Effect of MSC-exo，a New Cell Delivery Tool，on Gene Delivery and Proliferation of Pancreatic Cancer
-
摘要:
目的 观察1种新型细胞递送工具（MSC-exo）转运靶向基因调控胰腺癌增殖效应。 方法 透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）和纳米颗粒跟踪分析技术（nanoparticle tracking analysis，NTA）鉴定人间充质干细胞外泌体（human mesenchymal stem cell exosomes，MSC-exo）并转运miR-450a-5p进入CFPAC-1，探讨miR-450a-5p靶向BZW2抑制胰腺癌细胞增殖效应。基因技术处理Pc-BZW2，CCK-8、EdU、细胞划痕、Transwell验证MSC-exo与MSC-exo-miR-450a-5p对细胞的抑制作用。 结果 与胰腺正常组织相比miR-450a-5p在胰腺癌组织中低表达（P<0.05），CFPAC-1细胞MSC-exo-miR-450a-5p外泌体标记蛋白CD63、TSG101表达高于MSC-exo（P<0.05）。CCK-8、EdU、细胞划痕、Transwell实验显示MSC-exo-miR-450a-5p较MSC-exo可显著抑制CFPAC-1细胞增殖、侵袭和迁移（P<0.05）。通过双荧光素酶实验证实，miR-450a-5p靶向BZW2，并且RT-qPCR和免疫印迹检测miR-450a-5p和 BZW2表达成负性相关（P<0.05）。过表达BZW2，CCK-8、EdU、细胞划痕、Transwell实验均证实，pc-BZW2逆转MSC-exo-miR-450a-5p对CFPAC-1的抑癌功能，免疫印迹检测PCNA、Ki-67、MMP2、MMP9，结果与上述实验一致（P<0.05）。 结论 hMSC-exo是1种新的递送系统，靶向BZW2转运miR-450a-5p抑制胰腺癌细胞的生物学恶性，为胰腺癌靶向治疗研究提供了重要线索。 -
关键词:
- 胰腺癌 /
- 间充质干细胞 /
- 外泌体 /
- miR-450a-5p /
- BZW2
Abstract:Objective To observe the effect of a new cell delivery tool （MSC exo） on the proliferation of pancreatic cancer by transferring targeted genes. Methods Transmission Electron Microscope （TEM） and Nanoparticle Tracking Analysis（NTA） were used to identify human mesenchymal stem cell exosomes（MSC-exo） and transport miR-450a-5p into CFPAC-1, to explore the effect of miR-450a-5p targeting BZW2 on inhibiting the proliferation of pancreatic cancer cells. Results The expression of miR-450a-5p was low in pancreatic cancer tissue （P<0.05）, and the expression of CD63 and TSG101 of MSC-exo-miR-450a-5p in CFPAC-1 cells was higher than that of MSC-exo by Western blot（P<0.05）. CCK-8 and EdU results showed that MSC-exo-miR-450a-5p significantly inhibited the proliferation of CFPAC-1 cells （P<0.05）. Cell scratch and Transwell experiments showed that MSC-exo-miR-450a-5p can inhibit the migration and invasion of CFPAC-1 cells （P<0.05）. Through dual luciferase assay, it was confirmed that miR-450a-5p targets BZW2, and RT-qPCR and Western blotting showed a negative correlation （P<0.05） between miR-450a-5p and BZW2 expression. Overexpression of BZW2, CCK-8, EdU, cell scratch, and Transwell experiments confirmed that pc-BZW2 reversed the anti-cancer function of MSC-exo-miR-450a-5p on CFPAC-1. Western blot detected PCNA,Ki-67,MMP2,MMP9, and the results were consistent with the above experiments （P<0.05）. Conclusion hMSC exo is a new delivery system, targeting BZW2 to transport miR-450a-5p to inhibit the biological malignancy of pancreatic cancer cells, which provides an important clue for the research of targeted treatment of pancreatic cancer. -
