Role of HK2 and VDAC1 in Diacetylmorphine-induced Cardiomyocyte Apoptosis
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摘要:
目的 探讨HK2和VDAC1在二乙酰吗啡致心肌细胞凋亡中的作用。 方法 采用剂量递增方法，建立二乙酰吗啡成瘾大鼠模型。将40只SD大鼠随机分为3组，正常组（Control，n=10）皮下注射等量生理盐水；模型组（Model，n=15）首次皮下注射二乙酰吗啡剂量为 5 mg/kg，以后逐日递增剂量 2.5 mg/（kg·d），连续注射20 d；模型+10 D组（Model+10D，n=15）在模型组基础上继续递增剂量至第10天。采用ELISA法检测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷草转氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）含量；采用 HE 染色观察各组心肌组织病理变化；采用TUNEL染色检测各组心肌组织细胞凋亡；采用免疫组化、RT-qPCR和Western blot检测HK2、VDAC1及凋亡相关因子的mRNA和蛋白的表达变化。 结果 HE染色发现随着二乙酰吗啡干预时间的延长，心肌组织表现出不同程度的损伤。与正常组相比，模型组中血清LDH、GOT含量及心肌凋亡率升高，HK2和抗凋亡因子Bcl-2的mRNA和蛋白水平下降，VDAC1和促凋亡因子Bax、Caspase-3的mRNA和蛋白水平升高，Clevead Caspase-3蛋白水平升高；与正常组相比，模型+10 D组中以上指标，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 二乙酰吗啡可导致心肌细胞凋亡，HK2和VDAC1可能参与了二乙酰吗啡致心肌细胞凋亡的过程。 -
关键词:
- 二乙酰吗啡 /
- 心肌凋亡 /
- 己糖激酶2 /
- 电压依赖性阴离子通道1 /
- 裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3
Abstract:Objective To investigate the role of HK2 and VDAC1 in diacetylmorphine-induced cardiomyocyte apoptosis. Methods A dose-escalation method was used to establish a rat model of diacetylmorphine addiction. Forty SD rats were randomly divided into three groups, the normal group （n=10） was injected with an equal amount of saline subcutaneously, the model group （n=15） was injected with 5 mg/kg of diacetylmorphine for the first time, and then the dose was increased by 2.5 mg/ （kg·d） day by day for 20 days, and the group of model + 10 D （n=15） continued to increase the dose based on the model group up to the 10th day. Lactate dehydrogenase （LDH） and glutamic oxaloacetic transaminase （GOT） were detected by ELISA; HE staining was used to observe the pathological changes of myocardial tissues in each group; TUNEL staining was used to detect apoptosis in myocardial tissues in each group; and immunohistochemistry, RT-q-analysis, and immunochemistry were used to detect apoptosis in myocardial tissues in each group. Immunohistochemistry, RT-qPCR and Western blot were used to detect the mRNA and protein expression of HK2, VDAC1 and apoptosis-related factors. Results HE staining revealed that myocardial tissues exhibited different degrees of damage with the prolongation of diacetylmorphine intervention. Compared with the normal group, serum LDH, GOT content and myocardial apoptosis rate increased in the model group, mRNA and protein levels