/µL的患者（P = 0.012）；真菌D葡聚糖越低，预后不良的风险越高（P = 0.016），见表3。
表 2 艾滋病合并播散性非结核分枝杆菌患者预后的影响因素Table 2. Risk factors for poor prognosis of disseminated Nontuberculosis Mycobacterium disease in AIDS patients因素 B Wald χ2 OR 95%CI P 内毒素 −1.018 5.246 0.361 0.151～0.863 0.022 白蛋白 −1.079 5.676 0.340 0.140～0.826 0.017 CD8 −0.850 3.860 0.427 0.183～0.998 0.049 常量 3.104 8.875 22.285 0.003 表 3 艾滋病合并马尔尼菲篮状菌患者预后的影响因素Table 3. Risk factors for poor prognosis of Talaromyces Marneffei disease in AIDS patients因素 B Wald χ2 OR 95%CI P CD8 −2.814 6.330 0.060 0.007～0.537 0.012 真菌D葡聚糖 −1.874 5.858 0.153 0.034～0.700 0.016 常量 4.588 6.332 98.345 0.012 3. 讨论
马尔尼菲篮状菌病是一地区流行性疾病，我国主要在广东和广西地区较常见[8]，接诊此病流行区的艾滋病患者，应及早完善相关病原学检查，明确TM感染状况。虽然经过有效的抗病毒治疗，发达国家艾滋病患者中NTM的感染率和病死率逐渐下降[9]，但是在亚非拉地区，艾滋病患者中NTM的感染率仍居高不下，NTM感染依然是艾滋病患者住院及死亡的主要原因[10]。本研究对比分析了2组患者的临床特征及实验室指标发现2组患者均以青年男性为主，2组之间在性别和年龄方面没有差异。本研究中NTM组的预后不良发生率为24.3%，虽然经过ART和克拉霉素一级预防后，艾滋病患者NTM感染率显著降低，但国外研究显示，NTM感染病例病死率仍高达29%[10]；国内研究中，艾滋病患者感染NTM的病死率为26.7%[11]。一项对华南地区的回顾性队列研究结果显示艾滋病合并TM患者住院病死率为17.5%[12]，显著高于没有合并TM感染的艾滋病患者，与本研究不良预后比例（17.2%）相当。2组患者间的预后没有统计学差异，艾滋病患者不论是合并NTM还是合并TM都是导致死亡率增加的重要原因。
NTM组患者白蛋白高于TM组（P = 0.003），可能原因是HIV常常集中在肝血窦的上皮细胞和巨噬细胞上，巨噬细胞被HIV攻击后引起肝功能损伤[13]，同时肝脏也是TM主要侵犯的脏器，加重了肝损伤，导致肝脏实质细胞合成白蛋白减少，并且艾滋病患者合并TM常引起较重的炎症反应，大量消耗导致白蛋白减少[14]。TM组降钙素原高于NTM组（P = 0.002），杨丹丹等[15]的研究也发现了艾滋病合并TM患者的降钙素原升高，明确了感染的存在。降钙素原产生的间接途径是细菌刺激后引起机体产生促炎细胞因子等物质，进而刺激靶细胞产生降钙素原[16]。从本研究的结果看来，真菌感染导致了更高的降钙素原的产生。NTM组血沉高于TM组（P=0.11），这也提示了血沉在分枝杆菌感染的患者中升高明显。血沉是一项针对感染状况的非特异性检查，有研究显示[17]在60%至83%的结核病患者中，血沉通常快于20 mm/h。TM组真菌D葡聚糖显著高于NTM组（P < 0.001），与TM组患者真菌感染的情况相符。真菌入侵人体血液或深部组织后，真菌D葡聚糖从细胞壁释放出来，血液及其他体液中真菌D葡聚糖含量升高，反映机体真菌感染状况[18]。真菌D葡聚糖在细菌、病毒和人体细胞中都不存在，多存在于真菌细胞壁，也因此，真菌D葡聚糖是诊断深部真菌感染的有效依据[19]。
针对2组患者预后的影响因素分析发现CD8是两组患者共同的保护因素，CD8越高预后越好。文献报道显示，CD8计数可以作为单独的因素独立于CD4计数来预测患者的预后[20]。多数情况下，艾滋病患者在后期可能导致CD4和CD8耗尽[21]，因此，CD8高的患者可能处于相对较轻的病程阶段，预后更好。NTM组白蛋白越低，预后不良的风险越高，而在TM组没有得到相同的结论，可能与TM组患者本身中位白蛋白水平较低有关。真菌D葡聚糖越低，预后不良的风险越高（P = 0.016）。前期研究也发现真菌D葡聚糖低于100 pg/mL的患者预后不良的风险高于真菌D葡聚糖高的患者[22]。此外，本研究临床资料不够完善，如患者HIV感染时间及途径，抗艾滋病病毒治疗情况等，均不利于综合评估患者疗效。
综上，在艾滋病患者中，与播散性非结核分枝杆菌相比，马尔尼菲篮状菌感染者白蛋白更低，需要密切关注及时补充；血沉相对较慢。2组患者预后均较差，较高的CD8水平往往预示着该类患者较好的预后。
-
图 1 3种培养条件对MPM细胞形态和增殖的作用
A：倒置显微镜下观察P1、P5和P10细胞形态（100×）；B：CCK-8检测P1、P5和P10细胞细胞增殖活力；与RPMI-1640组比较，*P < 0.05；与DMEM组比较，△P < 0.05；P1：第1代；P5：第5代；P10：第10代。
Figure 1. Effect of three culture conditions on morphology and proliferation of MPM cells
图 3 免疫荧光检测MPM细胞标志物（40×）
Figure 3. The MPM cells biomarkers were detected by immunofluorescence assay（40×）
图 4 CDKN2B调控MPM细胞增殖、侵袭、上皮间质转化和凋亡
