The Association of Intestinal Flora Metabolite TMAO with Non-alcoholic Fatty Liver Disease
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摘要:
目的 检测NAFLD患者血清氧化三甲胺（TMAO）及其前体代谢物水平，及肠道中直肠真杆菌、多形拟杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌的表达量，探讨肠道菌群代谢物TMAO在NAFLD病程进展中的作用。 方法 随机选取118例受试者，分为NAFLD组86例和健康对照组32例，采用高效液相色谱串联质谱法检测受试者血清中TMAO及其前体代谢物的水平，qRT-PCR法检测粪便中目标细菌DNA的表达量。 结果 NAFLD患者血清TMAO、三甲胺（TMA）及胆碱水平明显升高（P<0.05），肝脏脂肪含量与TMAO的水平具有正相关性（P<0.05）；NAFLD患者粪便中乳酸杆菌、直肠真杆菌表达量增加（P < 0.05），双歧杆菌、多形拟杆菌表达量减少（P < 0.05）；血清TMAO水平与粪便中直肠真杆菌的数量呈正相关（r=0.280，P<0.05），与双歧杆菌的数量呈负相关（r=-0.332，P<0.05）。 结论 血清TMAO水平与NAFLD的严重程度呈正相关，NAFLD患者肠道菌群结构失衡，且与TMAO存在关联，推断肠道菌群可能通过代谢生成TMAO在NAFLD病程进展中起重要作用。 Abstract:Objective To explore the role of TMAO from gut microbiota in non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD）, we detected the serum level of TMAO and its precursor metabolites in NAFLD, as well as the expression level of Eubacterium rectum, Bacteroidetes multiforme, Lactobacillus and bifidobacterium in the intestinal flora. Methods We collected 118 subjects and divided into NAFLD group （86 cases） and healthy control group （32 cases） randomly. We also detected the serum level of TMAO and its precursor metabolites in subjects by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry detection （LC-MS）, and the expression of target bacterial DNA was detected by qRT-PCR. Results Serum TMAO, TMA and choline levels were significantly increased in NAFLD （P<0.05）, and liver fat content was positively correlated with TMAO （P<0.05）. The expression level of Lactobacillus and Eubacterium rectum in NAFLD group were increased （P<0.05）; the expression level of Bifidobacterium and Bacteroides multiform were decreased （P<0.05）.The serum TMAO level was positively correlated with Eubacterium rectum （r=0.280, P<0.05）, and negatively correlated with Bifidobacterium （r=-0.332, P<0.05）. Conclusion The level of TMAO in serum shows a positive correlation with NAFLD. The structure of intestinal flora in individuals with NAFLD is altered and linked to TMAO. This suggests that the intestinal flora may have a significant impact on the development of NAFLD through TMAO. -
Key words:
- Non-alcoholic fatty liver disease /
- TMAO /
- TMA /
- Intestinal flora
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白族是中国人口占比位列第13的少数民族，主要分布在云南中西部、贵州毕节、湖南张家界、湘西、四川凉山等地，其中云南是白族人口最多的省份。在云南，白族主要分布于大理州，该州是白族的发祥地、祖籍地和主要聚集地。根据2020年第七次人口普查，白族人口约为209.1543万人，其中中国80%以上的白族人口居住在云南省大理洱海地区（http://www.stats.gov.cn/tjsj/ndsj/2021/indexch.htm）。
受地域和风俗习惯的影响，白族可以分为3个分支：民家、勒墨和那马。白族勒墨和那马支系主要分布在怒江流域的兰坪县、维西县、福贡县等地，经济文化水平与怒族和傈僳族相近。白族民家支系则是白族人口最多的一支，主要居住在云南大理的洱海地区，深受中国汉文化的影响，具有较高的经济文化水平[1]。
由于同一STR（short tandem repeat，STR）基因座中相同的等位基因在不同群体间基因频率分布存在差异，导致亲权鉴定和个体识别中关键法医学参数的计算值亦有不同，如亲权指数（paternity index，PI）和随机匹配概率（matching probability，Pm）等。因此，对不同种族和民族的人群进行基础遗传学数据的调查是非常有必要的。本研究选取2323名白族民家支系健康无关个体，对云南白族民家支系进行群体遗传调查，以期建立白族民家支系的法医遗传学参数，为司法鉴定工作中的亲子鉴定和个体识别提供基础数据。
1. 材料与方法
