Culture of Malignant Pleural Mesothelioma Cells and the Effects of CDKN2B on Cancer Cell
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摘要:
目的 探讨不同培养条件（RPMI-1640、DMEM和DMEM/F12培养液）对人恶性胸膜间皮瘤（malignant pleural mesothelioma，MPM）组织中分离的MPM细胞传代的影响以及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B（cyclin dependent kinase inhibitor 2B，CDKN2B）对MPM细胞增殖、侵袭和凋亡的作用。 方法 从MPM组织中分离细胞分别用RPMI-1640、DMEM和DMEM/F12培养液培养。CCK-8检测细胞增殖，细胞核及染色体利用瑞氏-吉姆萨染色观察，免疫荧光实验检测MPM标志物Calretinin、CD141、CK5、EMA和WT-1荧光强度。RT-qPCR和Western blot分别检测CDKN2B的mRNA和蛋白表达能力。Transwell检测细胞侵袭能力，流式细胞术检测细胞凋亡率。 结果 建立的MPM细胞在RPMI-1640、DMEM和DMEM/F12培养液中传至第10代仍具有较好的活力，且MPM标志物Calretinin、CD141、CK5、EMA和WT-1在细胞中均表达，MPM细胞在RPMI-1640培养液中活力较为稳定。CDKN2B在MPM细胞中低表达（P < 0.05），过表达CDKN2B显著抑制MPM细胞的增殖（P < 0.05）、侵袭（P < 0.05）和上皮间质转化（P < 0.01），促进细胞凋亡（P < 0.01）。 结论 建立的MPM细胞可在RPMI-1640培养液中稳定传代，CDKN2B可作为MPM诊断和治疗的潜在靶标。 Abstract:Objective To investigate the effects of different culture conditions（RPMI-1640, DMEM and DMEM/F12 medium） on the passage of MPM cells isolated from the tissues of Malignant pleural mesothelioma（MPM）, and to study the effects of CDKN2B on the proliferation, invasion and apoptosis of MPM cells. Methods MPM cells were isolated from MPM tissues and cultured in RPMI-1640, DMEM and DMEM/F12 medium, respectively. Cell proliferation was examined by CCK-8, and the nuclei and chromosomes were observed by Wright-Giemsa staining. Fluorescence intensities of Calretinin, CD141, CK5, EMA and WT-1 were conducted by immunofluorescence assay. The mRNA and protein expression of CDKN2B were detected by RT-qPCR and Western blot, respectively. Transwell was used to detect cell invasion and flow cytometry was used to detect cell apoptosis. Results The established MPM cells showed good viability when passaged to the 10th generation in RPMI-1640, DMEM and DMEM/F12 cultures, and the MPM markers Calretinin, CD141, CK5, EMA and WT-1 were all expressed in the cells. The viability of MPM cells in RPMI-1640 culture medium was relatively stable. CDKN2B was downregulated in MPM cells（P < 0.05）, and overexpression of CDKN2B significantly suppressed the proliferation（P < 0.05）, invasion（P < 0.05） and epithelial interstitial transformation of MPM cells（P < 0.01）, and promoted the apoptosis（P < 0.01）. Conclusion The established MPM cells were stably passaged in RPMI-1640 culture medium, and CDKN2B may be a potential target for the diagnosis and treatment of MPM. -
