The Effect of HIF-1α on Invasion and Metastasis of Gallbladder Cancer by Regulating the Epithelial-Mesenchymal Transformation
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摘要:
目的 探讨HIF-1α对胆囊癌细胞迁移侵袭的影响及其相关调控机制。 方法 构建GBC-SD细胞，使用慢病毒转染，分别得到实验组（HIF-1α shRNA）、阴性对照组（空载慢病毒转染）和空白对照组（未处理）。蛋白质免疫印迹法检测E-Cadherin、N-Cadherin蛋白的表达水平，GBC-SD细胞的迁移能力用细胞划痕实验检测，GBC-SD细胞的侵袭能力用Transwell 侵袭实验检测。 结果 与对照组相比，实验组E-Cadherin蛋白的表达水平明显升高（P < 0.001），N-Cadherin蛋白的表达水平明显降低（P < 0.001），对照组之间E-Cadherin、N-Cadherin蛋白的表达水平无明显差异（P > 0.05）。实验组细胞划痕愈合度较对照组低（P < 0.001）、穿模个数较对照组少（P < 0.001），而对照组之间细胞划痕愈合度、穿模个数无明显差异（P > 0.05）。 结论 靶向敲低HIF-1α可以降低GBC-SD细胞的迁移侵袭能力，其作用机制可能与调控上皮-间充质转化有关。 Abstract:Objective To explore the effect of HIF-1α on the migration and invasion of gallbladder cancer cells and its related regulatory mechanism. Methods GBC-SD cells were constructed and transfected with lentivirus, and the experimental group （HIF-1α shRNA）, negative control group （empty lentivirus transfection） and blank control group （untreated） were obtained respectively. The expression levels of E-Cadherin, and N-Cadherin proteins were detected by Western blotting assay, Cell scratch assay was ued to detect the migratory ability of GBC-SD cells, and Transwell invasion assay was uesd to detect the invasive ability of GBC-SD cells. Results Compared with the control group, the expression level of E-Cadherin protein in the experimental group was significantly increased （P < 0.001）, while the expression level of N-Cadherin protein was significantly decreased （P < 0.001）, and there was no remarkable difference in the expression level of E-Cadherin and N-Cadherin proteins between the control groups （P both>0.05）. In the experimental group, the cell scratch healing degree was inferior to the control group （P < 0.001） , and the number of penetrating molds was also inferior to the control group （P < 0.001）, while there was no obvious otherness in the cell scratch healing degree and the number of penetrating molds between the control groups （P > 0.05）. Conclusion Targeted knockdown of HIF-1α can reduce the migration and invasion ability of gallbladder cancer cells, and its mechanism of action may be related to the regulation of epithelial mesenchymal transition. -
