胆囊癌是肝外胆道系统发病率较高的恶性肿瘤之一，胆囊癌的发病率约占80%～95%，在胃肠道肿瘤中排名第六^[1]。由于缺乏早期临床症状，早期诊断胆囊癌较为困难，且肿瘤恶性程度高，侵袭性强，故疾病进展迅速，且有较高的转移和复发率，手术切除是唯一可能的治愈手段，但适合根治性手术的病例很少，且中期胆囊癌患者即使接受根治手术，术后辅助治疗疗效也较差^[2]，因此早期诊断、早期治疗对于胆囊癌的治疗具有重要意义。但是由于胆囊癌早期临床症状较为隐蔽，早期发现极为困难，故研究胆囊癌术后复发及抑制胆囊癌侵袭转移是治疗进展期胆囊癌的重要靶点，对于改善胆囊癌的总生存期和疾病进展时间具有重要的意义。

Twist1基因在肿瘤形成过程中的作用已成为目前研究热点，国内外学者的研究主要集中在肿瘤干细胞的自我更新，但其在胆囊癌侵袭及转移过程中的具体调控网络及其分子机制还不十分清楚。有研究表明Twist1在胆囊癌组织的阳性表达显著，且其表达与胆囊癌T分类、淋巴结转移等密切相关^[3]。本研究旨在探讨Twist1对胆囊癌细胞侵袭转移的影响及其对Bmi1可能存在的调控机制。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

胆囊癌细胞株GBC-SD细胞由中国科学院昆明动物研究所细胞库所提供，细胞培养在10%胎牛血清的DEME完全培养基（含1%链-青霉素双抗）。Twist1 shRNA慢病毒载体购于汉恒生物科技（上海）有限公司。Twist1抗体（10E4E6）、Bmi1抗体[EPR3745（2）]、E-cadherin抗体（EP700Y）及N-cadherin（EPR22397-264）抗体购自美国Abcam公司。SureScript-First-strand-cDNA-synthesis-kit试剂盒及BlazeTaq™ SYBR®Green qPCR Mix 2.0试剂盒购于广州Genecopoeia公司。

1.2   细胞培养及感染

细胞培养于DEME完全培养基，37 ℃、5%CO₂的培养箱内，观察生长情况，2～3 d后细胞生长汇合至培养瓶的80%左右时消化传代。将GBC-SD细胞随机分为3组，其中加入Twist1 shRNA慢病毒的为实验组（Twist1组），加入空载慢病毒的为阴性对照组（NEG组），加入完全培养基的为空白对照组（GBC-SD）。将各组细胞接种于6孔板中（2×10⁵个/孔），培养24 h，当细胞汇合率介于30%～50%之间，加入含80 μL慢病毒的完全培养基1 mL，慢病毒感染4 h后再加入1 mL完全培养基，感染24 h后将培养基更换为完全培养基继续培养，72 h嘌呤霉素筛选转染成功的细胞。

1.3   细胞迁移实验

将准备好的各组细胞接种于6孔板中，细胞生长汇合率达到100%时，取1 000 μL枪头做划痕，清洗，拍照取样记录0 h划痕面积，无血清培养基继续培养48 h，拍照记录划痕面积。细胞迁移率 = （0 h划痕面积 - 48 h划痕面积）/0 h划痕面积×100%^[4]。

1.4   细胞侵袭实验

取提前溶解稀释好的ECM胶50 μL加入上室，放入培养箱中1 h，等待基质胶凝固，在小室内加入无血清培养基制备的200 μL细胞悬液，下室中则加入完全培养基，将Transwell小室置于培养箱培养24 h，使用甲醇固定，0.1%结晶紫染色，去除上室的基质胶和残余细胞，拍照记录。以细胞穿膜数量来表示细胞侵袭能力。

1.5   蛋白印迹（ Western blot）检测

各组细胞每组10⁶个细胞加120 μL RIPA裂解液裂解细胞，离心（12500 r/min，4 ℃，15 min），收集上清，即为总蛋白溶液。BCA法检测蛋白浓度。蛋白样经电泳、转膜、封闭。分别加入一抗、二抗，然后洗膜3次。化学发光法曝光显影并拍照，根据蛋白灰度值分析表达情况。

1.6   RNA提取及RT-PCR

采用TRIzol法提取细胞中的RNA，检测RNA浓度及纯度，使用SureScript-First-strand-cDNA-synthesis-kit试剂盒进行逆转录。按照BlazeTaq™SYBR®Green qPCR Mix 2.0试剂盒进行RT-PCR检测。相关mRNA的PCR引物设计由擎科生物科技有限公司参照GeneBank序列合成，内参基因为Gapdh。序列见表1。

表  1  相关引物序列

Table  1.  Sequence of relevant primers

基因	序列	碱基数
Twist1-F	AGCTGAGCAAGATTCAGACC	20
Twist1-R	CAGCTTGCCATCTTGGAGTC	20
Bmi1-F	GACTCTGGGAGTGACAAGGC	20
Bmi1-R	ACTGGAGTACTGGGGCTAGG	20
E-Cadherine-F	GGCTGGACCGAGAGAGTTT	19
E-Cadherine-R	GCTGTGGAGGTGGTGAGAG	19
N-cadherin-F	GACTGGGTCATCCCTCCAATCAACT	25
N-cadherin-R	GGGGCTTTGTCACCGACAGC	20
Gapdh-F	CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC	21
Gapdh-R	GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC	24