Key words:
- Malignant pleural mesothelioma /
- Culture conditions /
- RPMI-1640 culture medium /
- CDKN2B /
- Proliferation /
- Invasion
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深静脉血栓（deep vein thrombosis，DVT）是细胞和血浆成分在深静脉内凝结，导致血管完全或不完全阻塞的静脉回流障碍性疾病 [1]。DVT是肺动脉栓塞（pulmonary embolism，PE）栓子的主要来源[2]。 PE已成为患者非预期和围术期死亡的主要原因之一。此外，DVT事件后发生的血栓后综合征（主要表现为下肢肿胀、疼痛、难治性水肿及腿部溃疡），可进一步发展为慢性血栓栓塞性肺动脉高压，严重影响患者的预后和生存质量[3]。
DVT是下肢创伤性骨折的常见并发症，在未采取血栓预防措施的情况下，发生率高达40%～80%[4-6]。因此，中华医学会骨科学分会制定了《中国创伤骨科患者围手术期静脉血栓栓塞症预防指南（2021）》[7]用于指导DVT的防治。
下肢软组织创伤并发DVT时有发生，因未发生骨折，且创伤导致的软组织肿胀、疼痛、青紫等临床症状容易掩盖DVT，临床上未重视防治。本次研究回顾性分析下肢软组织创伤合并DVT的临床特点和易患风险因素，旨在为防治DVT提供理论参考。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
本研究已通过医院医学伦理委员会审批（伦理审批号2022kmykdx6f63），研究严格遵守医学伦理规范。检索云南省玉溪市人民医院2020年1月至2021年12月间骨科及急诊创伤中心收治的下肢软组织创伤患者。根据以下标准确定患者：（1）年龄≥18岁；（2）未发生骨折；（3）无多发伤和复合损伤；（4）住院时间 > 48 h；（5）既往无静脉血栓栓塞病史；（6）既往未服用抗凝药物；（7）无血液系统疾病；（8）肝功能正常；（9）无社区获得性感染；（10）未接受DVT预防措施。
1.2 相关资料及标准
1.2.1 相关资料
收集研究对象的相关资料，包括：（1）一般资料（年龄、性别、体重指数、吸烟史、饮酒史、肿瘤史、高血压、高血脂、心脏病、糖尿病、痛风等情况）；（2）创伤情况（创伤因素、类型、部位、肢体、组织、AIS损伤分度）；（3）实验室检查资料（血红蛋白、血小板、C-反应蛋白（CRP）、纤维蛋白降解产物（FDP）、D-二聚体）；（4）影像学检查资料；（5）临床管理情况（入院等待时间、患肢制动、脱水剂应用和未预防性抗凝措施）；（6）并发症（创伤后局部感染和组织缺损）。
1.2.2 DVT诊断方法及标准
研究对象于入院后3 d内及时行下肢血管彩色多普勒超声检查（GE-E9，血管探头9 L），参照Dauzat等[8]提出的彩色多普勒超声检查标准，至少符合下列一项即诊断DVT：（1）血管腔内见强弱不等的实性回声区；（2）静脉血管不能被压瘪，探头加压不能压瘪或部分压瘪血管腔；（3）血栓处彩色和脉冲多普勒超声缺乏自主性或激惹性血流；（4）血流频谱不随呼吸改变；（5）侧支静脉由于血流增多而管径增宽。
1.2.3 实验室相关检查标准
入院后第1天清晨空腹抽取患者静脉血样本，使用全自动凝血分析仪（型号：Stago STA-RMax）测定Ｄ-二聚体及FDP血液浓度（μg/mL），结果判读标准：D-二聚体高于0.5 μg/mL为阳性，FDP > 5 μg/mL为阳性；使用CRP分析仪（型号：罗氏/雅培cobas701/c16000）测定CRP值（mg/L），结果判读标准：CRP值高于5 mg/L为阳性；使用血常规分析仪（型号：Sysmex XN9000）测定血红蛋白及血小板数值，正常范围：女性HB 110～150 g/L，男性HB 120～160 g/L，PLT 100～300×109/L。
1.3 统计学处理
根据是否发生DVT，将患者分为DVT组和非DVT组，采用SPSS 26.0软件进行单因素分析DVT组和非DVT组之间的差异，对于连续性变量，首先进行正态性检验，符合正态分布的连续性变量行两独立样本t检验，不符合正态分布的行秩和检验；对于分类变量，则采用卡方检验进行统计学分析。将单因素分析筛选出有显著差异（P < 0.05）的因素作为自变量，采用无序两分类变量的非条件Logistic回归模型（因变量：非DVT = 0，DVT = 1），利用向前LR方法来分析下肢软组织创伤并发DVT的独立危险因素。
