The “Window Effect” Study on the Effect of 1800 MHz Electromagnetic Radiation Irradiation on GFAP Expression in the Hippocampus of Rats
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摘要:
目的 在1800 MHz电磁波照射下，研究电磁波功率密度对SD大鼠海马胶原纤维酸性蛋白（GFAP）表达的影响，以及是否具有“窗口效应”。 方法 将98只4周龄SPF级SD大鼠随机分为14个组，每组7只，7组暴露组（频率：1800 MHz，功率密度：0.1 mW/cm2、0.3 mW/cm2、0.5 mW/cm2、0.7 mW/cm2、0.9 mW/cm2、1.0 mW/cm2、1.2 mW/cm2）和7组对照组（功率密度：0 mW/cm2），每天暴露12 h，持续3周。暴露结束后，采用Western Blot检测海马组织的GFAP表达水平，免疫组化法测定海马组织中DG、CA3和CA1区域的GFAP阳性表达产物平均光密度（MOD）值，以确定在1800 MHz暴露下的SD大鼠海马中GFAP表达的功率密度窗口。 结果 在0.1 mW/cm2和0.3 mW/cm2功率密度下，Western Blot结果表示 ， 可增加大鼠海马GFAP表达量（P < 0.05）以及免疫组化染色显示可增加3个区域GFAP的MOD值（P < 0.05）。 结论 长时间暴露于1800 MHz电磁辐射对SD大鼠海马DG区、CA3区和CA1区的GFAP表达有影响具有“窗口效应”，强度窗口的功率密度为0.1 mW/cm2和0.3 mW/cm2。 -
关键词:
- 电磁辐射 /
- 神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP） /
- 窗口效应 /
- 1 800 MHz
Abstract:Objective To investigate the effect of electromagnetic wave power density on the expression of glial fibrillary acidic protein（GFAP） in the hippocampus of SD rats under 1800 MHz electromagnetic wave irradiation, and whether it exhibits a “window effect”. Methods Ninety-eight 4-week-old SPF-grade SD rats were randomly divided into 14 groups, with 7 rats in each group. Seven groups were exposed groups （frequency: 1800 MHz, power densities: 0.1 mW/cm2, 0.3 mW/cm2, 0.5 mW/cm2, 0.7 mW/cm2, 0.9 mW/cm2, 1.0 mW/cm2, 1.2 mW/cm2） and corresponding 7 groups were control groups（power density: 0 mW/cm2）. Exposure was conducted for 12 hours daily for 3 weeks. After exposure, Western Blot was used to detect the expression level of GFAP in the hippocampal tissue, and immunohistochemistry staining was performed to determine the average optical density（MOD） value of GFAP-positive expression products in the DG, CA3, and CA1 regions of the hippocampal tissue, to determine the power density window of GFAP expression in the hippocampus of SD rats under 1800 MHz exposure. Results At power densities of 0.1 mW/cm2 and 0.3 mW/cm2, Western Blot results showed increased expression of GFAP in the rat hippocampus（P < 0.05）, and immunohistochemistry staining demonstrated increased MOD values of GFAP in the three regions（P < 0.05）. Conclusion Long-term exposure to 1800 MHz electromagnetic radiation has a “window effect” on the expression of GFAP in the DG, CA3, and CA1 regions of the hippocampus in SD rats, with power density windows of 0.1 mW/cm2 and 0.3 mW/cm2. -