砷是自然界分布非常广泛的一种非金属元素，其化合物可导致心血管疾病、糖尿病、癌症等多种疾病发病率增加[1-4]。无机砷（iAs）进入人体之后被人体代谢主要生成一甲基胂酸（monomethylarsenic acid，MMA）和二甲基胂酸（dimethylarsenic acid，DMA），代谢产物主要通过尿液排出，因此尿中的砷化物常常作为砷暴露的标志物，不同代谢产物所占的比例常常用来反映个体对砷的代谢能力，发现砷代谢的能力和砷暴露导致的疾病密切相关，无机砷容易代谢为一甲基胂酸，但一甲胂酸转化为二甲基胂酸受阻的群体砷暴露后DNA损伤更高，以及砷相关疾病的发病率更高[5-7]。
EGFR编码一种跨膜糖蛋白是蛋白激酶超家族的成员，该蛋白二聚化和酪氨酸自磷酸化，从而导致细胞增殖[8]。PTEN被鉴定为一种肿瘤抑制因子[9]。Kras编码一种小GTPase超家族成员的蛋白质[10]。PIK3CA基因编码的蛋白质是作为催化磷脂酰肌醇3-激酶一个亚基而发挥功能[11]。4个基因在癌症的发生、发展中均起重要作用，在多种肿瘤组织中就发现它们存在较高频率的突变[8-11]。
砷暴露会导致基因损伤从而导致基因突变，而上述的4个基因肿瘤中均存在突变，因此砷作为一种重要的环境致癌物，是否会导致EGFR、PTEN、Kras、PIK3CA 4个基因DNA损伤值得探讨，因此本研究探索了砒霜厂职业砷暴露工人EGFR、PTEN、Kras、PIK3CA 4个基因DNA损伤与尿砷及其代谢的关系。
1. 资料与方法
1.1 研究人群
本调查研究采用病例对照研究方式。砷暴露工人来自砒霜厂。砒霜厂主要生产纯度为99%的三氧化二砷（As2O3），因此职业暴露较为单纯。对照组的人群来源于居住在距离工厂约10～50 km的村庄的农民，没有职业砷暴露史，3个月内没有其他明显的砷暴露途径。所有受试者的生活和经济条件相似，且与周围神经系统的退行性疾病和癌症无关。访谈结束后，研究人员收集了劳动工人的流行病学资料、血样、尿样。血液样本通过EDTA管采集，尿液样本通过塑料瓶采集。样本采集过程参照文献[12]。本研究通过昆明医科大学伦理委员会批准（批号KMMU2020MEC000）。
1.2 尿中砷化物浓度检测
检测尿液样本中3种砷（DMA、iAs和MMA）的水平。本检测方法的最小阈值是2 μg。采用尿肌酐试剂盒（jaffe法）检测尿肌酐。计算DMA、iAs和MMA与总砷（tAs）的比值（DMA%、MMA%和iAs%）。通过SMI、DMA%、MMA%和iAs%评估砷甲基化的效率[12]。
1.3 DNA损伤评估
裂解外周血细胞并纯化基因组DNA。根据文卫华等[12-13]的实验方案，Q-PCR用于评估基因DNA损伤。预变性时间为10 min，其他PCR条件根据LC®96荧光定量系统的默认设置进行。在本实验方案中使用了以下寡核苷酸序列。Kras上游：GGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAA，下游：AAAGAATGGTCCTGCACCAGTA； EGFR上游： CAACAGCACATTCGACAGCC，下游： GCATTTTCAGCTGTGGAGCC；PTEN 上游：AGACCATAACCCACCACAGC，下游： CACCAGTTCGTCCCTTTCCA；PIK3CA上游：GCTCAAAGCAATTTCTACACGAGA，下游： TCCATTTTAGCACTTACCTGTGAC；β-actin上游： CGGGAAATCGTGCGTGACAT， 下游：GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG。-ΔCt值用于评估基因的损伤水平。
1.4 统计学处理
经检验尿砷及其代谢产物、甲基化指数均不符合正态分布，数据表示为M（P25，P75）。将各数据进行对数转换，对数转换后数据服从正态分布，数据表示为
$\bar x \pm s $ ，以此开展分析。通过Pearson相关分析DNA损伤与尿液砷含量的相关性。对照组和暴露组之间采用Student’t检验。所有统计均使用R3.4.1软件包进行。检验水准为α = 0.05。2. 结果
2.1 一般情况
暴露组和对照组工人年龄、吸烟率、饮酒率的分布差异无统计学意义（P > 0.05）。而尿中iAs、MMA、DMA、MMA%、DMA%和 SMI在2组中差异具有统计学意义（P < 0.05），见表1。
表 1 受试人群的一般特征和尿砷水平（$ \bar{x} \pm s $ ）Table 1. General characteristics and urinary arsenic levels of the test population （$ \bar{x} \pm s $ ）变量 对照组（n = 24） 暴露组（n = 78） t P 年龄（岁） 35.814 ± 3.241 36.531 ± 5.972 / / 吸烟（是/否） 14/10 46/32 / / 饮酒 （是/否） 11/13 38/40 / / iAs 0.439 ± 0.185 2.023 ± 0.464 16.291 < 0.001* MMA 0.379 ± 0.153 2.141 ± 0.489 17.355 < 0.001* DMA 1.124 ± 0.304 2.660 ± 0.516 13.824 < 0.001* iAs% 13.763 ± 11.392 17.457 ± 12.409 1.299 0.197 MMA% 8.531 ± 2.322 19.150 ± 5.071 9.921 < 0.001* DMA% 77.712 ± 12.001 63.393 ± 12.291 −5.019 < 0.001* PMI 1.166 ± 1.290 1.614 ± 1.289 1.488 0.140 SMI 10.010 ± 3.777 3.763 ± 2.126 −10.291 < 0.001* *P < 0.05。 2.2 暴露组与对照组基因损伤的比较