Key words:
- Pancreatic adenocarcinoma /
- Mesenchymal stem cell /
- Exosomes /
- miR-450a-5p /
- BZW2
-
胰腺恶性肿瘤90%是胰腺导管腺癌，恶性程度高，起病隐匿，进展迅速[1]。患者早期症状不典型，大多数在临床治疗时已处于临床诊断晚期[2]。近来，胰腺癌的发病率在全球范围内呈上升趋势，2021年的统计数据显示[3]，在美国所有恶性肿瘤中，胰腺癌发病率在男性中排名第10，在女性中排名第9，在癌症相关死亡率中排名第4。据中国国家癌症中心2021年统计[4]，中国胰腺癌易发中年男性，恶性肿瘤相关死亡率排名第6。随着影像学、内窥镜检查、病理学等学科的发展，癌症的诊断水平有所提高。根治性胰十二指肠切除术、吉西他滨或替吉奥辅助化疗的临床运用，为胰腺癌的有效性治疗带来了机遇。
增殖和转移是胰腺癌患者死亡的主要原因[5]。以前的研究发现miRNAs是调节这2种生物行为的关键因素[6-7]。基于显微解剖和微阵列芯片分析技术的研究结果，与正常胰腺导管细胞相比，miR-10b在胰腺癌细胞中显著升高，且miR-10b的高表达与患者生存率差呈正相关[8]。此外，miR-34b在胰腺癌中的表达降低，通过CpG甲基化抑制肿瘤转移[9]。有趣的是，miR-126表达在浸润性导管腺癌中显著降低，而miR-126表达增加抑制肿瘤侵袭和上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）能力[10]。这些miRNA与胰腺癌的转移、侵袭和预后相关，但调控这些过程的机制尚不清楚。因此，miRNA的治疗方法仍需进一步研究。
最近，miR-450a-5p在各种癌症中被广泛研究[11-12]。Zhang等[13]采用生物信息学方法，报道miR-450a-5p可能通过参与MET通路影响肺癌的发展。此外，miR-450a-5p被证实通过靶向WISP2促进成脂分化；在胃癌中，它异常表达影响细胞增殖、迁移和侵袭[14]。然而，miR-450a-5p在胰腺癌中的作用机制尚不清楚。
外泌体是多泡体与质膜融合时释放到细胞外环境的膜泡[15]。以往的研究[16]已经报道，外泌体可以有效地传递生物药物，然后通过分子途径靶向和识别肿瘤细胞，实现精确的药物传递。本研究旨在探索miR-450b-5p在胰腺癌中的表达，将miR-450a-5p转染间充质干细胞来源的外泌体（MSC-exo-miR-450a-5p），并探讨其下游靶基因，为胰腺癌的治疗提供潜在靶点。
1. 材料与方法
1.1 数据来源
“STARBASE”（http://starbase.sysu.edu.cn/panCancer.php）是1个在线非编码RNA研究数据库。“PAN-CANCER”软件可用于分析32种肿瘤组织与正常组织中miRNA和基因表达的差异。纳入患者资料主要来源于癌症基因组图谱（the cancer genome atlas ，TCGA）。用PITA、miRanda和miRmap筛选miR-450a-5p靶点。
1.2 方法
1.2.1 MSC-exo提取及细胞转染
人正常胰腺细胞系（HPC-Y5）、人胰腺癌细胞系（CFPAC-1、PANC-1）和人骨髓间充质干细胞系由中国科学院昆明动物研究所捐赠。常规培养于含10%FBS的RPMI-1640培养基（Gibco）中。当hMSCs在完全培养基中的增殖率达到80%～90%时，用MEM培养基代替原培养基，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养72 h。取培养上清，以3000 r/min离心30 min，去除细胞碎片，用0.22 μm滤膜过滤，去除可能的凋亡小体。利用Exosome分离试剂盒沉淀MSC-exo。Exo-Fect Exosome转染试剂盒（EXFT10A-1，System biosciences）将核酸直接转移到分离的外泌体中。将miR-450a-3p、Exo-Fect试剂和分离的hMSC外泌体混合均匀后与靶细胞共培养。用脂质体2000（Invitrogen）转染Pc-BZW2和Pc-NC。
1.2.2 外泌体形态鉴定
用TEM观察了样品中外泌体的形态结构和大小。将样品滴加到铜网中，60 s后，用滤纸吸干表面悬浮液。滴加醋酸铀试剂反应15 s，再用滤纸再次除去表面浮液。在白炽灯下干燥后，在透射电镜下观察并拍照。外泌体多为碟形，直径大于100 nm，具有明显的双层膜结构[17]。
1.2.3 NTA粒度分析
过滤新鲜提取的外泌体，用磷酸盐缓冲液稀释，然后缓慢注入NTA仪器（Malvern Pan alytical，Malvern，UK），分析外泌体粒径。
1.2.4 CFPAC-1细胞对MSC-exo的摄取
将CFPAC-1细胞以2×105个细胞/孔接种于35 mm培养皿中，并在37 ℃培养箱中培养过夜。将染色液（PKH26，Sigma-Aldrich，USA）加入MSC-exo中，混合，然后在4 ℃下（2×105 g） 1 h。再悬浮后加入CFPAC-1细胞培养6 h，用4%多聚甲醛固定30 min，加入2 mg/mL甘氨酸中和过量醛基，摇瓶培养5 min，共加入渗透剂1 mL，孵育10 min，以1∶1000的体积比加入DAPI染色液。样品用PBS清洗，在激光共聚焦显微镜下拍照（LSM5 Live Carl Zeiss，Germany）。
1.2.5 RT-qPCR分析
使用TRIzol试剂（Invitrogen，CA）从外泌体和细胞中提取RNA，后立即进行反转录。提取的总RNA严格按照miScript II RT试剂盒（QIAGEN，GER）的指示反转录为cDNA，然后进行实时荧光定量PCR。在ABI7500快速PCR仪上实时荧光定量PCR检测cDNA和对照样品的相对表达水平，并用2-△△CT法进行统计分析，引物序列见表1。