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏症（OMIM #305900）属于最为常见的人类遗传性酶缺乏疾病，俗称“蚕豆病”[1]。该病为X连锁不完全显性遗传，缺陷者广泛分布于非洲、地中海沿岸、中东、东南亚等地区，全球约有5亿人受累[2]。我国G6PD缺乏症呈“南高北低”的分布特点[3]，云南亦属于该病高发地区。云南省是我国少数民族最多的省份，G6PD缺乏症是云南少数民族地区最为高发的遗传性疾病之一[4-5]。本研究采用G6PD酶活性FST检测+NGS对云南省德宏州盈江县傣族孕龄人群进行G6PD缺乏症分子流行病学调查，现将结果报道如下。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
研究所用血样来源于2018年8月至2020年8月期间，在云南省盈江县妇幼保健院进行孕前及孕期优生检查的育龄夫妇共416例，年龄18～45岁，其中男性186例，女性230例。本研究试验方案经云南省第一人民医院伦理委员会审查批准通过（批号2018GJ108），自愿者在采集血液前均由本人签署知情同意书。采用EDTA抗凝管收集自愿者的外周静脉血约4 mL，置于4℃冰箱内保存。
1.2 FST定量检测酶活性
采用FST检测；G6PD试剂盒（购自芬兰PerkinElmer公司），芬兰WALLAC-1420荧光读数仪及DELFIA自动振动器，美国S＆S903滤纸。针刺或静脉采血滴于滤纸片上，每例样本采集3个血斑，每个血斑直径大于8 mm，正面渗透至背面。室内水平放置自然晾干后，放于干净塑料袋封口，3d内完成检测G6PD酶活性，诊断标准以G6PD酶活性≤2.2 U/gHb为缺乏[6]。
1.3 NGS检测G6PD基因突变位点
将416例血样送上海英莱盾生物技术有限公司进行NGS，收到测序结果后，对NGS结果进行数据分析。实验基本步骤包括：（1）基因组DNA提取及G6PD基因多重扩增；（2）PCR产物纯化回收；（3）G6PD基因不同片段引物扩增及终产物纯化；（4）使用Illumina测序平台进行测序；（5）数据分析，将读取的数列与人的参考基因组（hg19）进行对比分析，得到所有样本的SNP位点；（6）将所得结果与已知的12个基因突变位点[4]进行比较分析得出突变位点；（7）一代测序验证结果。
1.4 统计学处理
使用SPSS 20.0统计软件进行统计分析：计量资料平均值±标准差（mean±SD）；德宏州盈江县傣族育龄人群中男性与女性中不同G6PD基因突变类型导致酶活性变化情况使用独立样本t检验，P < 0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 G6PD酶活性的FST检测结果
对德宏州盈江县傣族孕龄人群416例（男性186例，女性230例）样本进行FST检测，共检出G6PD酶缺乏样本92例，阳性率22.12%（92/416）；其中男性51例，阳性率27.42%（51/186），女性41例，阳性率17.83%（41/230）；男女性别间差异具有统计学意义（χ2 = 5.495，P < 0.05），见表1。
表 1 G6PD酶活性筛查阳性情况统计Table 1. G6PD enzyme activity screening组别 筛查数（n） 酶缺乏数（n） 阳性率（%） 男性 186 51 27.42 女性 230 41 17.83 合计 416 92 22.12 2.2 G6PD基因突变率及基因突变类型
在416例样本的基因诊断中，共发现221例存在突变，突变率为53.13%（221/416）；其中男性85例，突变率为45.70%（85/186），女性136例，突变率为59.13%（136/230）。NGS发现大量c.1311 C > T突变，携带率为33.17%（138/416）。单发的c.1311 C > T突变122例，其中男性50例，女性纯合突变21例，女性杂合突变51例；主要致病的单发突变由多至少排列为：c.487G > A突变、c.1388G > A突变、c.392G > T突变、c.1376G > T突变、c.143T > C突变、c.1024C > T突变。复合突变中，共发现21例突变，见表2。男性患者突变类型主要以单一位点突变为主，而女性的复合杂合突变类型例数较多。
