Culture of Malignant Pleural Mesothelioma Cells and the Effects of CDKN2B on Cancer Cell
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摘要:
目的 探讨不同培养条件（RPMI-1640、DMEM和DMEM/F12培养液）对人恶性胸膜间皮瘤（malignant pleural mesothelioma，MPM）组织中分离的MPM细胞传代的影响以及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B（cyclin dependent kinase inhibitor 2B，CDKN2B）对MPM细胞增殖、侵袭和凋亡的作用。 方法 从MPM组织中分离细胞分别用RPMI-1640、DMEM和DMEM/F12培养液培养。CCK-8检测细胞增殖，细胞核及染色体利用瑞氏-吉姆萨染色观察，免疫荧光实验检测MPM标志物Calretinin、CD141、CK5、EMA和WT-1荧光强度。RT-qPCR和Western blot分别检测CDKN2B的mRNA和蛋白表达能力。Transwell检测细胞侵袭能力，流式细胞术检测细胞凋亡率。 结果 建立的MPM细胞在RPMI-1640、DMEM和DMEM/F12培养液中传至第10代仍具有较好的活力，且MPM标志物Calretinin、CD141、CK5、EMA和WT-1在细胞中均表达，MPM细胞在RPMI-1640培养液中活力较为稳定。CDKN2B在MPM细胞中低表达（P < 0.05），过表达CDKN2B显著抑制MPM细胞的增殖（P < 0.05）、侵袭（P < 0.05）和上皮间质转化（P < 0.01），促进细胞凋亡（P < 0.01）。 结论 建立的MPM细胞可在RPMI-1640培养液中稳定传代，CDKN2B可作为MPM诊断和治疗的潜在靶标。 Abstract:Objective To investigate the effects of different culture conditions（RPMI-1640, DMEM and DMEM/F12 medium） on the passage of MPM cells isolated from the tissues of Malignant pleural mesothelioma（MPM）, and to study the effects of CDKN2B on the proliferation, invasion and apoptosis of MPM cells. Methods MPM cells were isolated from MPM tissues and cultured in RPMI-1640, DMEM and DMEM/F12 medium, respectively. Cell proliferation was examined by CCK-8, and the nuclei and chromosomes were observed by Wright-Giemsa staining. Fluorescence intensities of Calretinin, CD141, CK5, EMA and WT-1 were conducted by immunofluorescence assay. The mRNA and protein expression of CDKN2B were detected by RT-qPCR and Western blot, respectively. Transwell was used to detect cell invasion and flow cytometry was used to detect cell apoptosis. Results The established MPM cells showed good viability when passaged to the 10th generation in RPMI-1640, DMEM and DMEM/F12 cultures, and the MPM markers Calretinin, CD141, CK5, EMA and WT-1 were all expressed in the cells. The viability of MPM cells in RPMI-1640 culture medium was relatively stable. CDKN2B was downregulated in MPM cells（P < 0.05）, and overexpression of CDKN2B significantly suppressed the proliferation（P < 0.05）, invasion（P < 0.05） and epithelial interstitial transformation of MPM cells（P < 0.01）, and promoted the apoptosis（P < 0.01）. Conclusion The established MPM cells were stably passaged in RPMI-1640 culture medium, and CDKN2B may be a potential target for the diagnosis and treatment of MPM. -