表 1 引物序列Table 1. Primer sequence基因 上游 下游 miR-450a-5p 5'-TTTTGCGATGTGTTCC-3' 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' U6 5'-TGCTCACTGTCTAAAATTGG-3' 5'-AGAAGAAGTCTGCTGTTGAC-3' BZW2 5'-CTAACAGGCCAGCGGTTCAAA-3' 5'-GGACAAGTGTATCCCTGAAGACT-3' B-actin 5'-ACACAGTGCTGTCTGGTGGT-3' 5'-TGATCTTCATGGTGCTGGGAG-3' 1.2.6 蛋白质印迹分析
分组处理细胞，裂解液裂解、离心，提取上清液，煮沸10 min，通过10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质并转移到PVDF膜上。将分离的蛋白质用5%脱脂乳封闭2 h，加一抗4 ℃孵育过夜体，β-actin（1∶5000）、CD63（1∶1000）、TSG101（1∶1000）、PCNA（1∶1000）、Ki-67（1∶5000）、MMP-2（1∶1000）、MMP-9（1∶1000）和BZW2（1∶500）。用TBST洗膜3次，二抗孵育2 h。洗膜3次后，ECL溶液进行发光显影，Image J（v1.8.0.345）软件（ImageJ software Inc，USA）分析数据。本实验所有抗体购自武汉三鹰生物技术公司。
1.2.7 CCK-8测定
将每组细胞的浓度调整为1×105/mL，每孔100 μL浓度接种96孔板。将细胞置于培养箱中培养72 h，加入10 μL/孔CCK-8 试剂检测吸光度。
1.2.8 EdU增殖测定
将每组细胞接种在96孔板中，并在实验结束前6 h加入EdU试剂进行孵育。固定、渗透和洗涤后，加入工作液，避光孵育30 min。用PBS洗涤后，将1X Hoechst 33342反应溶液加入每个孔中反应30 min。在倒置荧光显微镜下观察并收集图像。使用ImageJ软件对EdU-阳性细胞的数量和DAPI标记的细胞的数量进行计数，统计增殖率。
1.2.9 划痕实验测定
将每组细胞接种在6孔板上。当细胞融合率达到80%～90%时，用200 μL移液管尖端在中心画1条直线，在单层细胞之间形成划痕，培养24 h。在显微镜下观察并拍照，用ImageJ软件测量迁移距离。
1.2.10 Trans-well测定
将20 μL基质胶（Gibco）涂布在Transwell上室。将含有6×104个细胞的200 μL悬浮液加入上室，将含有20%FBS的600 μL培养基加入下室。在继续培养24 h后，移除上室。用多聚甲醛固定细胞，用结晶紫染色，在光学显微镜下拍照并计数。侵袭实验，不使用基质胶，其他步骤与上述相同。
1.2.11 双荧光素酶报告基因测定
通过双荧光素酶报告基因实验验证了miR-450a-5p和BZW2之间的靶向关系。构建了野生型BZW2 3’ -UTR的荧光素酶基因质粒和携带突变体BZW2 3’ -UTR的基因质粒。用野生型或突变基因质粒、miR-450a-5p模拟物和NC共转染细胞。转染24 h后，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定各组细胞的荧光素素酶活性。
1.3 统计学处理
计量资料采用均数±标准差 （$ \bar x \pm s $） 表示，用SPSS 19.0对数据进行分析，用GraphPad Prism 6.0软件作图。2组间比较采用独立样本t检验，多组间的比较采用单因素方差分析，多组间任意2组间的比较采用Tukeys方法进行分析。P<0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 在胰腺癌组织和细胞中miR-450a-5p低表达
在“ STARBASE”数据库中分析了共178个癌症患者组织样本和4个正常胰腺组织样本。miR-450a-5p在胰腺癌组织中的表达水平低于正常胰腺组织（P<0.05），见图1A。采用RT-qPCR测人胰腺癌症细胞系（CFPAC-1，PANC-1）和HPC-Y5细胞系中的miR-450a-5p的表达。CFPAC-1和PANC-1细胞系的miR-450a-5p表达低于HPC-Y5细胞，见图1B。因此，miR-450a-5p在胰腺癌组织和细胞中的表达水平较低。
图 1 胰腺癌组织和细胞中miR-450a-5p呈低表达（$\bar x \pm s$， n=6）A：miR-126-5p在胰腺癌组织中的表达水平低于正常胰腺组织；与Normal组比较，*P<0.05；B：CFPAC-1和PANC-1细胞系的miR-450a-5p表达低于HPC-Y5细胞，与HPC-Y5组比较，***P<0.001。Figure 1. The expression of miR-450a-5p was low in pancreatic cancer tissues and cells. （$\bar x \pm s$，n=6）2.2 CFPAC-1细胞摄取MSC-exo-miR-450a-5p
在固定的透射电子显微镜下，典型的MSC-exo和MSC-exo-miR-450a-5p是圆形或椭圆形的，见图2A。MSC-exo和MSC-eco-miR-450a-5p组的外泌体的主要尺寸约为120 nm，见图2B。免疫印迹结果显示，外泌体标记蛋白（CD63和TSG101）在MSC-exo和MSC-exo-miR-450a-5p中表达，见图2C。此外，miR-450a-5p在MSC-exo-miR-450a-5p组中的表达高于MSC-exo组，见图2D。检测了CFPAC-1细胞对外泌体的摄取能力，CFPAC-1细胞吸收了MSC-exo和MSC-exo-miR-450a-5p，见图2E。基于此证据，MSC-exo和miR-450a-5p成功结合并被CFPAC-1细胞摄取。