暴露组工人EGFR、PTEN、Kras、PIK3CA 4个基因DNA损伤高于对照组，4个基因的平均损伤也高于对照组（P < 0.05），见表2。
表 2 受试人群的4个基因的损伤和平均损伤的比较（$ \bar{x} \pm s $ ）Table 2. Comparison of damage and average damage of 4 genes in the test population （$ \bar{x} \pm s $ ）变量 对照组
（n = 24）暴露组
（n = 78）损伤变化 t P EGFR 2.299 ± 0.118 2.514 ± 0.047 0.215 2.024 0.046* PTEN 2.432 ± 0.078 2.791 ± 0.065 0.359 2.884 0.005* Kras 2.468 ± 0.124 2.818 ± 0.060 0.350 2.718 0.008* PIK3CA 2.852 ± 0.061 3.225 ± 0.038 0.373 4.856 < 0.001* 平均损伤 2.512 ± 0.075 2.837 ± 0.036 0.325 4.181 < 0.001* *P < 0.05。 2.3 尿中代谢产物含量与基因损伤的关系
分析EGFR、PTEN、Kras、PIK3CA 4个基因DNA损伤与尿中代谢产物含量关系，发现PTEN损伤与尿中iAs和MMA含量呈正相关，Kras与尿中MMA含量呈正相关，PIK3CA和平均损伤与尿中iAs、MMA和DMA含量均呈正相关，且差异具有统计学意义（P < 0.05），见表3。
表 3 3种砷化物含量与所有受试者基因DNA损伤水平的相关性Table 3. Correlation between the levels of three arsenicals and the levels of genetic DNA damage in all subjectsDNA 损伤 iAs MMA DMA r P r P r P EGFR 0.160 0.109 0.157 0.116 0.112 0.263 PTEN 0.235 0.018* 0.237 0.016* 0.185 0.063 Kras 0.182 0.068 0.200 0.044* 0.137 0.170 PIK3CA 0.324 0.001* 0.319 0.001* 0.269 0.006* 平均损伤 0.296 0.003* 0.302 0.002* 0.230 0.020* 数据分析采用皮尔逊相关法，*P < 0.05。 2.4 尿中代谢产物含量与基因损伤的关系
分析EGFR、PTEN、Kras、PIK3CA 4个基因DNA损伤与尿中代谢产物百分比关系，发现iAs%与基因损伤不存在相关关系（P > 0.05），MMA%与4个基因DNA损伤和平均损伤均存在正相关，且差异具有统计学意义（P < 0.05），DMA%与Kras、PIK3CA、平均损伤存在负相关，且差异具有统计学意义（P < 0.05），见表4。
表 4 3种砷化物尿中的百分比与所有受试者基因DNA损伤水平的相关性Table 4. 3 Correlation between percentages of arsenic compounds in urine and levels of genetic DNA damage in all subjectsDNA损伤 iAs% MMA% DMA% r P r P r P EGFR 0.086 0.388 0.249 0.012* −0.177 0.076 PTEN 0.059 0.554 0.319 0.001* −0.185 0.063 Kras 0.110 0.269 0.354 < 0.001* −0.241 0.015* PIK3CA 0.121 0.224 0.329 0.0001* −0.240 0.015* 平均损伤 0.125 0.210 0.427 < 0.001* −0.285 0.004* 数据分析采用皮尔逊相关法，*P < 0.05。 将样本按照二级甲基化指数的中位数分为2组，发现Kras、PIK3CA、平均损伤在高SMI组中较低（P < 0.05），见表5。
表 5 所有受试者按SMI水平分层的DNA损伤比较（$ x \pm s $ ）Table 5. Comparison of DNA damage stratified at SMI level for all subjects （$\bar x \pm s $ ）变量 低SMI（n = 51） 高SMI（n = 51） t P SMI[中位数（范围）] 2.654 （1.064-3.800） 7.444 （3.848-21.840） / / EGFR 2.550 ± 0.065 2.377 ± 0.063 1.914 0.059 PTEN 2.811 ± 0.083 2.602 ± 0.070 1.932 0.056 Kras 2.874 ± 0.081 2.596 ± 0.074 2.537 0.013* PIK3CA 3.252 ± 0.055 3.022 ± 0.042 3.345 0.001* 平均损伤 2.872 ± 0.049 2.649 ± 0.047 3.282 0.001* *P < 0.05。 3. 讨论