Key words:
- Malignant pleural mesothelioma /
- Culture conditions /
- RPMI-1640 culture medium /
- CDKN2B /
- Proliferation /
- Invasion
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男男性行为者（men who have sex with men ，MSM）是感染艾滋病的高危人群，2019年相关报告显示，在新增的HIV感染者中，同性性传播占23.3%[1]。昆明市是云南省MSM人群相对集中的地区，历年来昆明市新报告的HIV-1感染的MSM约占全省的一半以上。HIV-1新近感染者往往病毒载量较高，传播效率大，及时发现新近感染者的相关影响因素，可以有针对的进行预防和干预[2]。本研究采用HIV-1限制性抗原亲和力酶联免疫方法（HIV-1LAg-Avidity enzyme immunoassay，LAg-Avidity EIA）结合CD4+T淋巴细胞计数来判定新近感染者，分析昆明市MSM人群中新近感染的影响因素。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
2018年1月至2020年12月在昆明市通过社会组织开展MSM的咨询和动员检测，HIV-1抗体筛查阳性的样品，送云南省疾病预防控制中心进行确证检测。在确证为阳性后，进行首次随访，同时收集研究对象的流行病学资料，共收集389例新报告HIV-1感染的MSM。
1.2 CD4+T淋巴细胞检测
采用BD FACS-Calibur流式细胞仪及配套试剂盒检测CD4+T淋巴细胞水平，按照试剂盒说明书进行操作，并严格按照《全国艾滋病检测技术规范》（2020年修订版）[3]中CD4+T淋巴细胞检测方法进行。
1.3 HIV-1病毒载量检测
采用美国Roche公司生产的COBAS Ampli Prep/COBAS Taq Man 48分析仪及COBAS Ampli Prep/COBAS Taq Man HIV-1 Test Version 2.0试剂，该试剂最低检测限为20 copies /mL。
1.4 HIV-1新发感染检测
CD4+T淋巴细胞计数≥200个/μL进行新发感染检测。使用北京金豪制药股份有限公司生产的HIV-1新发感染检测试剂盒（限制性抗原亲和力法）。进行新发感染检测时，按照试剂盒说明书进行，试验分为初筛和确认2部分，初筛检测样本ODn > 2.0判定为长期感染，ODn≤2.0需进行确认试验。确认试验时，ODn≤2.0样本进行三孔重复检测，ODn > 1.5为长期感染，ODn≤1.5则为新近感染。
1.5 统计学处理
用SPSS19.0进行统计学分析，计数资料以例数或百分比[n（%）]表示，组间的比较使用χ2检验。新近感染的相关因素使用非条件Logistic回归进行分析，以是否新近感染作为因变量（是 = 1，否 = 0），以相关因素作为自变量。将单因素分析中P < 0.1的变量进行多因素Logistic回归分析，计算各因素的比值比（OR）及95％可信区间（95%CI）。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 基本情况
新报告的389例HIV-1阳性MSM中，年龄最大为65岁，最小为15岁，中位数为27岁。户籍为昆明市的占26.7%（104/389），云南省其他地区的占42.4%（165/389），其他省的占30.9%（120/389）；汉族占77.9%（303/389）；未婚占84.3%（328/389）；大专及以上文化程度者占62.2%（242/389）；职业为商业服务人员占41.1%（160/389）；同性性伴数范围为1～160例，中位数为10例；研究对象中91.8%（357/389）无性病史；首次CD4+T细胞计数为1～1625个/μL，中位数为322个/μL；324例进行了HIV-1病毒载量检测，2例低于检测限，病毒载量范围为61～8300000 copies/mL，中位数为33360 copies/mL，见表1。
表 1 研究对象的人口学特征Table 1. Demographic characteristics of subjects变量 例数（n = 389） 百分比（%） 年龄（岁） − − < 30 243 62.5 30-49 59 15.2 ≥ 50 87 22.3 户籍所在地 − − 昆明市 104 26.7 云南省其他地区 165 42.4 其他省 120 30.9 民族 − − 汉族 303 77.9 其他民族 86 22.1 婚姻状况 − − 未婚 328 84.3 已婚有配偶 24 6.2 离异或丧偶 37 9.5 文化程度 − − 初中及以下 63 16.2 高中或中专 84 21.6 大专及以上 242 62.2 职业 − − 干部职员 35 9.0 商业服务人员 160 41.1 家政、家务及待业 60 15.4 学生 58 14.9 自由职业 32 8.3 其他 44 11.3 同性性伴数 − − ≤ 9 155 39.8 10-49 210 54.0 ≥ 50 24 6.2 性病史 − − 有 24 6.2 无 357 91.8 不详 8 2.0 CD4细胞计数（cells/μL） − − < 200 68 17.5 ≥ 200 316 81.2 不详 5 1.3 病毒载量（copies/mL） − − 低于检测限 2 0.5 < 1000 23 5.9 103～105 221 56.8 > 105 78 20.1 不详 65 16.7 2.2 HIV-1新近感染情况
