Expression and Clinical Significance of ROR1 in Different Histologic Types of Invasive Lung Adenocarcinoma
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摘要:
目的 研究受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（receptor tyrosine kinase-like orphan rectetpor 1，ROR1）在不同组织学分级的浸润性肺腺癌中的表达情况，分析其与肺腺癌病理组织学分级的关系；探讨其是否可作为浸润性肺腺癌诊断评估的潜在指标。 方法 收集浸润性肺腺癌石蜡包埋组织标本290例，行HE染色切片后进行组织学分级，通过免疫组化染色，使用半定量法判读ROR1表达水平，统计分析ROR1表达与浸润性肺腺癌分级的关系。 结果 ROR1高表达于低分化的浸润性肺腺癌（P < 0.001）；低分化组的浸润性肺腺癌中Ki-67指数明显高于高、中分化组（P < 0.001）；Ki-67指数在ROR1高表达组高于低表达组（P < 0.01）。 结论 ROR1在不同分级的肺腺癌中表达水平存在明显差异，其表达水平与浸润性肺腺癌的分化程度及恶性程度密切相关，这使得它有可能成为新的肺腺癌诊断生物标志物并辅助肺腺癌的临床特征和预后的评估，为患者制定个性化治疗策略提供科学依据。 Abstract:Objective To investigate the expression of receptor tyrosine kinase-like orphan rectetpor 1 （ROR1） in invasive lung adenocarcinoma with different histological grades, and to analyze its relationship with histopathological grade of lung adenocarcinoma so as to explore whether it can be used as a potential indicator for the diagnostic evaluation of invasive lung adenocarcinoma. Methods A total of 290 paraffin-embedded tissue specimens of invasive lung adenocarcinoma were collected, and the relationship between ROR1 expression and invasive lung adenocarcinoma grade was statistically analyzed by HE staining sections. Results ROR1 was significantly highly expressed in the poorly differentiated invasive lung adenocarcinoma （P < 0.001）, the Ki-67 index in the low-differentiated group was significantly higher than that in the high-differentiation and medium-differentiated groups（P < 0.001）, and the Ki-67 index was higher in the high-expression group than in the low-expression group （P < 0.01）. Conclusion There are significant differences in the expression levels of ROR1 in different grades of lung adenocarcinoma, and its expression level is closely related to the degree of differentiation and malignancy of invasive lung adenocarcinoma, which makes it possible to become a new biomarker for the diagnosis of lung adenocarcinoma and assist in the evaluation of clinical features and prognosis of lung adenocarcinoma, and provide a scientific basis to formulate personalized treatment strategies for patients. -
Key words:
- Lung adenocarcinoma /
- ROR1 /
- Ki-67 /
- Pathological grading /
- Immunohistochemistry