砷暴露可以导致肺癌、膀胱癌等多种疾病发生率显著提高，因为砷进入人体可以产生多重的效应[4, 14]，其中导致DNA损伤是重要的效应之一[12-13]，DNA损伤可能导致基因突变最终导致细胞癌变[1-3]。有文献采用彗星实验和微核试验的方法研究砷暴露对DNA和染色体的损伤[15-16]，发现砷暴露导致了损伤的增强[17]。文卫华等[12-13]利用PCR的检测方法发现砷暴露导致p53基因DNA的损伤增加，笔者的研究证实砷暴露会增加EGFR、PTEN、Kras、PIK3CA 4个基因DNA损伤，结果是一致的，也再次证实砷对与癌变相关基因的影响。
之前研究显示无机砷容易代谢为一甲基胂酸，但一甲胂酸转化为二甲基胂酸受阻的群体，其DNA损伤更为严重[12-13]，基因表达变化更显著[12-13]，而且砷相关疾病的发病率更高[5-7]。高SMI和DMA百分比较高均表示对砷代谢能力强，笔者的结果显示高SMI的群体DNA损伤较低，DMA百分比与DNA损伤呈负相关，与文献一致，结合文献说明代谢能力强的个体砷的有害效应较低[5-7, 18]，对健康影响相对小。
综上所述砷暴露和代谢能力影响了EGFR、PTEN、Kras、PIK3CA 4个基因DNA损伤，可能是砷致癌机制之一。
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图 1 各组GBC-SD细胞E-Cadherin、N-Cadherin蛋白的表达水平
A：各组E-Cadherin和N-Cadherin蛋白表达电泳图；B：E-Cadherin蛋白表达分析；C:N-Cadherin蛋白表达分析；ns为P > 0.05，***P < 0.001。
Figure 1. Expression levels of E-Cadherin and N-Cadherin proteins in GBC-SD cells of each group
图 2 各组GBC-SD细胞的迁移能力
A：24 h、48 h后3组细胞划痕愈合情况（×40）；B：24 h、48 h后3组细胞划痕愈合率；ns为P > 0.05，***P < 0.001。
Figure 2. Migratory capacity of GBC-SD cells in each group
图 3 各组GBC-SD细胞的侵袭能力
A：结晶紫染色后3组细胞穿模情况（×100）；B：3组细胞穿模个数；ns 为P > 0.05，***P < 0.001。
Figure 3. Assay of invasive ability of each group of GBC-SD cells
表 1 抗体信息
Table 1. Antibody information
抗体名称 厂家 货号 稀释浓度 种属 GAPDH PROTEINTECH 10068-1-AP 1∶5000 Mouse HIF1α Affinity Biosciences AF1009 1∶5000 Rabbit E-Cadherin Affinity Biosciences AF0131 1∶5000 Rabbit N-cadherin Affinity Biosciences AF5239 1∶5000 Rabbit Anti-Rabbit IgG （H+L） Antibody，Peroxidase-Labeled KPL 074-1506 1∶5000 Anti-Mouse IgA + IgG + IgM （H+L） Antibody，Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled KPL 074-1807 1∶5000 
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表 2 各组细胞愈合度和穿模细胞数（$ \bar x \pm s$）
Table 2. Cell healing degree and number of perforated cells in each group （$ \bar x \pm s $）
组别 48 h划痕愈合度（%） 穿模细胞数（个） Control组 69.96$ \pm $0.47 215.00$ \pm $2.94 sh-NC组 69.25$ \pm $0.86 215.33$ \pm $2.05 sh-HIF1α组 44.51$ \pm $0.93ab 121.67$ \pm $1.69ab χ2/F 18.00 1108.18 P <0.001* <0.001* 与sh-NC组比较，aP < 0.001；与Control组比较，bP < 0.001；*P < 0.05。
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