1.1 DNA提取、PCR扩增和STR分型
在签署知情同意书后，在云南省大理白族自治州洱源县和剑川县采集了2323名无亲属关系健康白族个体的血样或口腔拭子。采用DNATyperTM19（公安部物证鉴定中心，中国）试剂盒，使用GeneAmpPCR System 9700 PCR仪（AB公司，美国）对18个常染色体STR基因座（D3S1358、D13S317、D16S539、Penta E、D18S51、CSF1PO、TH01、D2S1338、vWA、D21S11、D7S820、D5S818、D12S391、TPOX、D19S433、D8S1179、FGA和D6S1043）进行直接PCR复合扩增，同时设立灭菌纯水为阴性对照样本，9947A为阳性对照样本。PCR复合扩增所得到的产物使用AB 3130XL自动遗传分析仪（AB公司，美国）进行毛细管电泳分离，用GeneMapper ID-X 1.5 软件（AB公司，美国）进行STR分型。根据国际法庭科学遗传学会（international society for forensic genetics，ISFG）的规定对扩增产物进行分型和命名[2-3]。
1.2 统计学处理
使用Modified-Powerstats软件[4]统计等位基因频率（allele frequency，AF），并进行Hardy-Weinberg平衡（HWE）检验，采用Bonferroni多重校正，以P < 0.0028为差异有统计学意义。计算随机匹配概率（matching probability，Pm）、观测值杂合度（observed heterozygosity，Ho）、多态性信息含量（polymorphism information content，PIC）、个体识别能力（discrimination power，DP）、非父排除概率（probability of exclusion，PE）、亲权指数（paternity index，PI）等法医学参数。使用Arlequin v3.5软件计算遗传分化指数（Fst）和P值[5]，采用Bonferroni多重校正，以P < 0.0033为差异有统计学意义。采用Phylip 3.698软件包计算白族民家支系与21个已发表人群的群体遗传距离（Nei’ s）（http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html）。基于Nei’ s遗传距离，应用Mega 7.0软件[6]构建相邻连接（neighbour-joining，NJ）系统发育树。使用SPSS v24.0 统计软件（IBM公司，美国），进行多维尺度（multidimensional scaling，MDS）分析。
2. 结果
2.1 18个STR基因座的等位基因频率和法医学相关参数
白族民家支系2323名无亲属关系个体18个STR基因座的等位基因频率和法医学相关参数，见表1。在上述18个STR基因座中共检出230个等位基因和1073个基因型。等位基因频率分布在0.0002～0.5093之间。等位基因数量最少为7个（TPOX），最多为22个（Penta E）。经Bonferroni校正后，有17个基因座等位基因频率和基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡（P > 0.05/ 18 = 0.0028），D13S317基因座不符合Hardy-Weinberg平衡（P = 0.0008）。随机匹配概率（Pm）的范围为0.0166～0.2023。观测值杂合度（Ho）的范围为 0.6220～0.8993。多态性信息含量（PIC）在0.5641～0.8977之间。个体识别能力（DP）在0.7977～0.9834之间，累积个人识别能力（cumulative discrimination power，CDP）达到0.999999999。非父排除概率（probability of exclusion，PE）在0.3182～0.7939之间，累积非父排除率（cumulative probability of exclusion，CPE）达到0.99999994055。
表 1 白族民家支系18个STR基因座的等位基因频率及法医学参数（n = 2323）（1）Table 1. Allele frequencies and forensic parameters of 18 STRs in Minjia branch of Bai ethnic minority （n = 2323）（1）Allele D3S1358 D6S1043 D13S317 Penta E D16S539 D18S51 D2S1338 CSF1PO TH01 vWA D21S11 D7S820 D5S818 TPOX D8S1179 D12S391 D19S433 FGA 5 0.0458 0.0009 6 0.0002 0.0846 7 0.0022 0.0011 0.0019 0.2833 0.0013 0.0217 0.0009 7.3 8 0.0011 0.2749 0.0110 0.0075 0.0009 0.0628 0.1291 0.0006 0.5093 8.1 9 0.0028 0.1369 0.0065 0.2400 0.0002 0.0426 0.4957 0.0719 0.0773 0.1244 0.0004 0.0037 9.1 0.0006 9.3 0.0454 10 0.0353 0.1440 0.0347 0.1104 0.0009 0.2374 0.0271 0.1614 0.1920 0.0239 0.0945 0.0006 10.1 0.0015 11 0.1197 0.2322 0.1894 0.3037 0.0026 0.2443 0.0002 0.3259 0.3250 0.3117 0.0771 0.0028 12 0.0004 0.1438 0.1627 0.1257 0.2163 0.0224 0.3898 0.2658 0.2331 0.0295 0.1156 0.0357 12.2 0.0140 13 0.0013 0.1382 0.0366 0.0560 0.1089 0.2086 0.0766 0.0002 0.0362 0.1332 0.0004 0.2548 0.2785 13.2 0.0517 14 0.0418 0.1203 0.0105 0.0859 0.0123 0.2023 0.0058 0.2286 0.0058 0.0157 0.1901 0.2499 14.2 0.0977 15 0.3549 0.0129 0.0803 0.0009 0.1950 0.0006 0.0276 0.0004 0.0011 0.1722 0.0118 0.0687 15.2 0.1429 16 0.3487 0.0009 0.0986 