表 2 德宏州盈江县傣族人群G6PD基因型分布（n）Table 2. Distribution of G6PD genotype among Dai people in Yingjiang，Dehong （n）突变类型 男性半合子 女性 总计[n（%）] 杂合子 纯合子 c.1311 C > T 50 51 21 122（55.20） c.487G > A 12 18 4 34（10.82） c.1388G > A 6 12 1 19（8.60） c.392G > T 8 7 1 16（7.24） c.1376G > T 4 2 — 6（2.71） c.143T > C — 2 — 2（0.90） c.1024C > T — 1 — 1（0.45） c.1311 C > T/ c.487G > A — 6 — 6（2.71） c.1311 C > T/ c.1388G > A 2 3 — 5（2.26） c.1311 C > T/ c.1376G > T — 3 — 3（1.36） c.1311 C > T/ c.392G > T 1 — — 1（0.45） c.1311 C > T/ c.487G > A/ c.392G > T — 1 — 1（0.45） c.487G > A/ c.392G > T 1 2 — 3（1.36） c.487G > A/ c.1376G > T — 1 — 1（0.45） c.1388G > A/ c.1376G > T 1 — — 1（0.45） 总计 85 109 27 221（100.00） 2.3 NGS检测与FST检测的结果比较
盈江县傣族男性c.487G > A、c.1388G > A突变酶活性明显低于女性，差异具有统计学意义（P < 0.001、P < 0.05）；男性c.1311C > T突变酶活性降低较女性明显，差异有统计学意义（P < 0.05），但该突变类型中，无论男性和女性G6PD酶活性的均值均大于2.2 U/gHb，见表3。
表 3 G6PD基因5种主要突变类型与酶活性筛查情况统计（$\bar x \pm s $ ）Table 3. Five major mutation types of G6PD gene and enzyme activity screening （$ \bar x \pm s$ ）突变类型 男性 女性 t P n G6PD酶活性（U/gHb） n G6PD酶活性（U/gHb） c.1311C > T 53 2.81 ± 1.20 85 3.30 ± 1.09 −2.492 0.014* c.487G > A 13 1.08 ± 1.10 32 2.88 ± 1.38 −4.178 0.001* c.1388G > A 9 1.38 ± 0.82 16 2.83 ± 0.88 −4.037 0.001* c.392G > T 10 1.66 ± 1.08 11 2.36 ± 1.08 −1.495 0.151 c.1376G > T 5 0.94 ± 0.78 6 2.30 ± 1.70 −1.638 0.136 *P < 0.05。 本研究中，416例样本经FST检测G6PD缺乏症92例，阳性率为22.12%，而NGS检测G6PD缺乏症221例，阳性率为53.13%，2种检测方法结果一致性较差（Kappa = 0.280），见表4。
表 4 盈江县傣族孕龄人群2种检测方法G6PD缺乏症检测结果（n）Table 4. Results of G6PD deficiency detection by two methods in pregnant age of Dai population in Yingjiang （n）FST检测G6PD缺乏症 NGS检测G6PD缺乏症 合计 阴性 阳性 阴性 182 142 324 阳性 13 79 92 合计 195 221 416 如若在结果中不计c.1311 C > T位点突变，以总样本416例为对象，NGS与FST检测结果一致性Kappa值可增加至0.396，尤其男性的结果一致性最好，其Kappa = 0.658，见表5；但女性结果一致性仅为0.233，见表6。
表 5 盈江县傣族男性孕龄人群2种检测方法G6PD缺乏症检测结果（n）Table 5. Results of G6PD deficiency detection by two methods in male of pregnant age of Dai population in Yingjiang （n）FST检测G6PD缺乏症 NGS检测G6PD缺乏症 合计 阴性 阳性 阴性 131 4 135 阳性 19 32 51 合计 150 36 186 表 6 盈江县傣族女性孕龄人群2种检测方法G6PD缺乏症检测结果（n）Table 6. Results of G6PD deficiency detection by two methods in female of pregnant age of Dai population in Yingjiang （n）FST检测G6PD缺乏症 NGS检测G6PD缺乏症 合计 阴性 阳性 阴性 146 43 189 阳性 20 21 41 合计 166 64 230 根据NGS与FST两者对比结果汇总G6PD酶活性漏诊情况：FST检测G6PD酶活性漏诊主要为女性杂合子突变共85例，男性半合子突变为40例，女性纯合子突变为17例；如不计c.1311 C > T位点突变，女性杂合子仍有42例，男性半合子突变4例，女性纯合子突变1例，见表7。