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近年来，肺癌已成为全世界范围内最普遍的恶性肿瘤之一。据2018年统计数据显示，肺癌发病人数占癌症发病总数的11.5%，而肺癌导致的死亡人数占癌症死亡总数的18.3%[1]。肺癌的病理学类型主要包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌约占原发性肺癌的80%[2]。非小细胞肺癌以鳞状细胞癌和腺癌为主[3]，其中肺腺癌约占肺癌的40%，且发病率呈现出逐年递增的趋势[4]。肺腺癌的发生、发展、侵袭、转移是一个十分复杂的病理生理学过程，受多种基因及其表达产物的调控，且缺乏早期特异性临床表现。随着诊疗方法的发展，肺腺癌的早期诊断和治疗取得了很多成就，但由于术后复发、转移等多种因素影响，患者5 a生存率仍低于18%[5]。为了提高患者的生存率及预后，早期诊断、精准治疗是关键。目前除了病理组织学诊断外，还有研究发现了部分特异性的生物学标记物来协助诊断肺腺癌，例如：癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、细胞角蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment，Cyfra 21-1）、血浆激肽释放酶B1（plasma kallikrein B1，KLKB1）等，但由于其特异性及敏感性不高，不能完全满足临床诊断的需要，对患者肺腺癌组织学分型及预后判断价值有限[6]。因此，当前的研究热点在于寻找具有显著临床病理诊断价值以及在辅助预后判断方面起重要作用的生物标志物。
受体酪氨酸激酶样孤儿受体1 （receptor tyrosine kinase-like orphan rectetpor 1，ROR1）是Ⅰ型受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）家族中的一类跨膜蛋白，由ROR1基因编码，ROR1包含胞外免疫球蛋白样（Ig样）、Frizzled和Kringle结构域，以及跨膜结构域和胞内酪氨酸激酶结构域[7−8]。ROR1基因在不同发育阶段的组织中表达水平不同，且在胚胎发育过程中起着重要作用，表达水平较高[9−10]；在成人正常组织中表达水平低[11]。目前研究发现，ROR1受体具有调节细胞代谢、增殖、凋亡、分化、迁移、转移等功能，还参与细胞之间信号交流和胞内信号转导的过程[12]。ROR1在血液系统恶性肿瘤、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中都有较高的表达[13]。研究发现，通过上调ROR1基因的表达会增强乳腺癌组织的转移能力[14]，而下调ROR1基因的表达可抑制癌细胞的侵袭、转移及成瘤能力[15]。近年来国内外的研究发现，ROR1的表达水平与肿瘤细胞的恶性程度和侵袭行为存在密切联系[16]。因此ROR1有望成为浸润性肺腺癌的生物标志物，并作为肿瘤诊断与治疗的潜在靶点。
细胞核增殖抗原（Ki-67）是1种与细胞增殖密切相关的核蛋白，可以用于评估特定细胞群的增殖率。Ki-67的阳性表达与恶性肿瘤的恶性程度、侵袭能力、转移以及患者预后的生存率密切相关。同时，它还与肿瘤的发生和发展有紧密的联系[17]。许丽莉等[18]对118例Ⅰ期肺腺癌患者进行回顾性调查，生存分析显示Ki-67指数与患者术后5 a无病生存期（disease-free survival，DFS）和总生存期（overall survival，OS）呈现出负相关。因此通过测定肺腺癌组织中的Ki-67指数可预估肺腺癌的恶性程度与侵袭力，并对肺腺癌的预后进行合理的推测。
1. 材料与方法
1.1 临床资料
本研究材料为昆明医科大学第一附属医院病理科自2019年6月至2021年6月所收集的肺腺癌石蜡包埋组织标本，共计290例。其中男性112例（38.6%），女性178例（61.4%），年龄在30～82岁之间，中位年龄为56岁。所有研究标均为术前未接受过放疗或化疗的病理明确诊断为浸润性肺腺癌病例，同时排除原位癌、微浸润性肺腺癌、浸润性粘液腺癌等病例。通过复习病理切片，按2021年出版的《WHO胸部肿瘤分类（第5版）》中浸润性非黏液性肺腺癌的国际肺癌研究学会（international association for the study of lung cancer，IASLC）分级系统为标准，将浸润性肺腺癌分为高分化、中分化、低分化3个等级[19]。本研究已通过昆明医科大学第一附属医院伦理委员会批准[伦理批号：（2021）伦理L第112号]。
1.2 实验方法
实验标本均经中性福尔马林固定，并进一步进行石蜡包埋处理；切片后，经HE及EnVision两步法免疫组化染色（IHC）。其中ROR1蛋白一抗购自美国Thermo Fisher公司；二抗购自迈新生物技术公司；阴性对照采用磷酸缓冲盐溶液（PBS）代替一抗。
1.3 结果判断
1.3.1 组织学分级与与分组
由2位经验丰富的病理医师重新审阅所有肺腺癌HE切片，根据2021年《WHO胸部肿瘤分类（第5版）》中IASLC新分级系统重新分级如下：（1）高分化组，以附壁亚型为主且高级别成分<20%；（2）中分化组，以腺泡、乳头或微乳头亚型为主且高级别成分<20%；（3）低分化组，包括任意1种或多种亚型且高级别成分≥20%。这里的高级别成分指的是实性型、微乳头型、筛状型或具有复杂腺体形态（融合腺体及促间质增生性的单个浸润肿瘤细胞）的成分[19]，见图1。