2. 结果
2.1 发病情况
下肢软组织创伤患者共363例，其中男性239例（239/363，65.8%），女性124例（124/363，34.2%），平均年龄为46（18，93）岁。发生DVT有32例（32/363，8.8%），累及静脉的情况为：髂静脉1例、股静脉1例、腘静脉3例、胫后静脉3例、腓静脉3例、肌间静脉31例。其中，高风险血栓5例，低风险血栓37例。PE 0例，无死亡病例（典型病例下肢血管彩色多普勒超声血栓图，见图1）。
图 1 典型病例下肢血管彩色多普勒超声血栓图A：股静脉血栓；B：髂静脉血栓；C：腘静脉血栓；D：胫后静脉血栓；E：腓静脉血栓；F：肌间静脉血栓。Figure 1. Doppler ultrasound thrombus of lower extremity vessels in typical cases2.2 单因素分析
2.2.1 一般临床资料与DVT发生的关系
DVT组与非DVT组在患者的年龄、性别、吸烟、饮酒、心脏病史方面差异有统计学意义（见表1，P < 0.05），而在体重指数、高血压、糖尿病、高血脂、恶性肿瘤、痛风方面差异无统计学意义（P > 0.05）。
表 1 一般临床资料比较（n = 363）[n（%）]Table 1. Comparison of general clinical data （n = 363）[n（%）]项目 n 血栓 χ2/Z/f P 年龄 18～44岁 171 5（8.77） 28.354
< 0.001*45～59岁 134 12（8.96） ≥60岁 58 15（25.86） 性别 男 239 13（5.44） 9.921 0.002* 女 124 19（15.32） 体重指数（kg/m2） < 18.5 28 2（7.14） −0.908 0.364 18.5～23.9 164 17（10.37） 24～27.9 131 12（9.16） ≥28 40 1（2.50） 个人史 吸烟 242 28（11.57） 5.865 0.015* 饮酒 149 6（4.03） 7.210 0.007* 慢性疾病 高血压 39 7（17.95） 3.351 0.064 糖尿病 7 2（28.57） 1.413 0.120 高血脂 4 1（25.00） — 0.310 心脏病 5 3（60.00） — 0.006* 恶性肿瘤 2 0（0） — 1.000 痛风 8 1（12.50） 0.000 0.526 *P < 0.05。 2.2.2 创伤情况与DVT发生的关系
DVT组与非DVT组在创伤类型和严重程度方面有统计学差异（见表2，P < 0.05），而在创伤因素、部位、肢体和组织方面没有差异（P > 0.05）。
表 2 创伤情况的比较（n = 363）[n（%）]Table 2. Comparison of trauma conditions （n = 363）[n（%）]创伤情况 n 血栓 χ2/Z/f P 创伤因素 摔（跌）伤 85 12（14.12） — 0.181 锐器伤 47 3（6.38） 交通伤 71 7（9.86） 机器伤 55 1（1.82） 重物砸伤 14 2（14.29） 扭伤 42 2（4.76） 异物刺伤 17 1（5.88） 其它 32 4（12.5） 创伤类型 开放性 201 14（6.97） 1.918 0.016* 闭合性 162 18（11.11） 创伤部位 臀部 7 0（0） — 0.536 股部 39 5（12.82） 膝关节 120 12（10） 小腿 78 9（11.54） 足踝 74 4（5.41） 下肢多处创伤 45 2（4.44） 创伤肢体 左侧 175 20（11.43） 3.152 0.207 右侧 161 11（6.83） 双侧 27 1（3.70） 创伤组织 肌肉/肌腱 150 8（5.33） 3.856 0.050 关节韧带 113 11（9.73） 0.172 0.678 血管/神经 67 5（7.46） 0.187 0.665 皮肤组织 202 15（7.43） 1.094 0.296 AIS损伤分度（6度） 轻度 129 5（3.88） −4.148
< 0.001*中度 130 7（5.38） 重度（不危及生命） 91 15（78.95） 重度（危及生命） 13 5（38.46） 危重（可成活） 0 0（0） 无法救治 0 0（0） *P < 0.05。 2.2.3 临床管理情况与DVT发生的关系
DVT组与非DVT组患者在入院等待时间和未预防性抗凝方面有统计学差异（见表3，P < 0.05），而在脱水剂应用和患肢制动方面没有差异（P > 0.05）。
表 3 临床管理情况的比较（n = 363）[n（%）]Table 3. Comparison of clinical management （n = 363）[n（%）]相关因素 n 血栓 χ2 P 未预防性抗凝 273 31（11.36） 7.608 0.006* 入院等待时间 ≥3 d 134 18（13.43） 5.634 0.018* < 3 d 229 14（6.11） 脱水剂应用 179 13（7.26） 1.059 0.303 患肢制动 157 13（8.28） 0.099 0.754 *P < 0.05。 2.2.4 局部损害与DVT发生的关系