of HK2 and anti-apoptotic factor Bcl-2 decreased, mRNA and protein levels of VDAC1 and pro-apoptotic factors Bax and Caspase-3 increased, and the protein level of Clevead Caspase-3 increased; in the model + 10 D group the above indexes, there was a statistically significant difference （P < 0.05）. Conclusion Diacetylmorphine can cause cardiomyocyte apoptosis, and VDAC1 may be involved in the process of cardiomyocyte apoptosis caused by diacetylmorphine. -
Key words:
- Diacetylmorphine /
- Cardiac apoptosis /
- HK2 /
- VDAC1 /
- Clevead Caspase-3
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左心室异常为高血压病靶器官损伤的重要并发症。对高血压病左心室重构机制及逆转的研究发现，早期诊断高血压病左心室异常并及早干预可改善预后[1-3]。UCG为观察心脏结构性改变的主要检查手段之一，ECG是了解心脏电活动变化的重要检查方法，目前均为高血压病左心室异常的重要检查手段。VCG作为了解心脏电活动变化的检查方法，近年来为广大心电工作者所重视。环体的形成与心脏结构和电活动传导密切相关。有研究认为VCG可作为高血压病社区防治中对左心室肥厚进行筛查随访的检查方法[4]。为进一步深入探讨VCG对高血压病左心室异常的诊断价值，对76例高血压患者的ECG、VCG和UCG进行回顾性分析，探讨高血压病早期左心室异常的检测方法，为临床及早干预治疗提供诊断依据。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
2017年09月至2019年10月在昆明市中医医院临床诊断为高血压病的门诊和住院患者。纳入标准：（1）年龄 > 18岁；（2）参照《中国高血压基层管理指南》[5]及美国《2014年成人高血压循证管理指南》[6]标准诊断高血压病，（3）病历资料完整。排除标准：合并冠心病，糖尿病、心肌病、肺心病、心室预激及其它器质性心脏病者。纳入研究病例：男22例，女54例。年龄32岁～92岁。所有患者均在同一次住院或门诊时完成ECG、VCG及UCG检查。研究经昆明市中医医院伦理委员会批准，患者知情并同意。
1.2 研究方法
VCG检查按Frank导联安放电极，患者平卧放松图形基线平稳后采集VCG不低于20 s。基线漂移、肌电干扰和交流电干扰较大者排除。
ECG检查按Wilson导联安放电极，图形采集要求同VCG。
二项检查均用华南医电GY-5000A型立体心电图仪完成。
UCG检查患者取左侧卧位，调整探头位置清晰显示心内膜，于左室长轴切面，在二维超声下分别对左室舒张末期内径、舒张末期左室后壁厚度、舒张末期室间隔厚度进行3次测量，取平均值作为最终测量值。检查设备采用LOGIQ E9型超声诊断仪。
1.3 观察指标
1.3.1 比较UCG与VCG左心室异常检出情况
（1）QRS环起始向右向量振幅、起始右前向量振幅、起始向右运行时间为判断室间隔异常的指标，QRS环空间最大向量振幅为判断左心室后壁异常和左心室扩大的指标，以上4项中任意1～4项异常，判定为VCG检出左室异常（阳性）；（2）室间隔厚度、左室后壁厚度、左室舒张末期内径，任意1～3项异常，判定为UCG检出左室异常（阳性）[7]。
1.3.2 比较VCG与ECG的异常检出情况
（1）计算VCG和ECG对除极异常、复极异常、除极与复极均异常（阳性）检出率；（2）以VCG为标准，统计ECG对左室电活动异常的漏诊情况。
1.3.3 判断标准[8-9]
（1）QRS环起始向右向量振幅 ≥ 0.16 mv、起始右前向量振幅 ≥ 0.18 mv、起始向量向右运行时间 ≥ 20 ms[8]、最大空间向量振幅 ≥ 1.93 mv[9]，判定为VCG检出左室异常。室间隔厚度 > 11.4 mm、左室后壁厚度 > 11.1 mm、左室舒张末期内径 > 54 mm判定为UCG检出左室异常[7, 10]。（2）ECG出现T波异常和/或ST段异常、VCG出现T环异常和/或ST向量异常，判定为心室复极异常，其它的异常为心室除极异常，二者兼有为除极与复极均异常，二者均无为正常。（3）其它诊断标准：VCG诊断标准参照《心电向量图入门》[8]；ECG诊断标准参照《心电图学》[11]。
1.4 统计学处理
采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计数资料的比较采用配对χ2检验，以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 VCG与UCG左室异常检出比较
VCG与UCG的左室异常检出结果比较，VCG的阳性检出率（55.3%）显著高于UCG（38.2%），（χ2 = 4.57），差异具有统计学意义（P < 0.05），见表1。