图 2 CFPAC-1细胞摄取MSC-exo-miR-450a-5pA：使用生物透射电子显微镜（TEM）观察样品中外泌体的形态和大小；B：外泌体和MSC-exo的平均粒径和主峰；C：标记蛋白（CD63和TSG101）的表达水平在MSC-exo-miR-450a-5p组中较高；D：miR-450a-5p在MSC-exo-miR-450a-5p组中的表达高于MSC-exo组；E：CFPAC-1细胞摄取MSC-exo和MSC-exo-miR-450a-5p。与MSC-exo组比较，***P<0.001。Figure 2. CFPAC-1 cells uptake MSC-exo-miR-450a-5p2.3 MSC-exo-miR-450a-5p抑制CFPAC-1的增殖
经过处理后，发现MSC-exo-miR-450a-5p显著抑制细胞增殖，而MSC-exo无作用，见图3A；EdU分析显示相似的结果，见图3B。免疫印迹检测PCNA和Ki-67增殖蛋白，MSC-exo蛋白表达较对照组差异无统计学意义，而MSC-exo-miR-450a-5p组的增殖蛋白表达量显著低于对照组（P<0.05），结果证实MSC-exo-miR-450a-5p对细胞增殖具有抑制作用，见图3C。MSC-exo-miR-450a-5p抑制了细胞的侵袭和迁移过程，见图3D～3E。此外，MSC-eco-miR-450a-5b也抑制了MMP2和MMP9的蛋白表达，见图3F。上述结果表明，MSC-eto-miR-450a-5b抑制了CFPAC-1细胞的生物学行为。
图 3 MSC-exo-miR-450a-5p抑制CFPAC-1细胞生物学行为A：MSC-exo-miR-450a-5p显著抑制胰腺癌细胞增殖；B：EdU测定MSC-exo-miR-450a-5P对细胞的增殖影响；C：用蛋白质印迹法检测增殖相关蛋白的水平；D～E：MSC-exo-miR-450a-5p抑制侵袭和迁移；F：MMP2和MMP9的蛋白水平被MSC-exo-miR-450a-5p抑制，与MSC-exo组比较，***P<0.001。Figure 3. MSC-exo-miR-450a-5p inhibits the biological behavior of CFPAC-1 cells2.4 miR-450a-5p靶向BZW2
PITA、miRanda和miRmap用于筛选miR-450a-5p的靶标。取3个数据库的交叉点，共筛选出3个基因，见图4A。根据“TargetScan”数据库，miR-450a-5p和BZW2的结合，见图4B。与对照组相比，用miR-450a-5p模拟物转染的BZW2-Mut细胞的双荧光素酶活性显著增加（P<0.01），而BZW2-WT组的双荧光素酶活性没有显著变化，见图4C。因此，miR-450a-5p靶向BZW2。
图 4 miR-450a-5p靶向BZW2A：PITA、miRanda和miRmap数据库中miR-450a-5p靶点的交叉点；B：miR-450a-5p和BZW2的组合；C：双荧光素酶报告基因测定，与NC mimic组比较，***P<0.001。Figure 4. MiR-450a-5p targets BZW22.5 BZW2在CFPAC-1细胞中高表达
BZW2在胰腺癌组织中的表达水平高于对照组，见图5A。同样，它在胰腺癌细胞中的表达也较高，见图5B。RT-qPCR和免疫印迹分析检测了用miR-450a-5p模拟物转染的胰腺癌细胞的BZW2表达，结果表明miR-450a-5p模拟物明显降低了BZW2的水平，见图5C～5D。最后，相关性分析证实miR-450a-5p负调控BZW2表达，见图5E。这些结果证实miR-450 a-5p在胰腺癌细胞中负调控BZW2的表达。
图 5 BZW2在CFPAC-1细胞中呈高表达A：根据“StarBase”数据库，BZW2在胰腺癌组织中的表达水平高于正常组织，与Normal组比较，*P<0.05。B：BZW2在胰腺癌细胞中表达较高，与HPC-Y5组比较，***P<0.001。C：RT-qPCR检测用miR-450a-5p模拟物转染的胰腺癌细胞中BZW2的基因表达；D：免疫印迹分析检测用miR-450a-5p模拟物转染的胰腺癌细胞中BZW2的蛋白表达；E：miR-450a-5p与BZW2的相关性分析，与NC mimic组比较，***P<0.001。Figure 5. BZW2 is highly expressed in CFPAC-1 cells2.6 Pc-BZW2挽救MSC-exo-miR-450a-5p的功能
为了进一步证实，miR-450a-5p与BZW2的相互关系，通过回复实验进行验证。分组检查，根据CCK-8和EdU测定的结果，MSC-exo-miR-450a-5p抑制了增殖，而pc-BZW2逆转增殖抑制效应（P<0.05），见图6A～6B。增殖相关基因的表达也证实了这些结果。miR-450a-5p抑制PCNA和Ki-67的表达，而pc-BZW2部分逆转了这种作用（P<0.05），见图6C。此外，MSC-exo-miR-450a-5p抑制细胞的侵袭和迁移过程，而Pc-BZW2发挥了积极作用，见图6D～6E。同样MMP2和MMP9的蛋白质水平也被MSC-exo-miR-450a-5p抑制，Pc-BZW2可逆转（P<0.05），见图6F。
图 6 Pc-BZW2逆转MSC-exo-miR-450a-5p的增殖抑制功能A：基于CCK-8测定，MSC-exo-miR-450a-5p抑制CFPAC-1增殖，而Pc-BZW2逆转了增殖效应；B：分组处理细胞，EdU实验检测，BZW2逆转MSC-exo-miR-450a-5p对胰腺癌的增殖效应；C：miR-450a-5p抑制PCNA和Ki-67的表达，而Pc-BZW2部分逆转了这种作用；D：分组处理，MSC-exo-miR-450a-5p抑制侵袭过程；E：分组处理， MSC-exo-miR-450a-5p抑制迁移过程；F：MMP2和MMP9的蛋白水平被MSC-exo-miR-450a-5p抑制，但Pc-BZW2可逆转，与MSC-exo组比较，***P<0.001，与MSC-exo-miR-450a-5p+pc-NC组比较，###P<0.001。Figure 6. Pc-BZW2 reverses the proliferation inhibition function of MSC exo miR-450a-5p3. 讨论