DVT组与非DVT组患者在局部感染和软组织缺损方面有统计学差异（见表4，P < 0.05）。
表 4 局部损害因素比较（n = 363）[n（%）]Table 4. Comparison of local damage（n = 363）[n（%）]并发症因素 n 血栓 χ2 P 软组织缺损 24 6（25.00） 8.374 0.004* 创伤后局部感染 67 12（17.91） 8.455 0.004* *P < 0.05。 2.2.5 部分实验室检查指标因素分析
DVT组与非DVT组患者在血红蛋白浓度、纤维蛋白降解产物（FDP）、D-二聚体检查指标有统计学差异（见表5，P < 0.05），而在血小板计数和C-反应蛋白浓度方面没有差异（P > 0.05）。
表 5 部分实验室检查指标因素比较（n = 363）Table 5. Comparison of laboratory tests （n = 363）检查项目 DVT 非DVT t/Z P 血红蛋白（g/L） 128（115，139） 144（130，155） −3.878 < 0.001* 血小板（×109/L） 226.43±81.04 218.35±57.99 −0.551 0.585 血浆D-二聚体测定 （μg/mL） 1.39（0.65，2.51） 0.60（0.37，0.87） −4.537 < 0.001* 纤维蛋白降解产物（μg/mL） 4.53（2.19，14.57） 1.81（1.13，4.53） −4.762 < 0.001* C-反应蛋白（mg/L） 5.36（1.71，22.04） 3.50（1.00，10.00） −1.960 0.050 *P < 0.05。 2.3 多因素logistic回归分析
年龄、吸烟、创伤后局部感染、入院等待时间、未预防性抗凝、创伤严重程度、D-二聚体升高（ > 0.5 μg/mL）是下肢软组织创伤后并发DVT的独立危险因素（P < 0.05），见表6。
表 6 Logistic多因素回归分析Table 6. Logistic multivariate regression analysis独立危险因素 β S.E. Wald P EXP（B） 95%CI 年龄 0.084 0.021 15.649 0.000 1.088 1.043-1.134 入院等待时间 0.656 0.319 4.212 0.040 1.926 1.030-3.603 创伤后局部感染 2.313 0.718 10.371 0.001 10.109 2.473-41.322 未预防性抗凝 2.714 0.678 16.048 0.000 15.092 4.000-56.944 D-二聚体 0.846 0.277 9.311 0.002 2.330 1.353-4.012 吸烟 −2.226 0.776 8.230 0.004 0.108 0.024-0.494 创伤严重程度 1.338 0.374 12.787 0.000 3.812 1.831-7.936 3. 讨论
3.1 下肢软组织创伤并发DVT的临床特点
DVT是下肢骨折常见的并发症，总发生率为17.3%，PE发生率0.5%[9]。陆芸等[10]曾报道547例新鲜四肢骨折及骨盆骨折患者的DVT发生率为12.4%。近年来，随着临床医生对DVT严重性的认识提高，预防措施加强，下肢骨折DVT的发生率也出现了明显下降趋势[11]。本次研究下肢软组织创伤并发DVT的发生率为8.8%，没有发生PE及死亡病例，且多发生于左侧肢体，主要累及小腿肌间静脉，以低风险血栓为主，这与下肢骨折并发DVT情况类似。HOFMANN L V[12]曾在一组关于1432例下肢深静脉血栓患者的统计研究中显示左侧下肢占69.3%。认为这可能与右侧髂总动脉容易压迫左侧髂总静脉，引起左下肢静脉回流速度减缓有关[13]。GALANAUD JP及SCHELLONG SM等[14-15]研究显示小腿肌间静脉血栓占所有远端深静脉血栓的30%～50%，其危害虽远不及近端DVT，但仍有5%～10%可进展为腘静脉致肺栓塞风险的可能。据现有文献及研究，肌间静脉血栓的临床重要性及最佳治疗方案缺少足够的循证依据支持，针对其存在的潜在风险，采取积极有效的预防性措施仍被认为可能是有益的[16]。
3.2 下肢软组织创伤并发DVT危险因素分析
DVT的发生是多种危险因素共同作用的结果，任何引起静脉损伤、静脉血流淤滞及血液高凝状态的因素都是DVT的危险因素。
3.2.1 自身因素
高龄已被公认是发生深静脉血栓的危险因素[10]。本次研究显示，年龄与下肢软组织创伤DVT的发生呈正相关，随着年龄的增加，下肢软组织创伤DVT的发生率也逐渐升高，以年龄≥60岁罹患DVT的风险最高，60岁以上患者发生DVT风险为45岁以下的3倍。有研究显示年龄大于60岁患者DVT的发生率可高达46.87%，年龄每增加10岁，DVT风险则增加1倍[17]。本次研究，吸烟同样可增加下肢软组织创伤罹患DVT的风险。这可能与吸烟激活血小板、诱导血小板聚集、减弱纤维蛋白溶解，促进纤维蛋白原、凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ和Ⅻ、组织因子和同型半胱氨酸水平的升高有关[18]。