A：RT-qPCR检测CDKN2B mRNA表达；B：Western blot检测CDKN2B蛋白表达；与MET-5A组相比，*P < 0.05；C：RT-qPCR检测pcDNA-CDKN2B转染效率；D：Western blot检测pcDNA-CDKN2B转染效率；E：CCK-8检测细胞增殖活力；F：Transwell检测细胞侵袭能力；G：Western blot检测细胞上皮间质转化相关标志物的蛋白表达；H：流式细胞术检测细胞凋亡率；I：Western blot检测细胞凋亡相关标志物的蛋白表达；与pcDNA-NC组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
Figure 4. CDKN2B modulated the proliferation，invasion，epithelial interstitial transformation and apoptosis of MPM cells
-
[1] Bruno R,Alì G,Fontanini G. Molecular markers and new diagnostic methods to differentiate malignant from benign mesothelial pleural proliferations: A literature review[J]. J Thorac Dis,2018,10(Suppl 2):S342-S352. [2] Stumphius J,Meyer P B. Asbestos bodies and mesothelioma[J]. Ann Occup Hyg,1968,11(4):283-293. [3] Porret E, Madelaine J, Galateau-Sallé F, et al. Epidemiology, molecular biology, diagnostic and therapeutic strategy of malignant pleural mesothelioma in 2007 - an update[J]. Rev Mal Respir, 2007, 24（8 Pt 2）: 6S157-6S164. [4] Robinson B W,Musk A W,Lake R A. Malignant mesothelioma[J]. Lancet,2005,366(9483):397-408. doi: 10.1016/S0140-6736(05)67025-0 [5] Santoro A,O'brien M E,Stahel R A,et al. Pemetrexed plus cisplatin or pemetrexed plus carboplatin for chemonaïve patients with malignant pleural mesothelioma: Results of the international expanded access program[J]. J Thorac Oncol,2008,3(7):756-763. doi: 10.1097/JTO.0b013e31817c73d6 [6] Macleod N,Chalmers A,O'rourke N,et al. Is radiotherapy useful for treating pain in mesothelioma? A phase ii trial[J]. J Thorac Oncol,2015,10(6):944-950. doi: 10.1097/JTO.0000000000000499 [7] Clive A O,Taylor H,Dobson L,et al. Prophylactic radiotherapy for the prevention of procedure-tract metastases after surgical and large-bore pleural procedures in malignant pleural mesothelioma (SMART): A multicentre,open-label,phase 3,randomised controlled trial[J]. Lancet Oncol,2016,17(8):1094-1104. doi: 10.1016/S1470-2045(16)30095-X [8] Zalcman G,Mazieres J,Margery J,et al. Bevacizumab for newly diagnosed pleural mesothelioma in the mesothelioma avastin cisplatin pemetrexed study (MAPS): A randomised,controlled,open-label,phase 3 trial[J]. Lancet,2016,387(10026):1405-1414. doi: 10.1016/S0140-6736(15)01238-6 [9] Chernova T,Sun X M,Powley I R,et al. Molecular profiling reveals primary mesothelioma cell lines recapitulate human disease[J]. Cell Death Differ,2016,23(7):1152-1164. doi: 10.1038/cdd.2015.165 [10] Manning L S,Whitaker D,Murch A R,et al. Establishment and characterization of five human malignant mesothelioma cell lines derived from pleural effusions[J]. Int J Cancer,1991,47(2):285-290. doi: 10.1002/ijc.2910470219 [11] Kobayashi M,Takeuchi T,Ohtsuki Y. Establishment of