表 7 FST检测G6PD酶活性漏诊情况（n）Table 7. Misdiagnosis of G6PD enzyme activity by FST （n）突变类型 男性
半合子女性 总计
[n（%）]杂合子 纯合子 c.487G > A — 15 1 16（11.27） c.1311 C > T/ c.487G > A — 3 — 3（2.11） c.487G > A/ c.392G > T 1 1 — 2（1.41） c.1311 C > T/c.487G > A/c.392G > T — 1 — 1（0.70） c.1388G > A 1 12 — 13（9.15） c.1311 C > T/c.1388G > A 1 2 — 3（2.11） c.392G > T — 4 — 4（2.82） c.1376G > T 1 — — 1（0.70） c.1311 C > T/ c.1376G > T — 2 — 2（1.41） c.143T > C — 2 — 2（1.41） c.1311 C > T 36 43 16 95（66.90） 合计 40 85 17 142（100.00） 3. 讨论
G6PD缺乏症属于X连锁不完全显性遗传，酶缺乏的表现度不一。男性半合子酶活性缺乏显著，容易出现临床表现。而女性的遗传表现比较复杂，纯合子女性可以发病，但很少见；而女性杂合子因X染色体随机失活因素，其酶活性有较大的变异度，受累者可无临床表现，亦可表现出酶缺乏、蚕豆病、溶血性贫血等临床症状。本研究采用FST检出男性G6PD酶活性缺陷阳性率明显高于女性，符合该病遗传方式及特征。
G6PD基因突变具有明显的区域和种族特异性[7-8]。以往的研究显示，我国G6PD基因携带率在不同地区也存在着较大差异：赵颖等[9]利用PCR+导流杂交法对广东东莞地区1005份样本进行筛查时发现G6PD基因携带率为20.90%（男性15.54%、女性24.42%）；李頔等[10]利用多色探针荧光PCR溶解曲线法对贵阳市5486例孕妇进行G6PD基因筛查时发现其基因携带率为3.35%；有学者对海南省908 例样本利用高分辨率溶解曲线法进行G6PD基因突变类型检测，G6PD基因携带率为9.91%（男性7.52%、女性12.15%）[11]。本研究利用NGS对德宏州盈江县傣族孕龄人群416例样品在12个G6PD基因突变位点进行检测。共检出221例存在突变，携带率为53.13%（221/416）；其中男性85例，携带率为45.70%（85/186），女性136例，携带率为59.13%（136/230）。
目前，全球已报道的G6PD基因突变类型约有400种，但能导致G6PD酶缺乏的基因突变类型仅有200多种，其中大部分为单碱基致病性突变，各国各地区G6PD缺乏症致病突变类型不尽相同[12]。我国主要以c.1376 G > T、c.1388 G > A、c.95 A > G及c.1024 C > T等单碱基突变为主[13]。本研究结果显示，德宏州盈江县傣族人群G6PD缺乏症最为常见致病突变为：c.487G > A、c.1388G > A、c.392G > T、c.1376G > T，与先前报道一致[4]。
相较以往基因突变位点的定点检测，NGS所检测的基因信息更多、基因序列更长，拥有更多的信息位点用于开展基因相关的突变谱及位点多态性有更全面的认识。本研究发现，盈江县傣族人群G6PD基因突变类型携带率为目前国内已报道的最高之一，在亚洲乃至世界范围内也属于较高水平[14]。这可能与既往未对此地区傣族人群进行大规模NGS检测，且NGS对G6PD基因突变位点识别有较高的准确性有关[15-16]。此外，既往研究仅对酶活性阳性患者进行G6PD基因型鉴定，对大部分酶活性正常的女性杂合子群体存在漏检，导致基因携带率偏低。
盈江县傣族孕龄人群FST筛查G6PD缺乏症阳性率22.12%（92/416）；其中男性51例，阳性率27.42%（51/186），女性41例，阳性率17.83%（41/230）；本研究中G6PD基因携带率高达53.13%，而酶活性筛查阳性率仅占22.12%，说明FST对筛查G6PD缺乏症存在漏检；通过对NGS和研究表示男性阳性率明显高于女性，符合该病遗传方式。在前期研究[4]的基础上，笔者选取德宏傣族人群G6PD基因常见的12个突变位点，采用NGS检测基因的相关突变类型特征分析，增强对G6PD缺乏症筛查的准确率和效率，同时通过对比明确FST对女性杂合子类型的漏诊率，为遗传咨询工作提供依据，并为今后深入研究云南省德宏州傣族人群G6PD缺乏症高发机制提供相关理论和实践基础。综上所述，云南省德宏州盈江县傣族孕龄人群G6PD缺乏症基因突变率高，针对该地区傣族G6PD缺乏症的筛查和诊断，运用NGS和G6PD酶活性检测相结合的方法，可明显提高检出率，为遗传咨询和产前诊断提供必要的支持。
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图 1 GFAP在大鼠海马CA1区的表达（×400）