图 1 浸润性肺腺癌组织学分级（HE×200）A：高分化；B：中分化；C：低分化。Figure 1. Histological grading of invasive lung adenocarcinoma （HE×200）1.3.2 免疫组化结果判断
ROR1蛋白阳性染色位于细胞质和细胞膜上（通过对比背景的非特异着色来评判染色强度）。采用半定量积分法来评估染色结果[20]，方法如下：（1）根据多数细胞呈现的染色特性来对染色强度进行评分：未着色计为0分，浅黄色（弱阳性）计为1分，棕黄色（中阳性）计为2分，棕褐色（强阳性）计为3分。见图2；（2）对阳性肿瘤细胞的百分比进行计算，并进行评分：当阳性肿瘤细胞百分比为0%～5%时计为0分，当阳性肿瘤细胞百分比为6%～25%时计为1分，当阳性肿瘤细胞百分比为26%～50%时计为2分，当阳性肿瘤细胞百分比为51%～75%时计为3分，当阳性肿瘤细胞百分比为大于75%时计为4分。2者结果相乘计为最终得分，得分大于等于4分判定为高表达，得分小于4分则判定为低表达。
图 2 ROR1在不同组织学分级肺腺癌中的强度（IHC×200）A：弱阳性；B：中阳性；C：强阳性。Figure 2. The intensity of ROR1 in different histologically graded lung adenocarcinoma （IHC×200）1.4 统计学处理
使用SPSS 26.0统计软件，通过χ2检验和线性相关分析的统计方法，对所收集的研究数据进行统计分析。分别比较ROR1在不同肺腺癌病理分级中的表达水平，不同分级肺腺癌Ki-67指数的差异以及ROR1的表达与Ki-67指数的关系。P < 0.05表示差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 ROR1在不同分级肺腺癌中的表达
通过对290例不同分级的浸润性肺腺癌组织的临床标本进行免疫组织化学染色，结果显示ROR1在不同分级的浸润性肺腺癌中均有表达。统计分析表达情况发现：ROR1在高分化组、中分化组、低分化组中的高表达所占的比率分别为30.61%、77.22%、95.08%（P < 0.001）。表明ROR1高表达于低分化的浸润性肺腺癌且ROR1的高表达所占的比率随浸润性肺腺癌分化程度的降低而升高，见表1。
表 1 ROR1在不同分级肺腺癌中的表达[n（%）]Table 1. Expression of ROR1 in different grades of lung adenocarcinoma[n（%）]肺腺癌病理分级 n ROR1 χ2 P 高表达 低表达 高分化 49 15（30.61） 34（69.39）
61.534
<0.001*中分化 180 139（77.22） 41（22.88） 低分化 61 58（95.08） 3（4.92） *P < 0.05。 2.2 不同分级肺腺癌中Ki-67指数的差异
采用免疫组化法检测290例不同分级浸润性肺腺癌组织细胞的Ki-67指数发现：在高分化组、中分化组、低分化组中Ki-67指数分别为4.78%、11.68%、38.85% （P < 0.001）。表明低分化的浸润性肺腺癌细胞增殖（Ki-67）指数高，提示肿瘤细胞具有更高的增殖活性；同时浸润性肺腺癌的分化程度与Ki-67指数呈负相关，见表2。
表 2 肺腺癌不同组织学分级与Ki-67指数相关性Table 2. Ki-67 index of lung adenocarcinoma with different histological grades肺腺癌病理分级 n Ki-67指数 r P 高分化 49 4.78 −0.750 <0.001* 中分化 180 11.68 低分化 61 38.85 *P < 0.05。 2.3 ROR1的表达与Ki-67指数的关系
采用免疫组化法检测290例浸润性肺腺癌组织细胞的Ki-67指数发现：Ki-67指数在ROR1高表达组、低表达组中分别为19.88%、6.32%（P < 0.01）。表明浸润性肺腺癌组织细胞中ROR1高表达，其Ki-67指数高，提示ROR1高表达的肿瘤细胞具有更高的增殖活性且ROR1的表达程度和Ki-67指数呈负相关，见表3。
表 3 ROR1表达程度与Ki-67指数的相关性Table 3. Relationship between ROR1 expression degree and Ki-67 indexROR1 n Ki-67指数 r P 高表达 212 19.88 −0.527 0.001* 低表达 78 6.32 *P < 0.05。 3. 讨论
本研究在290例浸润性肺腺癌患者中进行了观察和检测，并获得了相应的结果。ROR1高表达的肺腺癌组织分化程度低，Ki-67指数高。因此推断ROR1的表达水平可以辅助判断肺腺癌组织的分化及恶性程度，帮助临床判断预后。