研究对象中，68例CD4+T淋巴细胞计数 < 200个/μL，判定为长期感染。使用LAg-Avidity EIA对其他321例进行新发感染检测，172例被判定为新近感染，149例为长期感染。研究对象中新近感染的比例为44.2%（172/389）。2018～2020年新近感染的比例分别为48.1%（90/187）、51.6%（49/95）、30.8%（33/107），差异有统计学意义（χ2 = 11.009，P < 0.05），见表2。其中2018年和2019年的新近感染的比例，差异无统计学意义（P > 0.05）；2020年的新近感染比例低于2018年（χ2 = 8.358，P = 0.004）和2019年（χ2 = 8.974，P = 0.003）。
表 2 2018年～2020年新报告HIV-1阳性MSM的新近感染情况Table 2. Newly reported infections of HIV-1 positive MSM in 2018～2020年份 新报告
阳性（n）HIV-1新近
感染数（n）新近感染
比例（%）χ2 P − − − − 11.009 0.004 2018 187 90 48.1 8.358 0.004* 2019 95 49 51.6 8.974 0.003* 2020 107 33 30.8 − − 合计 389 172 44.2 − − 与2020年比较，*P < 0.05。 2.3 HIV-1新近感染影响因素分析
多因素Logistic回归分析中，结果显示，相比干部职员，学生（P = 0.017，OR = 2.989，95%CI:1.221～7.318）MSM中新近感染检测出的比例高，见表3。
表 3 研究对象HIV-1新近感染影响因素分析Table 3. Analysis of influencing factors of recent HIV-1 infection among subjects变量特征 合计（n） 新近
感染（n）新近感染
比例（%）单因素分析 多因素分析 OR（95%CI） P OR（95%CI） P 年龄（岁） − − − − 0.013* − 0.072 < 30 243 120 49.4 1.000 − − 1.000 30～49 59 17 28.8 0.415（0.224～0.769） 0.005* 0.470（0.245～0.901） 0.023 ≥ 50 87 35 40.2 0.690（0.420～1.134） 0.143 0.782（0.452～1.354） 0.380 户籍所在地 − − − − 0.093 − 0.075 昆明市 104 53 51.0 1.000 − − 1.000 其他省 120 44 36.7 0.557（0.326～0.951） 0.032 0.536（0.307～0.935） 0.028 云南省其他地区 165 75 45.5 0.802（0.490～1.311） 0.379 0.828（0.492～1.393） 0.477 民族 − − − − 0.801 − − 汉族 303 135 44.6 1.000 − − − 其他民族 86 37 43.0 0.940（0.580～1.524） 0.801 − − 婚姻状况 − − − − 0.638 − − 未婚 328 142 43.3 1.000 − − − 已婚有配偶 24 11 45.8 1.108（0.482～2.547） 0.809 − − 离异或丧偶 37 19 51.4 1.383（0.700～2.731） 0.351 − − 文化程度 − − − − 0.241 − − 初中及以下 63 24 38.1 1.000 − − − 高中或中专 84 33 39.3 1.051（0.537～2.057） 0.883 − − 大专及以上 242 115 47.5 1.471（0.834～2.596） 0.182 − − 职业 − − − − 0.001* − 0.004* 干部职员 35 13 37.1 1.000 − − 1.000 商业服务人员 160 56 35.0 0.911（0.427～1.946） 0.810 1.023（0.472～2.215） 0.955 家政家务、及待业 60 23 38.3 1.052（0.445～2.488） 0.908 1.126（0.470～2.700） 0.789 学生 58 38 65.5 3.215（1.342～7.703） 0.009* 2.989（1.221～7.318） 0.017* 自由职业 32 18 56.3 2.176（0.818～5.790） 0.120 2.669（0.975～7.305） 0.056 其他 44 24 54.5 2.031（0.820～5.029） 0.126 2.195（0.868～5.553） 0.097 同性性伴数 − − − − 0.782 − − ≤ 9 155 70 45.2 1.000 − − − 10～49 210 93 44.3 0.965（0.636～1.465） 0.868 − − ≥ 50 24 9 37.5 0.729（0.301～1.765） 0.483 − − 性病史 − − − − 0.339 − − 有 24 14 58.3 1.000 - − − 无 357 154 43.1 0.542（0.234～1.253） 0.152 − − 不详 8 4 50.0 0.714（0.143～3.559） 0.681 − − 病毒载量 − − − − 0.101 − − < 103 25 16 64.0 1.000 − − − 103～105 221 88 39.8 0.372（0.158～0.879） 0.024 − − > 105 78 38 48.7 0.534（0.211～1.354） 0.186 − − 未检测 65 30 46.2 0.482（0.186～1.248） 0.133 − − *P < 0.05。 3. 讨论