Figure 1. Expression of GFAP in the CA1 region of the rat hippocampus.（×400）
图 2 14组大鼠海马GFAP蛋白表达表达结果
A：GFAP蛋白表达量；B：GFAP相对蛋白表达量。*P < 0.05，**P < 0.01。
Figure 2. Expression of GFAP protein in the hippocampus of rats in 14 groups
表 1 实验大鼠的基本情况[（$ \bar x \pm s$），n = 7]
Table 1. Basic information of experimental rats[（$ \bar x \pm s $），n = 7]
分组 性别（雄/雌） 体重（g） t P E0.1组 暴露组 4/3 228.19 ± 32.48 −0.451 0.660 对照组 3/4 236.60 ± 37.10 E0.3组 暴露组 4/3 224.61 ± 19.45 −0.275 0.788 对照组 3/4 227.78 ± 23.52 E0.5组 暴露组 4/3 239.47 ± 31.19 0.214 0.834 对照组 3/4 236.81 ± 10.37 E0.7组 暴露组 3/4 234.75 ± 43.21 0.165 0.872 对照组 4/3 231.02 ± 41.27 E0.9组 暴露组 3/4 237.83 ± 41.29 0.147 0.885 对照组 4/3 234.45 ± 44.60 E1.0组 暴露组 3/4 228.11 ± 32.57 0.154 0.880 对照组 4/3 225.21 ± 37.54 E1.2组 暴露组 3/4 231.93 ± 29.53 −0.079 0.938 对照组 4/3 233.23 ± 31.63 
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表 2 14组大鼠海马3个区GFAP表达的MOD值（$ \bar x \pm s$，n = 7）
Table 2. MOD values of GFAP expression in three areas of the hippocampus of rats in 14 groups（$ \bar x \pm s$，n = 7）
分组 DG区 Z P CA3区 Z P CA1区 Z P E0.1组 暴露组 0.1148 ± 0.0336 −6.192 < 0.001** 0.1238 ± 0.0547 −5.868 < 0.001* 0.1207 ± 0.0556 −6.049 < 0.001* 对照组 0.0293 ± 0.0096 0.0530 ± 0.0283 0.0364 ± 0.0095 E0.3组 暴露组 0.1092 ± 0.0524 −5.272 < 0.001** 0.1104 ± 0.0529 −5.780 < 0.001* 0.1070 ± 0.0579 −4.801 < 0.001* 对照组 0.0305 ± 0.0157 0.0549 ± 0.0568 0.0306 ± 0.0169 E0.5组 暴露组 0.0251 ± 0.0131 −1.667 0.096 0.0336 ± 0.0125 −1.066 0.145 0.0283 ± 0.0077 −0.279 0.391 对照组 0.0312 ± 0.0272 0.0340 ± 0.0257 0.0337 ± 0.0274 E0.7组 暴露组 0.0194 ± 0.0141 −0.939 0.174 0.0176 ± 0.0148 −0.787 0.431 0.0201 ± 0.0147 −1.235 0.108 对照组 0.0146 ± 0.0087 0.0142 ± 0.0111 0.0153 ± 0.0103 E0.9组 暴露组 0.0272 ± 0.0157 −0.873 0.191 0.0327 ± 0.0229 −0.854 0.197 0.0242 ± 0.0136 −0.931 0.176 对照组 0.0232 ± 0.0411 0.0373 ± 0.0447 0.0282 ± 0.0385 E1.0组 暴露组 0.0247 ± 0.0239 −1.376 0.169 0.0311 ± 0.0235 −1.809 0.070 0.0334 ± 0.0330 −1.755 0.080 对照组 0.0170 ± 0.0081 0.0270 ± 0.0130 0.0217 ± 0.0087 E1.2组 暴露组 0.0177 ± 0.0046 −0.130 0.448 0.0243 ± 0.0056 −0.872 0.192 0.0267 ± 0.0135 −1.512 0.065 对照组 0.0196 ± 0.0072 0.0235 ± 0.0046 0.0276 ± 0.0079 *P < 0.05。
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