0.1319 0.0149 0.1746 0.0002 0.0755 0.0065 0.0133 16.2 0.0355 17 0.1754 0.0502 0.0605 0.0809 0.0493 0.2566 0.0161 0.1009 0.0017 0.0006 17.2 0.0024 17.3 0.0004 18 0.0710 0.1651 0.0678 0.0402 0.1009 0.2058 0.0037 0.2660 0.0006 0.0327 18.2 0.0002 0.0002 18.3 0.0009 19 0.0058 0.1455 0.0489 0.0390 0.1754 0.0876 0.2004 0.0439 20 0.0006 0.0478 0.0433 0.0224 0.1274 0.0181 0.1573 0.0654 20.2 0.0002 0.0006 20.3 0.0022 21 0.0062 0.0245 0.0183 0.0512 0.0011 0.0994 0.1009 21.1 0.0002 21.2 0.0004 0.0077 21.3 0.0071 注：Pm: 随机匹配概率; DP: 个体识别能力; PIC: 多态性信息含量; PE: 非父排除概率;TPI: 典型亲权指数; Ho: 观测值杂合度；p-value: Hardy-Weinberg平衡（HWE）检验P值. 表 1 白族民家支系18个STR基因座的等位基因频率及法医学参数（n = 2323）（2）Table 1. Allele frequencies and forensic parameters of 18 STRs in Minjia branch of Bai ethnic minority （n = 2323）（2）Allele D3S1358 D6S1043 D13S317 Penta E D16S539 D18S51 D2S1338 CSF1PO TH01 vWA D21S11 D7S820 D5S818 TPOX D8S1179 D12S391 D19S433 FGA 22 0.0004 0.0084 0.0187 0.0420 0.0880 0.1707 22.2 0.0065 23 0.0043 0.0084 0.2260 0.0536 0.2273 23.2 0.0123 24 0.0045 0.0054 0.1446 0.0075 0.1672 24.2 0.0170 25 0.0019 0.0022 0.0570 0.0060 0.0895 25.2 0.0024 26 0.0009 0.0006 0.0095 0.0009 0.0426 26.2 0.0013 27 0.0015 0.0024 0.0065 28 0.0002 0.0508 0.0045 28.2 0.0166 29 0.2484 29.2 0.0028 30 0.2652 30.1 0.0002 30.2 0.0230 30.3 0.0006 31 0.1007 31.2 0.0687 32 0.0284 32.2 0.1337 33 0.0024 33.2 0.0463 34.2 0.0093 35.2 0.0006 Pm 0.1292 0.0283 0.0654 0.0166 0.0837 0.0408 0.0348 0.1210 0.1654 0.0691 0.0495 0.0854 0.0823 0.2023 0.0468 0.0476 0.0542 0.0334 DP 0.8708 0.9717 0.9346 0.9834 0.9163 0.9592 0.9652 0.8790 0.8346 0.9309 0.9505 0.9146 0.9177 0.7977 0.9532 0.9524 0.9458 0.9666 PIC 0.6652 0.8639 0.7744 0.8977 0.7446 0.8311 0.8453 0.6781 0.6115 0.7703 0.8087 0.7400 0.7456 0.5641 0.8146 0.8131 0.7976 0.8491 PE 0.4315 0.7312 0.5548 0.7939 0.5403 0.6708 0.7029 0.4478 0.3745 0.5844 0.6384 0.5679 0.5610 0.3182 0.6401 0.6393 0.6148 0.7191 TPI 1.6785 3.7958 2.2294 4.9637 2.1509 3.0809 3.4263 1.7388 1.4872 2.4048 2.7921 2.3046 2.2641 1.3229 2.8056 2.7988 2.6101 3.6297 Ho 0.7021 0.8683 0.7757 0.8993 0.7675 0.8377 0.8541 0.7124 0.6638 0.7920 0.8209 0.7830 0.7792 0.6220 0.8218 0.8214 0.8084 0.8622 HWE（p-value） 0.1687 0.2066 0.0008 0.3332 0.1724 0.1348 0.3628 0.1954 0.7213 0.3084 0.3011 0.3009 0.9749 0.6396 0.0800 0.1155 0.1521 0.8597 注：Pm：随机匹配概率；DP：个体识别能力；PIC：多态性信息含量；PE：非父排除概率；TPI：典型亲权指数；Ho：观测值杂合度；p-value：Hardy-Weinberg平衡（HWE）检验P值。 2.2 遗传分化指数（Fst）和P值
白族民家支系与21个已发表的人群[7-26]在共有的15个STR基因座之间的遗传分化指数（Fst）和P值，见表2。经Bonferroni校正后（P < 0.05/15≈0.0033），白族民家支系与喀什地区维吾尔族、云南佤族和云南地区越南人群在14个STR基因座上存在差异（P < 0.0033），与广西侗族和印度人群在11个STR基因座上存在差异（P < 0.0033），与云南哈尼族在9个STR基因座上存在差异（P < 0.0033），与海南黎族和昌都藏族在8个STR基因座上存在差异（P < 0.0033），与伊犁地区维吾尔族在7个STR基因座上存在差异（P < 0.0033），与日本人群在6个STR基因座上存在差异（P < 0.0033），与云南汉族在3个STR基因座上存在差异（P < 0.0033），与云南布朗族和长沙汉族在2个STR基因座上存在差异（P < 0.0033），与四川汉族和纳西族在1个STR基因座上存在差异（P < 0.0033），与贵州仡佬族、彝族、宁夏回族、拉萨藏族、怒江白族和大理白族在各基因座上均无统计学差异（P > 0.0033）。