表 1 UCG与VCG对左心室异常检出情况比较（ n）Table 1. Comparison of left ventricular abnormalities detection between UCG and VCG （n）检查方法 检出 未检出 合计 检出率（%） UCG 29 47 76 38.2 VCG 42 34 76 55.3* 合计 71 81 152 53.3 与UCG比较，*P < 0.05。 2.2 VCG与ECG左室电活动异常检出情况比较
VCG与ECG左室电活动异常检出情况比较结果，VCG的阳性检出率（88.2%）显著高于ECG（71.1%），（χ2 = 8.47），差异具有统计学意义(P < 0.01)，见表2。
表 2 VCG与ECG阳性检出率比较（n）Table 2. Comparison of the positive detection rate between VCGand ECG （n）检查方法 检出 未检出 合计 检出率（%） ECG 54 22 76 71.1 VCG 67 9 76 88.2* 合计 121 31 152 53.3 与ECG比较，*P < 0.05。 2.3 左室电活动异常检出情况
VCG与ECG在心脏电活动异常的检查情况比较显示，二种方法对心脏电活动异常的检出，差异无统计学意义（P > 0.05），见表3。
表 3 ECG和VCG电活动异常检出情况[项（%）]Table 3. Detection rate of abnormal ECG and VCG electrical activity [ piece（%）]检出情况 VCG ECG P 除极异常 3（3.9） 8（10.5） 0.12 除极与复极均异常 21（27.6） 12（15.8） 0.08 复极异常 43（56.6） 34（44.7） 0.11 2.4 ECG对心电异常漏诊情况
以VCG为标准，ECG漏诊电活动异常共25项，漏诊最多的为心室复极异常，其次分别为左心室高电压和分支阻滞，见表4。
表 4 ECG对心电异常漏诊情况Table 4. Missed diagnosis of abnormal ECG by ECG漏诊项目 漏检数（项） 心室复极异常（T环异常） 18 左心室高电压 4 分支阻滞 3 合计 25 3. 讨论
随着社会经济发展，高血压病发病率居高不下，并有逐年上升的趋势[12]。左心室肥大是其靶器官损伤的重要并发症之一，有学者对UCG与ECG诊断高血压病左心室肥大的指标进行探讨研究，肯定了UCG和ECG对高血压病左心室异常的诊断价值[13-15]。VCG从空间角度描述心脏电活动，能详尽反映心脏电活动的早期异常，弥补心电图的诊断不足。且其环体形成与心脏结构密切相关，与超声心动图联合运用可提高早期左心室异常阳性检出率。
心室除极最早从室间隔左侧面开始，由左后向右前推进，向下向上完成室间隔除极。起始20 ms向量可大致反映室间隔除极情况。侧壁心肌梗死、心肌病及心室预激（C型）等均可使起始向量增大，在排除上述情况后，QRS环起始向量增大可作为反映高血压病室间隔异常的指标。而QRS环最大向量的形成与左室后壁及整个左心室除极相关，左室后壁肥厚、左室扩大均可使QRS环振幅增大。将QRS环起始向量测量值与室间隔厚度比较、QRS环最大向量振幅与左室后壁测量值、左室舒张末期内径比较，可反映2种方法对左室异常的检出情况。比较显示，VCG左心室异常阳性检出率高于UCG。分析与心脏电活动异常早于结构学异常有关[16]。但心电向量环的形成受多种因素影响，例如向量的相互抵消和相互叠加等均会使向量的大小和方向发生改变，正如观察对象中有室间隔测量值增大而VCG起始向量正常者，考虑与此有关。UCG观察心脏结构直观准确，VCG可发现早期心脏电活动异常，但受各部位向量的相互影响使其表现相互掩盖而变得不典型。因此强调在应用VCG对高血压病左心室异常诊断时，应密切结合临床，并参考UCG结果进行综合判断。
VCG与ECG同为反映心脏电活动的检查手段。二者对心脏电活动异常的检出情况对照发现，VCG阳性检出率明显高于ECG。以VCG为标准，ECG漏诊心室复极异常（T环异常）18项。T环异常包含：T环振幅异常、形态异常、运行方向异常、方位异常、运行速度异常等，一般情况T环振幅和方位异常投影于心电导联轴可形成异常T波。而其它T环异常并不一定形成异常T波。因此，对高血压病心室复极异常的诊断，T环更能从多角度反映，有助于发现早期复极异常。
对左室高电压的诊断，以VCG为标准，ECG漏诊4项。VCG的空间最大向量振幅反映的是从原点到立体心电向量环最远端的距离，真实反映了左心室除极的最大电压。环体在投影形成心电图的过程中，位置稍有偏移即可导致QRS波群电压变化，故导致检查阳性率不同。
高血压病收缩期负荷过重、左心室肥厚、室间隔肥厚，可致左室内束支和分支阻滞。以VCG为标准，ECG漏诊分支阻滞3项，其中左间隔支阻滞2项、左前分支阻滞1项。多数正常人存在左间隔分支，其阻滞的发生率低于右束支和左前分支，高于左后分支和左束支，其发生与左心室肥大及室间隔负荷过重导致左间隔分支受损有关[17]。左前分支传导阻滞亦跟高血压病左心室异常有关。ECG对室内传导阻滞依靠心室除极向量改变向心电导联轴投影后的QRS波形态变化进行诊断，投影过程中难免有部分信息出现偏差致图形不典型，而VCG以环状图形在空间上表达心脏电活动变化，对观察心室电活动传导改变更为直观，对ECG表现不典型的束支和分支阻滞能给予支持、肯定和否定的诊断。在束支和分支阻滞的诊断上能弥补心电图的不足。
综上所述，在对高血压病左室异常的诊断上，VCG有较高的异常检出率，对心脏电活动异常的阳性检出率明显高于ECG，特别对心室复极异常、左室除极电压异常和分支阻滞等，较心电图有更高的检出率。VCG联合UCG可及早发现高血压左心室异常。但本研究为单中心小样本回顾性研究，且心电向量环的形成较为复杂，受多因素影响，在对高血压病早期左心室异常的诊断上，特别是心室除极异常与心室结构异常的关系上，有待于多中心大样本的前瞻性研究及进一步观察。