细胞外囊泡是指来源于细胞的囊泡体，其中外泌体来源于多泡小体[18]。外泌体存在于身体的各种组织、器官和体液中，具有渗透能力[19]。外泌体在体内循环，它们必须避开免疫细胞和排泄器官，如肝、肺和肾[20]。它们的靶组织效率取决于功能化程度以及外泌体与靶细胞相互作用的强度。基于外泌体的分子转运能力和靶向特性，基于外泌物的分子转运容量和靶向特征，研究人员开发了具有精确靶向性的外泌体细胞递送载体[21]。通过在供体细胞中共表达蛋白质/RNA转运蛋白，可以将特定的蛋白质/RNA分子装载到外泌体中[22]。Kamerkar等[23]指出，与脂质体相比，外泌体表现出更高的递送siRNA分子的能力，抑制胰腺肿瘤生长。因此，本研究构建了MSC-exo-miR-450a-5p，以研究miR-450a-5b在胰腺癌细胞中的功能。有趣的是，miR-450a-5p在胰腺癌组织和细胞中低表达，MSC-exo-miR-450a-5p可显著抑制CFPAC-1的增殖。
到目前为止，还没有研究miR-450a-5p在胰腺癌中的作用。然而，据报道，它在各种疾病中异常表达[11，14]。有趣的是，EGFR抑制剂（Tarceva）已被批准用于治疗晚期癌症，尤其是EGFR靶点突变肿瘤 [24]。在食管鳞状细胞癌中，靶向DUSP10参与自噬[12]。miR-450a-5p/SOX2通路在调节结直肠癌肿瘤干性、血管生成，而血管生成模拟中的独特机制可能是CRC的潜在治疗靶点[25]。在之前的一项研究中，SOX2的表达在癌症的侵袭和转移中起着关键的调节作用。Sharma等[26]指出，SOX2的表达随着胰腺上皮内瘤变的程度而增加。因此，miR-450a-5p可能通过调节各种基因或途径影响胰腺癌的发展。
在本研究中，miR-450a-5p负调控胰腺癌细胞中BZW2的表达。BZW2基因编码的蛋白质含有亮氨酸拉链和W2结构域[27]。例如，BZW2抑制NF-kB和NFAT的转录活性，表明BZW2可能是心脏发育的潜在候选基因[28]。NF-kB是一种具有多效性转录调控的多肽，它通过激活和调节各种肿瘤相关基因的转录，促进细胞生长，抵抗细胞凋亡，引起细胞恶性转化，促进肿瘤细胞转移[29-30]。此外，敲低BZW2可抑制乳腺上皮细胞的增殖，并显著下调转录激活剂、β-酪蛋白和催乳素受体的表达水平[31]。值得注意的是，到目前为止，miR-450a-5p在胰腺癌中的功能和分子机制尚未得到研究。然而，根据上述证据，BZW2的一些线索可能会被揭示出来。重要的是，笔者的结果证实Pc-BZW2逆转了MSC-exo-miR-450a-5p的功能，BZW2的具体作用机制还有待进一步探索。
综上所述，间充质干细胞来源的外泌体是1种新的递送系统，用于胰腺癌症治疗中miRNA的靶向递送。它们通过靶向BZW2转运miR-450a-5p来抑制胰腺癌细胞的增殖，这为未来胰腺癌的治疗和预防研究提供了重要线索。
-
图 1 胰腺癌组织和细胞中miR-450a-5p呈低表达（$\bar x \pm s$， n=6）
A：miR-126-5p在胰腺癌组织中的表达水平低于正常胰腺组织；与Normal组比较，*P<0.05；B：CFPAC-1和PANC-1细胞系的miR-450a-5p表达低于HPC-Y5细胞，与HPC-Y5组比较，***P<0.001。
Figure 1. The expression of miR-450a-5p was low in pancreatic cancer tissues and cells. （$\bar x \pm s$，n=6）
图 2 CFPAC-1细胞摄取MSC-exo-miR-450a-5p
A：使用生物透射电子显微镜（TEM）观察样品中外泌体的形态和大小；B：外泌体和MSC-exo的平均粒径和主峰；C：标记蛋白（CD63和TSG101）的表达水平在MSC-exo-miR-450a-5p组中较高；D：miR-450a-5p在MSC-exo-miR-450a-5p组中的表达高于MSC-exo组；E：CFPAC-1细胞摄取MSC-exo和MSC-exo-miR-450a-5p。与MSC-exo组比较，***P<0.001。
Figure 2. CFPAC-1 cells uptake MSC-exo-miR-450a-5p
图 3 MSC-exo-miR-450a-5p抑制CFPAC-1细胞生物学行为
A：MSC-exo-miR-450a-5p显著抑制胰腺癌细胞增殖；B：EdU测定MSC-exo-miR-450a-5P对细胞的增殖影响；C：用蛋白质印迹法检测增殖相关蛋白的水平；D～E：MSC-exo-miR-450a-5p抑制侵袭和迁移；F：MMP2和MMP9的蛋白水平被MSC-exo-miR-450a-5p抑制，与MSC-exo组比较，***P<0.001。
Figure 3. MSC-exo-miR-450a-5p inhibits the biological behavior of CFPAC-1 cells
图 4 miR-450a-5p靶向BZW2
A：PITA、miRanda和miRmap数据库中miR-450a-5p靶点的交叉点；B：miR-450a-5p和BZW2的组合；C：双荧光素酶报告基因测定，与NC mimic组比较，***P<0.001。
Figure 4. MiR-450a-5p targets BZW2
图 5 BZW2在CFPAC-1细胞中呈高表达