表 2 白族民家支系与21个已发表人群的Fst和P值（1）Table 2. Pairwise Fst and P values between Minjia branch of Baiethnic minority and 21 published populations （1）民族 STR基因座 CSF1PO D2S1338 D3S1358 D5S818 D7S820 Fst P Fst P Fst P Fst P Fst P 喀什地区维吾尔族 0.00323 < 0.00001# 0.00541 < 0.00001# 0.00311 < 0.00001# 0.00659 < 0.00001# 0.01279 < 0.00001# 云南佤族 0.00248 0.00195# 0.00708 < 0.00001# 0.01609 < 0.00001# 0.01171 < 0.00001# 0.00165 0.00684* 广西侗族 0.00068 0.04102* 0.00309 < 0.00001# 0.00422 < 0.00001# 0.00177 < 0.00001# 0.00702 < 0.00001# 海南黎族 0.00050 0.19922 0.00632 < 0.00001# 0.00509 < 0.00001# 0.00268 0.00488* 0.00223 0.01660* 昌都藏族 0.00117 0.00879* 0.00029 0.09473 0.28350 < 0.00001# 0.00140 0.00488* 0.00051 0.06543 四川汉族 −0.00129 0.83691 −0.00031 0.55566 −0.00077 0.60059 −0.00130 0.89355 −0.00030 0.46680 云南布朗族 0.00449 0.04102* 0.00557 0.00391* 0.00945 0.00293# 0.00376 0.04688* −0.00037 0.48047 云南哈尼族 0.00217 0.02539* 0.00441 < 0.00001# 0.00162 0.04883* 0.00318 0.00195# 0.00168 0.02148* 云南地区越南人群 0.01493 < 0.00001# 0.00689 < 0.00001# 0.02162 < 0.00001# 0.00130 0.07617 0.02601 < 0.00001# 贵州仡佬族 −0.00062 0.63477 −0.00046 0.66992 0.00161 0.09082 −0.00056 0.66504 0.00238 0.04004* 云南汉族 −0.00025 0.72852 0.00050 0.04395* 0.00083 0.03711* 0.00056 0.07910 0.00369 < 0.00001# 彝族 0.00007 0.33105 0.00031 0.26758 0.00074 0.19531 0.00050 0.25000 −0.00095 0.89062 纳西族 −0.00095 0.90430 −0.00023 0.57617 −0.00006 0.36816 0.00000 0.40332 0.00037 0.24023 日本人群 0.00214 0.01562* 0.01237 < 0.00001# 0.00326 0.00977* 0.00084 0.10352 0.00425 < 0.00001# 印度人群 0.00364 0.02734* 0.00318 0.00488* 0.00547 0.00488* 0.00498 0.00391* 0.01890 < 0.00001# 宁夏回族 −0.00041 0.64453 0.00052 0.12402 0.00117 0.06641 0.00042 0.19043 0.00183 0.01562* 伊犁维吾尔族 0.00387 0.03223* 0.10822 < 0.00001# 0.00544 0.01367* 0.00796 0.00195# 0.00851 < 0.00001# 长沙汉族 0.00010 0.27051 0.00039 0.07031 0.00288 < 0.00001# 0.00032 0.13379 0.00124 0.01074* 拉萨藏族 −0.00197 0.85840 0.00085 0.23828 0.00083 0.25391 0.00214 0.13379 0.00019 0.36230 怒江白族 0.00440 0.09473 −0.00277 0.93262 −0.00212 0.71289 0.00262 0.17969 −0.00293 0.86816 大理白族 −0.00020 0.52148 −0.00050 0.97852 0.00034 0.20312 0.00006 0.35547 −0.00043 0.85742 即使在Bonforroni校正后，本研究人群与比较人群之间的Fst值也存在显著差异（#P < 0.05/15 = 0.0033）；*P < 0.05。 表 2 白族民家支系与21个已发表人群的Fst和P值（2）Table 2. Pairwise Fst and P values between Minjia branch of Bai ethnic minority and 21 published populations （2）民族 STR基因座 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 D19S433 Fst P Fst P Fst P Fst P Fst P 喀什地区维吾尔族 0.00074 0.00781* 0.01187 < 0.00001# 0.00128 0.00195# 0.00397 < 0.00001# 0.00308 < 0.00001# 云南佤族 0.00380 < 0.00001# 0.00854 < 0.00001# 0.00645 < 0.00001# 0.00626 < 0.00001# 0.00365 < 0.00001# 广西侗族 0.01678 < 0.00001# 0.00722 < 0.00001# 0.00182 < 0.00001# 0.00464 < 0.00001# 0.00050 0.04395* 海南黎族 0.01014 < 0.00001# 0.00329 0.00293# 0.00163 0.03223* 0.00464 < 0.00001# 0.00048 0.17383 昌都藏族 0.00132 0.00098# 0.13054 < 0.00001# 0.00113 0.00879* 0.00509 < 0.00001# 0.00144 < 0.00001# 四川汉族 −0.00053 0.58496 −0.00084 