three novel human malignant pleural mesothelioma cell lines: Morphological and cytogenetical studies and EGFR mutation status[J]. Anticancer Res,2008,28(1a):197-208. [12] Philippeaux M M,Pache J C,Dahoun S,et al. Establishment of permanent cell lines purified from human mesothelioma: Morphological aspects,new marker expression and karyotypic analysis[J]. Histochem Cell Biol,2004,122(3):249-260. doi: 10.1007/s00418-004-0701-1 [13] Kanellakis N I,Asciak R,Hamid M A,et al. Patient-derived malignant pleural mesothelioma cell cultures: A tool to advance biomarker-driven treatments[J]. Thorax,2020,75(11):1004-1008. doi: 10.1136/thoraxjnl-2020-215027 [14] Oey H,Daniels M,Relan V,et al. Whole-genome sequencing of human malignant mesothelioma tumours and cell lines[J]. Carcinogenesis,2019,40(6):724-734. doi: 10.1093/carcin/bgz066 [15] Szulkin A,Nilsonne G,Mundt F,et al. Variation in drug sensitivity of malignant mesothelioma cell lines with substantial effects of selenite and bortezomib, highlights need for individualized therapy[J]. PLoS One,2013,8(6):e65903. [16] Yuile A,Satgunaseelan L,Wei J Q,et al. CDKN2A/B homozygous deletions in astrocytomas: A literature review[J]. Curr Issues Mol Biol,2023,45(7):5276-5292. doi: 10.3390/cimb45070335 [17] Pozdeyev N,Gay L M,Sokol E S,et al. Genetic analysis of 779 advanced differentiated and anaplastic thyroid cancers[J]. Clin Cancer Res,2018,24(13):3059-3068. [18] Fortin Ensign S P,Jenkins R B,Giannini C,et al. Translational significance of CDKN2A/B homozygous deletion in isocitrate dehydrogenase-mutant astrocytoma[J]. Neuro Oncol,2023,25(1):28-36. doi: 10.1093/neuonc/noac205 [19] Yang L,Ma D W,Cao Y P,et al. PRMT5 functionally associates with EZH2 to promote colorectal cancer progression through epigenetically repressing CDKN2B expression[J]. Theranostics,2021,11(8):3742-3759. doi: 10.7150/thno.53023 [20] Yang J,Liu Y,He A,et al. Hsa-miR-429 promotes bladder cancer cell proliferation via inhibiting CDKN2B[J]. Oncotarget,2017,8(40):68721-68729. doi: 10.18632/oncotarget.19878 [21] Cao K,Li B,Zhang Y W,et al. miR-29b restrains cholangiocarcinoma progression by relieving DNMT3B-mediated repression of CDKN2B expression[J]. Aging (Albany NY),2021,13(4):6055-6065. doi: 10.18632/aging.202549 [22] Boldrin E,Gaffo E,Niedermayer A,et al. MicroRNA-497/195 is tumor suppressive and cooperates with CDKN2A/B in pediatric acute lymphoblastic leukemia[J]. Blood,2021,138(20):1953-1965. doi: 10.1182/blood.2020007591 -
下载:
下载:
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 1192
- HTML全文浏览量: 677
- PDF下载量: 15
- 被引次数: 0