A：根据“StarBase”数据库，BZW2在胰腺癌组织中的表达水平高于正常组织，与Normal组比较，*P<0.05。B：BZW2在胰腺癌细胞中表达较高，与HPC-Y5组比较，***P<0.001。C：RT-qPCR检测用miR-450a-5p模拟物转染的胰腺癌细胞中BZW2的基因表达；D：免疫印迹分析检测用miR-450a-5p模拟物转染的胰腺癌细胞中BZW2的蛋白表达；E：miR-450a-5p与BZW2的相关性分析，与NC mimic组比较，***P<0.001。
Figure 5. BZW2 is highly expressed in CFPAC-1 cells
图 6 Pc-BZW2逆转MSC-exo-miR-450a-5p的增殖抑制功能
A：基于CCK-8测定，MSC-exo-miR-450a-5p抑制CFPAC-1增殖，而Pc-BZW2逆转了增殖效应；B：分组处理细胞，EdU实验检测，BZW2逆转MSC-exo-miR-450a-5p对胰腺癌的增殖效应；C：miR-450a-5p抑制PCNA和Ki-67的表达，而Pc-BZW2部分逆转了这种作用；D：分组处理，MSC-exo-miR-450a-5p抑制侵袭过程；E：分组处理， MSC-exo-miR-450a-5p抑制迁移过程；F：MMP2和MMP9的蛋白水平被MSC-exo-miR-450a-5p抑制，但Pc-BZW2可逆转，与MSC-exo组比较，***P<0.001，与MSC-exo-miR-450a-5p+pc-NC组比较，###P<0.001。
Figure 6. Pc-BZW2 reverses the proliferation inhibition function of MSC exo miR-450a-5p
表 1 引物序列
Table 1. Primer sequence
基因 上游 下游 miR-450a-5p 5'-TTTTGCGATGTGTTCC-3' 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' U6 5'-TGCTCACTGTCTAAAATTGG-3' 5'-AGAAGAAGTCTGCTGTTGAC-3' BZW2 5'-CTAACAGGCCAGCGGTTCAAA-3' 5'-GGACAAGTGTATCCCTGAAGACT-3' B-actin 5'-ACACAGTGCTGTCTGGTGGT-3' 5'-TGATCTTCATGGTGCTGGGAG-3' 
下载: 导出CSV
-
[1] Stoffel E M, Brand R E, Goggins M. Pancreatic cancer: Changing epidemiology and new approaches to risk assessment, early detection, and prevention[J]. Gastroenterology,2023,164(5):752-765. doi: 10.1053/j.gastro.2023.02.012 [2] Yu J, Yang X, Wu H, et al. Clinical significance of color ultrasound, MRI, miR-21, and CA199 in the diagnosis of pancreatic cancer[J]. J Oncol,2021,2021:2380958. [3] Ji J, Cao C, Xu H: Minimally invasive intervention of obstructive jaundice in pancreatic cancer[J]. Integrative Pancreatic Intervention Therapy, 2021. [4] Hu ZI, O'Reilly EM. Therapeutic developments in pancreatic cancer[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2024,21(1):7-24. doi: 10.1038/s41575-023-00840-w.Epub2023Oct5 [5] Mihaljevic A L,Michalski C W,Friess H,et al. Molecular mechanism of pancreatic cancer—understanding proliferation, invasion, and metastasis[J]. Langenbeck's Archives of Surgery,2010,395(4):295-308. [6] Fu Y, Liu X, Chen Q, et al. Downregulated miR-98-5p promotes PDAC proliferation and metastasis by reversely regulating MAP4K4[J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research,2018,37(1):130. [7] Jiang M, Jike Y, Liu K, et al. Exosome-mediated miR-144-3p promotes ferroptosis to inhibit osteosarcoma proliferation, migration, and invasion through regulating ZEB1[J]. Mol Cancer,2023,22(1):113. doi: 10.1186/s12943-023-01804-z [8] Nakata K, Ohuchida K, Mizumoto K, et al. MicroRNA-10b is overexpressed in pancreatic cancer, promotes its invasiveness, and correlates with a poor prognosis[J]. Surgery,2011,150(5):916-922. doi: 