0.73633 0.00581 0.00293# 0.00041 0.24707 −0.00102 0.83691 云南布朗族 0.00219 0.09961 0.00074 0.27734 0.00351 0.07031 −0.00175 0.93945 0.00425 0.01953* 云南哈尼族 0.00493 < 0.00001# 0.00244 0.00391* 0.00457 0.00098# 0.00544 < 0.00001# 0.00236 0.00293# 云南地区越南人群 0.03193 < 0.00001# 0.03207 < 0.00001# 0.01673 < 0.00001# 0.00364 0.00098# 0.01629 < 0.00001# 贵州仡佬族 0.00044 0.24512 0.00053 0.21973 −0.00102 0.88086 −0.00025 0.53125 0.00009 0.37012 云南汉族 0.00442 < 0.00001# 0.00097 0.01172* 0.00094 0.01172* 0.00046 0.06152 0.00033 0.12012 彝族 0.00046 0.23145 0.00184 0.04883* −0.00035 0.55273 0.00115 0.09668 0.00155 0.05566 纳西族 0.00516 < 0.00001# −0.00113 0.99707 0.00114 0.10840 −0.00030 0.61719 −0.00018 0.51855 日本人群 0.00392 < 0.00001# 0.00143 0.03516* 0.02029 < 0.00001# 0.00092 0.05664 0.00175 0.01855* 印度人群 0.07056 < 0.00001# 0.01050 < 0.00001# 0.00631 < 0.00001# 0.14905 < 0.00001# 0.00632 < 0.00001# 宁夏回族 0.00001 0.39844 0.00136 0.04785* 0.00021 0.27539 0.00090 0.06348 −0.00029 0.65137 伊犁维吾尔族 0.00284 0.02734* 0.01284 < 0.00001# 0.00132 0.12793 0.00412 0.00391* 0.00345 0.02734* 长沙汉族 0.00194 < 0.00001# 0.00084 0.03027* 0.00143 0.00391* 0.00050 0.04688* −0.00001 0.39648 拉萨藏族 0.00047 0.28320 0.00874 0.00488* 0.00253 0.10156 0.00456 0.01953* 0.00389 0.03223* 怒江白族 −0.00176 0.73047 0.00081 0.29980 0.00307 0.14160 0.00013 0.39648 0.00289 0.13477 大理白族 0.00092 0.04004* −0.00044 0.87500 0.00015 0.29590 −0.00036 0.86328 0.00012 0.29785 注：黑色加粗的值表明，即使在Bonforroni校正后，本研究人群与比较人群之间的Fst值也存在显著差异（#P < 0.05/15 = 0.0033）；*P < 0.05。 表 2 白族民家支系与21个已发表人群的Fst和P值（3）Table 2. Pairwise Fst and P values between Minjia branch of Bai ethnic minority and 21 published populations （3）民族 STR基因座 D21S11 FGA TH01 TPOX vWA Fst p Fst P Fst P Fst p Fst P 喀什地区维吾尔族 0.00410 < 0.00001# 0.00212 < 0.00001# 0.04589 < 0.00001# 0.00207 0.00098# 0.00704 < 0.00001# 云南佤族 0.00520 < 0.00001# 0.00407 < 0.00001# 0.00953 < 0.00001# 0.02182 < 0.00001# 0.19039 < 0.00001# 广西侗族 0.00069 0.00977* 0.00471 < 0.00001# 0.00171 < 0.00001# 0.00096 0.03809* 0.01037 < 0.00001# 海南黎族 0.00127 0.04297* 0.00395 < 0.00001# 0.00453 0.00098# 0.00347 0.01172* 0.00447 < 0.00001# 昌都藏族 0.00052 0.05762 0.00213 < 0.00001# 0.00136 0.00781* 0.01058 < 0.00001# 0.00314 < 0.00001# 四川汉族 0.00036 0.29492 0.00112 0.13867 −0.00142 0.92090 −0.00119 0.75684 −0.00105 0.81738 云南布朗族 0.00462 0.01074* 0.00144 0.13281 0.01066 0.00488* 0.02201 0.00098# 0.00084 0.23535 云南哈尼族 0.00526 < 0.00001# 0.00487 < 0.00001# 0.00075 0.14160 0.01292 < 0.00001# 0.00207 0.01465* 云南地区越南人群 0.00664 0.00098# 0.01939 < 0.00001# 0.00954 < 0.00001# 0.04698 < 0.00001# 0.01099 < 0.00001# 贵州仡佬族 0.00035 0.26562 −0.00033 0.58984 −0.00027 0.44922 −0.00092 0.71582 0.00086 0.17773 云南汉族 −0.00011 0.58691 0.00062 0.02441* 0.00015 0.22559 0.00046 0.12402 0.00161 0.00195# 彝族 −0.00034 0.60840 −0.00115 0.99414 0.00104 0.13965 −0.00059 0.57422 0.00060 0.21973 纳西族 0.00150 0.04590* 0.00048 0.19922 0.00039 0.25195 0.00037 0.24023 −0.00049 0.70020 日本人群 0.00346 < 