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1.7   统计学处理

采用SPSS 26.0软件进行数据处理。计量资料采用均数±标准差（$\bar x \pm s $）表示，方差齐性计量资料采用单因素方差分析（两两比较采用LSD法），方差不齐性计量资料采用非参数检验的Kruskal-Wallis秩和检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   靶向沉默Twist1慢病毒感染GBC-SD细胞

感染72h后，通过GBC-SD胆囊癌细胞中红色荧光蛋白的表达观察Twist1 shRNA慢病毒感染GBC-SD胆囊癌细胞的情况，慢病毒感染后稳转的细胞Twist1t稳定表达，且与未感染的细胞相比生长较为缓慢。在倒置荧光显微镜下观察感染慢病毒的GBC-SD胆囊癌细胞生长情况见图1，Twist1感染GBC-SD细胞并经嘌呤霉素筛选后，使用3组细胞进行q-PCR及WB实验检测Twist1的表达情况，结果见表2。实验结果表明实验组和NEG组GBC-SD细胞成功感染慢病毒，靶向敲低twist1可以抑制GBC-SD细胞生长。

图  1  成功感染慢病毒并经过筛选后的细胞生长情况（10×）

A：Twist1组；B：NEG组。

Figure  1.  Growth of cells successfully infected with lentivirus and screened （10×）

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表  2  各组细胞Twist1表达情况（$n\;=\;3$，$\bar x \pm s $）

Table  2.  Expression of Twist1 in each group （$n\;=\;3$，$\bar x \pm s $）

组别	Twist1
	mRNA	蛋白
Twist1组	0.35 ± 0.02ab	0.35 ± 0.20ab
NEG组	1.26 ± 0.23	0.95 ± 0.21
GBC-SD组	1.00 ± 0.48	1.01 ± 0.18
F	34.11	31.03
P	0.0005*	< 0.0001*
*P < 0.05；与NEG组比较，a P < 0.0001；与GBC-SD组比较，b P < 0.0001。

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2.2   靶向沉默Twist1抑制胆囊癌细胞的迁移及侵袭能力

划痕实验及transwell侵袭实验结果显示，与NEG组及GBC-SD组相比Twist1组细胞划痕愈合度、侵袭细胞数量低（P < 0.05），而NEG组与GBC-SD组细胞划痕愈合度、侵袭细胞数量比较差异无统计学意义（P > 0.05）。上述实验说明，靶向沉默twist1可以抑制胆囊癌细胞的迁移，见图2、图3、表3。

图  2  细胞划痕实验检测GBC-SD细胞的迁移能力（4×）

A：Twist1组0 h；B：NEG组0 h；C：GBC-SD组0 h；D：Twist1组48 h；E：NEG组48 h；F：GBC-SD组48 h；G：3组48 h细胞迁移率。ns为P > 0.05，^****为P < 0.0001。

Figure  2.  2 Migration ability of BGC-SD cells detected by cell scratch assay （4×）

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表  3  各组细胞划痕愈合度及侵袭细胞数（$n\;=\;20$，$\bar x \pm s $）

Table  3.  Scratch healing degree and number of cells invaded in each group （$n\;=\;20$，$\bar x \pm s $）

组别	细胞划痕愈合度（%）	穿膜细胞数（个）
Twist1组	26.75 ± 19.89ab	34.95 ± 6.61ab
NEG组	66.54 ± 7.37	327.00 ± 34.85
GBC-SD	63.37 ± 9.91	314.50 ± 32.08
F/χ²	147.6	40.39
P	< 0.0001*	< 0.0001*
*P < 0.05；与NEG组比较，a P < 0.0001，与GBC-SD组比较，b P < 0.0001。

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图  3  侵袭实验检测GBC-SD细胞的侵袭能力（10×）

A：Twist1组；B：NEG组；C：GBC-SD组；D：3组细胞穿膜细胞数，ns为P > 0.05，^****为P < 0.0001。

Figure  3.  Invasion assay to detect the invasion ability of BGC-SD cells （10×）

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2.3   靶向沉默Twist1对GBC-SD蛋白及mRNA表达情况的影响

Western blot及qPCR结果显示，靶向沉默twist1后，Twist1组细胞Twist1、 Bmi1、N-Cadherine蛋白以及mRNA相对表达量均较NEG组及GBC-SD组低（P < 0.001），E-Cadherine蛋白、mRNA相对表达量较NEG组及GBC-SD组高（P < 0.0001），而NEG组与GBC-SD组细胞间蛋白、mRNA相对表达量比较差异无统计学意义（P > 0.05）。实验表明靶向沉默Twist1下调Bmi1及N-Cadherine蛋白、mRNA表达，上调E-Cadherine蛋白、mRNA的表达，见图4～图6。