10.1016/j.surg.2011.06.017 [9] Vogt M, Munding J, Gr ü ner M, et al. Frequent concomitant inactivation of miR-34a and miR-34b/c by CpG methylation in colorectal, pancreatic, mammary, ovarian, urothelial, and renal cell carcinomas and soft tissue sarcomas[J]. Virchows Archiv,2011,458(3):313-322. doi: 10.1007/s00428-010-1030-5 [10] Hamada S, Satoh K, Fujibuchi W, et al. MiR-126 Acts as a tumor suppressor in pancreatic cancer cells via the regulation of ADAM9[J]. Molecular Cancer Research,2012,10(1):3-10. doi: 10.1158/1541-7786.MCR-11-0272 [11] Zhang Y, Yu M, Dai M, et al. miR-450a-5p within rat adipose tissue exosome-like vesicles promotes adipogenic differentiation by targeting WISP2[J]. Journal of Cell Science,2017,130(6):1158-1168. [12] Chen H,Yao X,Di X,et al. MiR-450a-5p inhibits autophagy and enhances radiosensitivity by targeting dual-specificity phosphatase 10 in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Cancer Lett,2020,28:483:114-126. doi: 10.1016/j.canlet.2020.01.037 [13] Zhang Z W, Chen J J, Xia S H, et al. Long intergenic non-protein coding RNA 319 aggravates lung adenocarcinoma carcinogenesis by modulating miR-450b-5p/EZH2[J]. Gene,2018,15:650:60-67. [14] Zhao Y J, Zhang J, Wang Y C, et al. MiR-450a-5p inhibits gastric cancer cell proliferation, migration, and invasion and promotes apoptosis via targeting CREB1 and inhibiting AKT/GSK-3β signaling pathway[J]. Front Oncol,2021,29:11:633366. doi: 10.3389/fonc.2021.633366 [15] Ribeiro M F, Zhu H, Millard R W, et al. Exosomes function in pro-and anti-angiogenesis[J]. Current Angiogenesis,2013,2(1):54. doi: 10.2174/22115528113020020001 [16] Yeo R, Lai R C, Zhang B, et al. Mesenchymal stem cell: an efficient mass producer of exosomes for drug delivery[J]. Adv Drug Deliv Rev,2013,65(3):336-341. doi: 10.1016/j.addr.2012.07.001 [17] Gao L, Qiu F, Cao H, et al. Therapeutic delivery of microRNA-125a-5p oligonucleotides improves recovery from myocardial ischemia/reperfusion injury in mice and swine[J]. Theranostics,2023,13(2):685-703. doi: 10.7150/thno.73568 [18] Ageta H, Tsuchida K. Post-translational modification and protein sorting to small extracellular vesicles including exosomes by ubiquitin and UBLs[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2019, 76(24): 4829-4848. [19] Gao W, Fei L, Liu L, et al. Endothelial colony-forming cell-derived exosomes restore blood-brain barrier continuity in mice subjected to traumatic brain injury[J]. Experimental Neurology,2018,307:99-108. doi: 10.1016/j.expneurol.2018.06.001 [20] Silverman