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图 1 各组LDH、GOT表达水平（$ \bar x \pm s $，n=6）
A：大鼠血清中LDH表达；B：大鼠血清中GOT表达。与正常组比较，***P<0.001。
Figure 1. LDH and GOT levels in each group（$ \bar x \pm s $，n=6）
图 2 各组大鼠心肌组织形态学比较（×200）
A：正常组大鼠心肌组织的HE染色；B：模型组大鼠心肌组织的HE染色；C：模型+10 D组大鼠心肌组织的HE染色。
Figure 2. Comparison of myocardial tissue morphological changes among different roups of rats（×200）
图 3 各组大鼠心肌细胞凋亡情况（×200）
A：正常组TUNEL染色；B：模型组TUNEL染色；C：模型+10 D组TUNEL染色；D：正常组DAPI染色；E：模型组DAPI染色；F：模型+10 D组DAPI染色；G：正常组Merge染色；H：模型组Merge染色；I：模型+10 D组Merge染色；J：各组大鼠心肌细胞凋亡表达情况（$ \bar x \pm s $，n=6）。与正常组比较，***P<0.001。
Figure 3. Apoptosis of cardiomyocytes in each group of rats （×200）
图 4 大鼠心肌组织HK2、VDAC1、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达（×200）
A：正常组HK2表达；B：模型组HK2表达；C：模型+10 D组HK2表达；D：正常组VDAC1表达；E：模型组VDAC1表达；F：模型+10 D组VDAC1表达；G：正常组Bax表达；H：模型组Bax表达；I：模型+10 D组Bax表达；J：正常组Bcl-2表达；K：模型组Bcl-2表达；L：模型+10 D组Bcl-2表达；M：正常组Caspase-3表达；N：模型组Caspase-3表达；O：模型+10 D组Caspase-3表达；P：大鼠心肌组织HK2、VDAC1、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白AOD表达情况（$ \bar x \pm s $，n=6）。与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
Figure 4. Expression of HK2，VDAC1，Bax，Bcl-2 and Caspase-3 protein in rat myocardial tissue （×200）
图 5 大鼠心肌组织HK2、VDAC1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达（$ \bar x \pm s $，n=6）
Figure 5. Expression of HK2，VDAC1，Bax，Bcl-2 and Caspase-3 mRNA in rat myocardial tissue（$ \bar x \pm s $，n=6）
图 6 各组心肌组织中HK2、VDAC1、Bax、Bcl-2、Caspase-3和Cleaved Caspase-3蛋白表达变化（$\bar x \pm s $，n=6）
A：各组蛋白印迹图；B：各组蛋白表达情况。
Figure 6. Changes in Protein Expression of HK2, VDAC1, Bax, Bcl-2, Caspase-3, and Cleaved Caspase-3 in Myocardial Tissues of Various Groups （$\bar x \pm s $，n=6）
表 1 二乙酰吗啡对心肌组织中HK2、VDAC1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达的影响（$ \bar x \pm s $，n=6）
Table 1. Effects of diamorphine on the mRNA expression of HK2，VDAC1，Bax，Bcl-2 and Caspase-3 in myocardium（$ \bar x \pm s $，n=6）
基因 正常组 模型组 模型+10 D组 F P HK2 1.00±0.00 0.57±0.14* 0.24±0.09*** 48.77 0.009# VDAC1 1.00±0.00 3.00±0.61** 4.46±0.25*** 32.62 0.027# Bax 1.00±0.00 4.88±0.17* 7.64±0.44* 50.32 0.001# Bcl-2 1.00±0.00 0.75±0.10* 0.39±0.05*** 34.86 0.020# Caspase-3 1.00±0.00 1.91±0.11* 3.78±0.38** 45.67 0.020# 与正常组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。组间比较，#P < 0.05。 
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