3.2.2 创伤及局部因素
开放性下肢软组织创伤，局部感染风险增高，创伤后常并发感染，一旦肢体出现感染控制不佳，在多种炎症细胞（如白细胞、淋巴细胞）和炎症/细胞因子 （如NETs、CRP、IL、TNF-α、IFN-γ等）的共同参与下，剧烈的炎症反应，可导致血液系统处于高凝状态、血管内皮细胞损伤，进而诱发深静脉血栓形成[19-20]。本次研究，笔者采用简明损伤定级标准[21]对下肢软组织创伤进行损伤分度。研究显示，当损伤分度AIS≥3度时DVT的发生风险明显增高，这可能与严重软组织创伤后机体易发生凝血功能紊乱、血管内皮损伤、炎性因子释放、血流缓慢等情况相关；杨超[22]及傅一牧等[23]的研究结果同样显示创伤严重程度影响着下肢DVT的发生，严重创伤后，机体纤溶系统迅速激活，血液处于高凝和纤溶亢进状态，D-二聚体值升高（ > 0.5 μg/mL），DVT形成风险增高。因此，对于严重的下肢软组织创伤患者，笔者需积极关注DVT事件的发生。
3.2.3 临床管理因素
下肢软组织创伤发生后，因对伤情的认识不足及对软组织创伤的重视不够，多数患者未入院行积极有效的诊治，导致入院等待时间延长，显著增加了下肢软组织创伤并发DVT形成的风险。伤后及时入院，进一步完善各项检查，对患者采取积极有效措施，及时行DVT风险评估及积极预防，可有效降低创伤后DVT的形成风险。李树灏等[24]对下肢闭合骨折患者不同院前等待时间进行研究，也确认了院前等待时间的延长与下肢DVT的发生具有相关性。本组病例中，未预防性抗凝组DVT的发生率是预防性抗凝组的10.23倍，预防性抗凝有效降低了下肢软组织创伤DVT的发病率；这与Kujath[25]及侯国进等[26]对下肢骨折患者的研究结果一致。对于多数下肢软组织创伤患者未进行预防性抗凝，我们分析认为可能存在的原因：（1）临床普遍重视处理骨折，对软组织创伤及其并发症的处理重视程度不够；（2）单纯软组织创伤导致的肿胀、疼痛、青紫容易掩盖DVT症状；（3）下肢软组织创伤并发DVT的发病率、临床特点、易患因素不明，无法开展规范防治。
3.3 研究的局限性
本研究属于单中心回顾性研究，研究结果和结论尚不能完全反应所有下肢软组织创伤患者并发DVT的真实临床情况，且DVT的发生受多因素的影响。进一步的研究还需要联合多中心，对纳入对象进行更加细致、精准分层，尽量排除干扰因素。
综上，下肢软组织创伤并发DVT的发生率虽不高，但DVT始终伴随着PE发生的风险。因此，下肢软组织创伤并发DVT也应该受到足够重视，并给予积极防治。针对存在高风险因素的患者，根据软组织损伤分度系统进行损伤情况评估，可以为临床防治DVT提供参考。
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图 1 3种培养条件对MPM细胞形态和增殖的作用
A：倒置显微镜下观察P1、P5和P10细胞形态（100×）；B：CCK-8检测P1、P5和P10细胞细胞增殖活力；与RPMI-1640组比较，*P < 0.05；与DMEM组比较，△P < 0.05；P1：第1代；P5：第5代；P10：第10代。
Figure 1. Effect of three culture conditions on morphology and proliferation of MPM cells
图 3 免疫荧光检测MPM细胞标志物（40×）
Figure 3. The MPM cells biomarkers were detected by immunofluorescence assay（40×）
图 4 CDKN2B调控MPM细胞增殖、侵袭、上皮间质转化和凋亡
A：RT-qPCR检测CDKN2B mRNA表达；B：Western blot检测CDKN2B蛋白表达；与MET-5A组相比，*P < 0.05；C：RT-qPCR检测pcDNA-CDKN2B转染效率；D：Western blot检测pcDNA-CDKN2B转染效率；E：CCK-8检测细胞增殖活力；F：Transwell检测细胞侵袭能力；G：Western blot检测细胞上皮间质转化相关标志物的蛋白表达；H：流式细胞术检测细胞凋亡率；I：Western blot检测细胞凋亡相关标志物的蛋白表达；与pcDNA-NC组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
Figure 4. CDKN2B modulated the proliferation，invasion，epithelial interstitial transformation and apoptosis of MPM cells
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