图  4  Western Blot检测各组细胞Twist1、Bmi1、E-Cadherine及N-Cadherine蛋白表达水平柱状图

Figure  4.  Histogram of protein expression levels of Twist1，Bmi1，E-Cadherine and N-Cadherine in each group detected by Western Blot

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图  5  Western Blot检测各组细胞Twist1、Bmi1、E-Cadherine及N-Cadherine蛋白表达水平

ns为P > 0.05，^***P < 0.001，^****P < 0.0001。

Figure  5.  The expression levels of Twist1，Bmi1，E-Cadherine andN-Cadherine in each group were detected by Western Blot

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图  6  qPCR检测各组细胞Twist1、Bmi1、E-Cadherine及N-Cadherine mRNA表达水平柱状图

ns为P > 0.05，^**P < 0.01，^***P < 0.001，^****P < 0.0001。

Figure  6.  mRNA expression columns of Twist1，Bmi1，E-Cadherine and N-Cadherine in each group were detected by qPCR

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3.   讨论

胆囊癌侵袭性强、治疗选择有限，且缺乏早期诊断，无法早期治疗，因此其预后非常差。在手术可治愈的早期阶段，往往因患者症状不明显而错过治愈机会。组学技术的进步为探索胆囊癌的发病机制、炎症驱动的肿瘤起始和进展提供了更多的方案^{[2, 5]}。因此，对胆囊癌的发生发展、侵袭转移的研究有重要意义。本课题组前期研究已发现，靶向沉默twist1基因的下游基因bmi1能够促进GBC的细胞凋亡，从而抑制GBC的细胞增殖^[6]。这说明了bmi1在GBC的进展中具有重要作用。Bmi1和Twist1同时共调控多个靶点。两者可能存在关键的调控交汇点及反馈环路及在胆囊癌的转移过程中扮演着何种角色目前还知之甚少。因此本研究致力于探讨Twist1是否通过影响Bmi1的表达来影响胆囊癌侵袭转移。

Twist1蛋白是一种高度保守的碱性螺旋-环-螺旋（Basic helix-loop-helix，bHLH）转录因子，最初是1983年在果蝇中被发现是胚胎发育过程中的重要调节因子^[7-8]。人类twist1基因位于染色体7q21.2，有2个外显子和1个内含子^[9]。Twist家族bHLH蛋白结合为二聚体，并识别顺式调节元件E-box作为转录因子诱导上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition EMT），从而促进肿瘤转移^[10]。例如twist1激活下游靶基因PDGFRβ促进乳腺癌干细胞的发生和转移^[11]。另有研究显示twist1直接结合PCOLCE启动子的E-box上调PCOLCE而促进骨肉瘤的转移。在不同的肿瘤类型和组织环境中，Twist1的表达由一系列不同的上游调控因子通过多种途径调节^[12]。Jinchang Pan等^[13]研究者发现lncRNAJPX通过竞争性海绵miR-33a5p上调twist1，诱导EMT和肺癌细胞侵袭。本研究中发现靶向沉默twist1可抑制胆囊癌细胞的迁移及侵袭、上调E-Cadherine蛋白及mRNA的表达，且下调N-Cadherine蛋白及mRNA的表达，这表明twist1参与了胆囊癌细胞EMT过程从而促进胆囊癌细胞的侵袭转移。

Bmi1最早在1991年荷兰癌症中心发现的一种原癌基因^[14]。人类bmi1基因位于染色体10p13，由10个外显子和10个内含子组成，其分子量为36.9kD^[15]。近年来许多研究表明，bmi1与肿瘤的发生，侵袭，转移，化学耐药和癌症干性等方面有着密切关系。有研究表明下调Bmi1可减少子宫内膜癌细胞在体内的迁移和侵袭，同时会导致上皮标记物E-Cadherine和角蛋白的表达水平升高，间充质标记物N-Cadherine、波形蛋白和下游转录因子Slug的表达水平降低^[16]。Yang M H等^[17]在头颈癌侵袭、转移机制的研究中证实bmi1是twist1的下游靶基因，bmi1通过下调E-cadherin和p16INK4a的表达，促进EMT从而使肿瘤获得侵袭能力。有学者研究证实在头颈癌中twist1与Bmi1共同抑制let-7i的表达，导致NEDD9和DOCK3上调从而激活RAC1，实现间充质模式运动诱导癌细胞转移^[18]。大量研究表明bmi1在不同肿瘤中也参与了肿瘤的发生发展及EMT过程。本研究结果提示，靶向沉默twist1抑制了bmi1的表达，twist1可能参与调节胆囊癌细胞中bmi1转录和翻译，而靶向沉默twist1抑制胆囊癌的侵袭迁移可能是通过抑制肿瘤发生发展过程中的上皮间充质转化EMT过程实现的。

综上所述，靶向沉默twist1可以抑制胆囊癌细胞的迁移、侵袭，其作用机制可能与下调bmi1表达，并抑制上皮间充质转化有关，这一实验结果丰富了胆囊癌侵袭、迁移的分子机制，为胆囊癌的靶向治疗提供新的研究思路。