0.00001# 0.00073 0.08887 0.02701 < 0.00001# 0.00314 0.01758* −0.00049 0.75488 印度人群 0.01773 < 0.00001# 0.00474 0.00098# 0.07503 < 0.00001# 0.03121 < 0.00001# 0.01042 < 0.00001# 宁夏回族 0.00024 0.26074 0.00028 0.22363 0.00024 0.22852 0.00034 0.20703 0.00080 0.09277 伊犁维吾尔族 0.06856 < 0.00001# 0.00305 0.01660* 0.05871 < 0.00001# 0.00044 0.27148 0.00944 < 0.00001# 长沙汉族 0.00015 0.22363 0.00025 0.15430 0.00040 0.12793 −0.00013 0.47656 0.00077 0.02734* 拉萨藏族 0.00042 0.32520 0.00294 0.04883* −0.00087 0.54883 0.00713 0.03125* −0.00062 0.51953 怒江白族 −0.00227 0.83887 0.00278 0.11523 −0.00052 0.42871 0.00201 0.20020 −0.00349 0.96777 大理白族 0.00150 0.00977* −0.00018 0.63574 0.00062 0.12695 −0.00016 0.47559 −0.00060 0.99121 即使在Bonforroni校正后，本研究人群与比较人群之间的Fst值也存在显著差异（#P < 0.05/15 = 0.0033）；*P < 0.05。 2.3 Nei’s遗传距离
根据个体之间共享等位基因片段的数量计算Nei’s遗传距离。白族民家支系与云南布朗族和云南佤族相距较远，而与大理白族和怒江白族相距较近，见表3。
表 3 白族民家支系与21个已发表人群的Nei's遗传距离Table 3. Nei's standard genetic distances between Minjia branch of Bai nationality and 21 published populations.[1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] 白族民家支系[1] 0.000000 喀什地区维吾尔族[2] 0.107646 0.000000 云南佤族[3] 0.114762 0.177184 0.000000 广西侗族[4] 0.145404 0.217277 0.096202 0.000000 海南黎族[5] 0.124407 0.227674 0.038474 0.096235 0.000000 昌都藏族[6] 0.118570 0.177630 0.073168 0.024859 0.085629 0.000000 四川汉族[7] 0.116581 0.180529 0.070624 0.035347 0.087920 0.005196 0.000000 云南布朗族[8] 0.415857 0.579774 0.398897 0.387094 0.397545 0.348782 0.355437 0.000000 云南哈尼族[9] 0.103179 0.203859 0.048691 0.059480 0.043724 0.034243 0.028206 0.365319 0.000000 云南地区越南人群[10] 0.098524 0.172589 0.059345 0.032926 0.076531 0.007025 0.008501 0.329172 0.024481 0.000000 贵州仡佬族[11] 0.115547 0.149589 0.067855 0.049599 0.093779 0.016923 0.018700 0.360752 0.049616 0.016962 0.000000 云南汉族[12] 0.097612 0.181988 0.058948 0.043558 0.072595 0.014636 0.014362 0.321431 0.025772 0.003780 0.023229 0.000000 彝族[13] 0.094028 0.189993 0.061012 0.054904 0.076758 0.022721 0.021975 0.327090 0.022979 0.008102 0.032636 0.008336 0.000000 纳西族[14] 0.094438 0.173688 0.058978 0.058992 0.078381 0.023124 0.018060 0.335448 0.024818 0.008774 0.023248 0.010194 0.009089 0.000000 日本人群[15] 0.099462 0.185518 0.066168 0.036783 0.080251 0.008683 0.010243 0.325122 0.026606 0.003187 0.023679 0.006106 0.008231 0.011813 0.000000 印度人群[16] 0.105637 0.186014 0.077436 0.059716 0.099815 0.024326 0.022901 0.334689 0.045724 0.014013 0.029487 0.014439 0.018083 0.019465 0.018190 0.000000 宁夏回族[17] 0.092766 0.179012 0.060018 0.053387 0.079086 0.017582 0.015580 0.320730 0.024201 0.004171 0.024065 0.003949 0.003815 0.006234 0.005949 0.011384 0.000000 伊犁维地区吾尔族[18] 0.011876 0.095765 0.100860 0.130743 0.108918 0.099432 0.099592 0.412676 0.091099 0.083543 0.096303 0.084121 0.084766 0.087187 0.084149 0.096855 0.081386 0.000000 长沙汉族[19] 0.050266 0.124632 0.097791 0.191280 0.091328 0.158492 0.153777 0.488916 0.125838 0.140880 0.136507 0.137303 0.142069 0.132549 0.147205 0.154349 0.138767 0.037496 