J M, Clos J, Horakova E, et al. Leishmania exosomes modulate innate and adaptive immune responses through effects on monocytes and dendritic cells[J]. The Journal of Immunology,2010,185(9):5011-5022. doi: 10.4049/jimmunol.1000541 [21] Paskeh M D A, Entezari M, Mirzaei S, et al. Emerging role of exosomes in cancer progression and tumor microenvironment remodeling[J]. J Hematol Oncol,2022,15(1):83. doi: 10.1186/s13045-022-01305-4 [22] Huang J, Yu M, Yin W, et al. Development of a novel RNAi therapy: Engineered miR-31 exosomes promoted the healing of diabetic wounds[J]. Bioactive Materials,2021,6(9):2841-2853. doi: 10.1016/j.bioactmat.2021.02.007 [23] Kamerkar S, LeBleu V S, Sugimoto H, et al. Exosomes facilitate therapeutic targeting of oncogenic KRAS in pancreatic cancer[J]. Nature,2017,546(7659):498-503. doi: 10.1038/nature22341 [24] Choi H D, Chang M J. Eye, hepatobiliary, and renal disorders of erlotinib in patients with non-small-cell lung cancer: A meta-analysis[J]. PLoS One,2020,15(7):e0234818. doi: 10.1371/journal.pone.0234818 [25] Chen J, Chen S, Zhuo L, et al. Regulation of cancer stem cell properties, angiogenesis, and vasculogenic mimicry by miR-450a-5p/SOX2 axis in colorectal cancer[J]. Cell Death Disease, 2020, 11: 173. [26] Sharma N S, Gupta V K, Dauer P, et al. O-GlcNAc modification of Sox2 regulates self-renewal in pancreatic cancer by promoting its stability[J]. Theranostics, 2019, 9(12): 3410-3424. [27] Loughran G, Firth A E, Atkins J F, et al. Translational autoregulation of BZW1 and BZW2 expression by modulating the stringency of start codon selection[J]. PLoS ONE,2018,13(2):e0192648. doi: 10.1371/journal.pone.0192648 [28] Antony P, Petro J B, Carlesso G, et al. B cell receptor directs the activation of NFAT and NF-kappaB via distinct molecular mechanisms[J]. Experimental Cell Research,2003,291(1):11-24. doi: 10.1016/S0014-4827(03)00338-0 [29] Yu H, Lin L, Zhang Z, et al. Targeting NF-κB pathway for the therapy of diseases: Mechanism and clinical study[J]. Signal Transduct Target Ther,2020,5(1):209. doi: 10.1038/s41392-020-00312-6 [30] Liu X, Hogg G D, Zuo C, et al. Context-dependent activation of STING-interferon signaling by CD11b agonists enhances anti-tumor immunity[J]. Cancer Cell,2023,41(6):1073-1090.e12. doi: 10.1016/j.ccell.2023.04.018 [31] Sun R Q, Qing Z L I, Yan H B, et al. Bzw2 Promotes Proliferation and Lactation of Mammary Epithelial Cell in Dairy Goat[J]. 农业科学学报:英文版,2012,11(11):8. -
下载:
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 1156
- HTML全文浏览量: 762
- PDF下载量: 13
- 被引次数: 0