本文对2018年～2020年昆明市通过社会组织新发现的HIV-1感染的MSM的新发感染检测情况进行分析。结果显示，2018年～2020年新报告MSM新近感染的比例总体为44.2%，高于陕西省的调查结果（31.0%，P < 0.05）[4]，这可能与动员检测力度不断加强有关，从而使感染者在急性期就被发现。同时也发现2020年的新近感染比例和2018年和2019年相比出现下降的趋势，这可能是长期干预后，新发感染下降，但还需要进一步的观察和评估。
相比于干部职员，学生感染者发现时为新近感染的比例较高，这与天津市的调查结果相一致[5]。对MSM青年学生的相关研究显示[6]，学生MSM群体艾滋病知识的总知晓率较高，一项针对大学生HIV检测意愿影响因素调查显示[7]，有同性性行为者对HIV危险感知达77.8%，但在达到艾滋病知识知晓程度的学生中，仍有40%不能坚持使用安全套，知行分离现象突出。同时，学生群体中互联网/交友软件交友使用频繁，存在着复杂的社交网络，相比固定场所交友，提高了交友的便捷性，增加了学生MSM人群感染HIV的风险[8-12]。有研究显示，通过网络寻找性伴，接受HIV检测的可能性更高[13]。近年来自检模式的推行，使得学生群体进行HIV检测的可及性得到提高[14]，且有研究表明，青少年中经由自愿咨询检测发现的比例为45.5%～73.8%[9]，增加了疾病早期发现的可能性。借助HIV检测的推广，各高校应关注学生群体艾滋病防治的宣传教育[15-18]，降低高危行为，提高自我保护能力。
急性期感染时HIV-1病毒载量的水平通常比慢性感染期高100倍，最初的峰值在6～8周内逐渐降低，在半年内降低到一个相对稳定的水平，即通常所说的调定点[19-20]。而目前新发感染检测方法的窗口期通常在6个月以内，这段时间内病毒载量的变化水平较大，因此在新近感染的样本中HIV-1病毒载量存在着异质性的现象。在本研究中也发现，不同病毒载量水平分组中，新近感染的比例总体上没有差异。但有相关研究显示低病毒载量（ < 400 copies/mL）与新近感染的错判有关[21-25]，因此，为降低新近感染的误判率，在有的研究中除了基于抗体的新近感染检测和CD4+T淋巴细胞水平（ > 200 cells/μL）外，也将病毒载量水平（ > 400 copies/mL）作为新近感染的判断标准[26-27]。因此，在进行新近感染的判定时，要加强报告病例流行病学信息的搜集，并辅以一些检测项目，如CD4+T淋巴细胞计数及病毒载量等数据。
近年来，HIV-1新发感染检测在判断和识别正在发生HIV传播风险中逐步得到重视，在病例报告的基础上，综合运用HIV-1新发感染检测，可以及时发现HIV传播的热点地区，这对于开展溯源调查，扩展病例发现，向传播网络中感染风险高的人群及时提供包括暴露前预防在内的预防服务都有潜在的意义[28]。特别是随着检测技术的发在，在艾滋病确证的同时便进行新发感染检测，能够形成实时监测和公共卫生反应系统的基础，从而保证监测到治疗的连续性，进一步提示在哪里集中干预，以及如何提高服务的可及性。本研究在MSM人群中进行了新发感染检测分析的探索，对下一步加强该人群的监测，指导该人群的艾滋病防控具有一定的指导意义。
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图 1 3种培养条件对MPM细胞形态和增殖的作用
A：倒置显微镜下观察P1、P5和P10细胞形态（100×）；B：CCK-8检测P1、P5和P10细胞细胞增殖活力；与RPMI-1640组比较，*P < 0.05；与DMEM组比较，△P < 0.05；P1：第1代；P5：第5代；P10：第10代。
Figure 1. Effect of three culture conditions on morphology and proliferation of MPM cells
图 3 免疫荧光检测MPM细胞标志物（40×）
Figure 3. The MPM cells biomarkers were detected by immunofluorescence assay（40×）
图 4 CDKN2B调控MPM细胞增殖、侵袭、上皮间质转化和凋亡
A：RT-qPCR检测CDKN2B mRNA表达；B：Western blot检测CDKN2B蛋白表达；与MET-5A组相比，*P < 0.05；C：RT-qPCR检测pcDNA-CDKN2B转染效率；D：Western blot检测pcDNA-CDKN2B转染效率；E：CCK-8检测细胞增殖活力；F：Transwell检测细胞侵袭能力；G：Western blot检测细胞上皮间质转化相关标志物的蛋白表达；H：流式细胞术检测细胞凋亡率；I：Western blot检测细胞凋亡相关标志物的蛋白表达；与pcDNA-NC组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
Figure 4. CDKN2B modulated the proliferation，invasion，epithelial interstitial transformation and apoptosis of MPM cells
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