0.000000 拉萨藏族[20] 0.019893 0.083069 0.118218 0.114822 0.127158 0.086276 0.087764 0.438257 0.095018 0.080479 0.087737 0.085672 0.089791 0.088243 0.082420 0.095327 0.084116 0.007435 0.053767 0.000000 怒江白族[21] 0.026784 0.091790 0.135895 0.142791 0.157151 0.111704 0.109450 0.448717 0.113373 0.097324 0.109013 0.103929 0.098482 0.099007 0.096941 0.117884 0.096831 0.014561 0.071961 0.014081 0.000000 大理白族[22] 0.015095 0.085721 0.112248 0.130195 0.122038 0.094348 0.096091 0.423142 0.096458 0.081886 0.090705 0.084250 0.082848 0.084821 0.083601 0.09195 0.07896 0.00521 0.04733 0.00502 0.01303 0.00000 2.4 NJ系统发育树和多维尺度分析（MDS）
为进一步探索白族民家支系与其他人群的亲缘关系，基于Nei’s遗传距离矩阵笔者构建了NJ系统发育树，见图1。从NJ系统发育树可以看出，白族民家支系与大理白族和怒江白族相距较近，而与云南布朗族和云南佤族相距较远。此外，基于Nei’s遗传距离矩阵笔者还进行了多维尺度分析（MDS），见图2。从MDS分析同样可以看出，白族民家支系与大理白族和怒江白族相距较近，而与云南布朗族和云南佤族相距较远。
图 1 白族民家支系与21个已发表人群的系统发育树Figure 1. The phylogenetic tree showing the relationship of the Minjia branch of Bai nationality and 21 published populations
图 2 白族民家支系与21个已发表人群的MDS分析（基于Nei’s遗传距离矩阵）Figure 2. Multidimensional scaling （MDS） plot based on Nei’s standard genetic distances matrix among Minjia branch of Bai nationality and 21 published populations3. 讨论
Ho和PIC等法医学参数常被用来衡量STR基因座的多态性程度，并推测其法医学应用价值。在本次针对白族民家支系的调查研究中发现，所选的18个STR基因座的PIC在0.5641～0.8977之间，PIC > 0.5，遗传标记具有高度的多态信息[27]。在个体识别和亲子鉴定中，CDP和CPE参数的计算是极其重要的。在针对白族民家支系的调查中发现，本研究所选的18个常染色体STR基因座的CDP达0.999999999，具有较强的个体识别能力；CPE达0.99999994055，大于0.9999，在亲子鉴定中具有极强的系统效能[28-29]。本研究所获得的白族民家支系18个常染色体STR基因座的法医学参数和群体遗传学数据具有极高的应用价值。
云南佤族和云南布朗族属于南亚语系中的孟高棉语族[30]。对Y染色体的研究发现，云南孟高棉语族起源于东亚南部[31]。而白族民家支系则属于汉藏语系的藏缅语族[32]。戴庆厦等[32]从语言学的角度发现，在中国南方分布的藏缅语族人群起源于中国北方的黄河流域。Wang等[33]对Y染色体的研究表明，中国南方分布的藏缅语族人群是由北方高原黄河流域迁徙而来。上述研究提示，云南佤族、云南布朗族与白族民家支系在起源上存在着显著的地理差异。与本研究结果，白族民家支系与云南佤族、云南布朗族在遗传上相距较远相一致。
白族的3个主要分支中，勒墨支系于15世纪之前就已经从大理白族的主体中迁徙出来，最终聚居于怒江流域的兰坪县[34]。而民家支系主要聚居于大理州[1]。上述史料与研究提示，白族民家支系与属于勒墨支系的怒江白族存在一定的差异。
本研究报道了白族民家支系18个常染色体STR基因座的等位基因频率和法医学参数等。研究结果提示，上述18个常染色体STR基因座在白族民家支系群体中具有较高的遗传多态性，可用于个体识别、亲子鉴定以及群体遗传结构的研究。
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图 3 肠道目标菌群PCR扩增曲线图
A：直肠真杆菌；B：乳酸杆菌；C：多形拟杆菌；D：双歧杆菌；E：GAPDH。
Figure 3. The real-time PCR curve of the target intestinal flora
表 1 引物及内参序列
Table 1. The sequences of primer and internal reference
细菌名称 序列（5′-3′） 直肠真杆菌 F: GGGTGACCGGCCACATTGGG R: ATCAGACTTGCCGCACCGCC 乳酸杆菌 F: AGCAGTAGGGAATCTTCCA R: CACCGCTACACATGGAG 双歧杆菌 F:GATTCTGGCTCAGGATGAACGC R: CTGATAGGACGCGACCCAT 多行拟杆菌 F: CCGCCTCCGTTAGCTGCGTG R: ACGTAGGCTGCACAGCCGGT GAPDH（内参） F: TCGGCATCATCGAAGGTCTG R: TGCCATTCAGTTCTGGCAGT F：上游引物 R：下游引物 
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表 2 2组受试者的一般临床指标比较 [M（P25，P75） /$ \bar x \pm s $]
Table 2. Comparison of the general data between the two groups [M（P25，P75） /$ \bar x \pm s $]