ROR1在肺腺癌的发生发展中起着关键作用，其高表达可以促进肺腺癌的发展。然而，目前关于ROR1在肺腺癌中发挥作用的病理生理学机制仍未完全明了。根据现有相关文献报道，潜在机制可能主要有以下几方面：（1）ROR1在维持PI3K-AKT介导的促存活信号和促凋亡p38通路之间的有利平衡中起着至关重要的作用，其高表达会破坏这种平衡。ROR1维持这种平衡的机制可能为通过ROR1激酶依赖的c-Src激活并独立维持激酶活性EGFR-ERBB3结合，ERBB3磷酸化相应的PI3K激活，最终导致肿瘤细胞中EGFR过表达[21]。在肺腺癌的发生发展中，EGFR起到了关键作用。并且EGFR在肿瘤发生时的突变与高表达还与肿瘤性新生血管生成、肿瘤的侵袭与转移、放化疗抗性、预后等密切相关[22]。综上推测ROR1在肺腺癌中的高表达会促进EGFR过表达从而加速肺腺癌的侵袭和转移，加重肺腺癌的病程；（2）通过siROR1参与调控AKT/mTOR信号通路关键信号分子的活性使人肺腺癌细胞株的迁移和侵袭能力受到一定程度的抑制[23]。刘艳春等[24]研究PI3K/AKT/mTOR信号通路来解释ROR1介导的肺腺癌生存信号时，发现ROR1沉默降低了AKT和mTOR的磷酸化；siROR1处理还显著降低了PTEN的磷酸化，PTEN是PI3K / AKT信号通路的负调节因子。从而推测AKT / mTOR信号通路可能是ROR1介导的生存信号在肺腺癌中发生的方式之一。肺腺癌中ROR1的高表达则促进了AKT/mTOR的磷酸化进而加强了肺腺癌细胞株的迁移和侵袭能力，导致肺腺癌的恶化程度变高；（3）ROR1-AS1通过诱导上皮－间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）促进肺腺癌的发生。EMT是1种细胞转变的过程，它使得原本连接在一起的上皮细胞不再保持连接并丧失其细胞定位，而获得了类似间质细胞的特征。由于EMT的发生，肿瘤细胞极性丧失，粘附性下降，迁移能力增强[14]。徐南等[25]将针对ROR1-AS1的shRNA转染到A549人肺腺癌细胞系中后发现在肺腺癌细胞中敲低ROR1-AS1后，迁移和侵入的细胞明显减少；且肺腺癌细胞中N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达下调，E-钙粘蛋白上调，抑制了肺腺癌细胞的EMT过程。这表明ROR1-AS1可通过诱导EMT过程增强肺腺癌细胞的迁移和侵袭。此外，多项关于癌症的研究表明，ROR1高表达具有促进肿瘤细胞EMT的发生[14，23，26]。
综上所述，ROR1高表达的浸润性肺腺癌分化程度差，且此类分化差的肺腺癌Ki-67指数高，提示肿瘤细胞的增殖活性强，恶性程度高。因此在确定浸润性肺腺癌的组织学分级方面，ROR1具有较高价值，ROR1有望成为临床诊断浸润性肺腺癌的重要生物学指标。通过检测ROR1的表达水平，能够辅助判断浸润性肺腺癌组织的分化程度和恶性程度，从而在临床上制定个性化的诊疗方案，为患者提供治疗指导，同时为术后治疗方案提供参考，以改善肺腺癌患者的预后。但ROR1在低分化浸润性肺腺癌中高表达这一现象的病理生理学机制仍需进行更深入的研究。
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图 1 浸润性肺腺癌组织学分级（HE×200）
A：高分化；B：中分化；C：低分化。
Figure 1. Histological grading of invasive lung adenocarcinoma （HE×200）
图 2 ROR1在不同组织学分级肺腺癌中的强度（IHC×200）
A：弱阳性；B：中阳性；C：强阳性。
Figure 2. The intensity of ROR1 in different histologically graded lung adenocarcinoma （IHC×200）
表 1 ROR1在不同分级肺腺癌中的表达[n（%）]
Table 1. Expression of ROR1 in different grades of lung adenocarcinoma[n（%）]
肺腺癌病理分级 n ROR1 χ2 P 高表达 低表达 高分化 49 15（30.61） 34（69.39）
61.534
<0.001*中分化 180 139（77.22） 41（22.88） 低分化 61 58（95.08） 3（4.92） *P < 0.05。 
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表 2 肺腺癌不同组织学分级与Ki-67指数相关性
Table 2. Ki-67 index of lung adenocarcinoma with different histological grades
肺腺癌病理分级 n Ki-67指数 r P 高分化 49 4.78 −0.750 <0.001* 中分化 180 11.68 低分化 61 38.85 *P < 0.05。
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表 3 ROR1表达程度与Ki-67指数的相关性
Table 3. Relationship between ROR1 expression degree and Ki-67 index
ROR1 n Ki-67指数 r P 高表达 212 19.88 −0.527 0.001* 低表达 78 6.32 *P < 0.05。
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