临床指标 NAFLD组（n=86） 健康对照组（n=32） Z/t P 性别（男/女） 49/37 12/20 3.543 0.060 年龄（岁） 50.63±15.02 40.34±12.47 3.454 0.001* BMI（kg/m2） 25.01±3.04 21.06±2.23 6.794 <0.001* 腰围（cm） 93.5（84.75，102.25） 81.5（75.25，84.0） −5.911 <0.001* 臀围（cm） 99.5（94.0，105.0） 93.0（89.25，95.75） −4.318 <0.001* FPG（mmol/L） 5.77（5.05，7.67） 4.96（4.09，5.25） −4.147 <0.001* HbA1C（%） 6.65（5.70，9.25） 5.45（5.33，5.58） −6.861 <0.001* HOMA-IR 2.46（0.52，3.82） 0.27（0.23，0.50） −6.435 <0.001* TC（mmol/L） 4.65±1.17 4.45±0.75 0.873 0.385 TG（mmol/L） 2.25（1.64，3.33） 0.89（0.70，1.30） −5.203 <0.001* HDL-C（mmol/L） 1.03±0.26 1.34±0.33 −5.386 <0.001* LDL-C（mmol/L） 2.93±1.06 2.71±0.59 1.128 0.262 AST（IU/L） 21.00（16.05，27.33） 21.35（14.60，25.28） −1.595 0.111 ALT（IU/L） 23.75（15.68，36.90） 15.15（12.23，20.18） −3.562 <0.001* γ-GGT（U/L） 46.50（23.00，83.00） 18.50（13.25，27.50） −5.238 <0.001* TBA（µmol/L） 3.85（2.20，7.15） 1.6（0.95，3.10） −2.177 0.030* UA（µmol/L） 390.92±124.92 328.80±70.15 2.657 0.009* GFR（mL/min） 103.05（82.25，130.81） 84.86（69.03，107.11） −2.851 0.004* *P < 0.05。
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表 3 2组受试者TMAO及其前体代谢物比较 [M（P25，P75） /$ \bar x \pm s $]
Table 3. Comparison of TMAO and its precursor metabolites between the two groups [M（P25，P75） /$ \bar x \pm s $]
代谢物 NAFLD组（n=86） 健康对照组（n=32） Z/t P TMAO（ng/mL） 240.20（148.97，386.84） 136.94（100.40，246.37） −3.584 <0.001* TMA（ng/mL） 186.88（146.30，278.83） 141.84（114.62，231.03） −2.312 0.021* 胆碱（ng/mL） 1882.20±442.22 1582.59±538.60 3.079 0.003* 甜菜碱（ng/mL） 4121.55±973.57 4175.00±855.83 −0.274 0.785 左旋肉碱（ng/mL） 7736.19±2334.51 8084.90±1703.53 −0.771 0.442 *P < 0.05。
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表 4 肝脏脂肪含量与TMAO、TMA及胆碱相关性
Table 4. Correlation between liver fat content and TMAO，TMA and choline
项目（n=118） 相关系数（r） P TMAO 0.250 0.043* TMA 0.182 0.143 胆碱 0.173 0.166 *P < 0.05。
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表 5 2组受试者4种肠道菌群表达量比较 [M（P25，P75）]
Table 5. Comparison of the expression levels of intestinal microbiota in the two groups [M（P25，P75）]
肠道菌群 NAFLD组（n=86） 健康对照组（n=32） Z P 直肠真杆菌 3.24（1.64，10.60） 0.93（0.27，2.12） −4.240 <0.001* 乳酸杆菌 9.71（0.16，26.26） 1.06（0.46，5.18） −2.450 0.014* 多形拟杆菌 0.62（0.10，3.57） 2.80（0.35，11.08） −2.217 0.027* 双歧杆菌 0.05（0.004，0.30） 1.18（0.26，2.90） −5.453 <0.001* *P < 0.05。
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表 6 TMAO水平与4种肠道菌群表达量相关性（n=118）
Table 6. Correlation between TMAO and the expression levels of intestinal microflora（n=118）
项目 相关系数（r） P 直肠真杆菌 0.280 0.004* 乳酸杆菌 0.163 0.097 多形拟杆菌 −0.161 0.101 双歧杆菌 −0.332 0.001* *P < 0.05。
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表 7 饮食结构在2组间的差异
Table 7. Differences in dietary structure between the two groups
是否按时就餐 膳食搭配（荤/素） 每日饮水量（ml） 鸡蛋 牛奶 鱼类 红肉 动物内脏 水果 油腻油炸食物 甜食饮料 Z −0.473 −3.251 −0.136 −0.091 −0.226 −3.500 −0.882 −0.313 −0.898 −0.073 −0.482 P 0.636 0.001* 0.892 0.928 0.821 <0.001* 0.378 0.755 0.369 0.942 0.630 *P < 0.05，食物种类食用频率均为每周次数。
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表 8 肝脏脂肪含量与饮食结构的相关性（n=118）
Table 8. Correlation between liver fat content and diet structure（n=118）
项目（n=118） 相关系数（r） P 膳食搭配（荤/素） 0.345 0.004* 鱼类（每周次数） −0.289 0.019* *P < 0.05。
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