The Application of Prognostic Model of Lysosomal Related Genes in Bladder Cancer
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摘要:
目的 探索基于溶酶体相关基因的预后模型在膀胱癌患者中应用的可行性。 方法 通过下载癌症基因组图谱（the cancer genome atlas program，TCGA）数据库中膀胱癌数据和基因表达综合数据库（gene expression omnibus，GEO）中GSE13507数据集。利于R语言通过差异分析、单因素比例风险模型（COX）回归分析筛选出TCGA数据库中与膀胱癌生存相关的差异表达的溶酶体相关基因，采用最小绝对值收敛和选择算子算法（Lasso）回归模型构建出预后模型。根据构建模型风险评分的中位值划分出高、低风险组。使用生存分析比较高、低风险2组患者的生存差异并在GEO数据集中进行验证。采用单因素及多因素Cox回归分析验证风险评分是否为影响膀胱癌患者预后的独立危险因素。受试者工作特征曲线用于评估预后模型预测的准确性。GO及KEGG富集分析用于探索高、低风险组差异基因的生物学功能及信号通路。免疫分析用于探索高、低风险组免疫功能差异。 结果 共筛选出44个差异表达的溶酶体相关基因，其中9个与预后相关基因用于预后模型构建，生存分析显示低风险组预后明显优于高风险组（P < 0.05），并在GEO数据库中得到验证。构建模型预测膀胱癌患者1 a、3 a、5 a生存的ROC曲线下面积（area under the curve，AUC）分别为0.696、0.717、0.738。独立预后分析提示构建模型为膀胱癌患者独立预后影响因素；GO富集分析提示高、低风险组差异基因主要参与细胞结构功能相关；KEGG富集分析提示差异基因主要富集于PI3K-Akt信号通路。免疫分析提示2组患者免疫细胞浸润情况及免疫功能具有明显差异（P < 0.05）。 结论 膀胱癌溶酶体相关基因风险模型能准确有效地预测膀胱癌患者预后。 Abstract:Objective To explore the feasibility of applying the prognosis model based on lysosomal related genes（LRGs） in patients with bladder cancer （BC）. Methods Bladder cancer data were downloaded from The Cancer Genome Atlas （TCGA） program and dataset of GSE13507 were downloaded from Gene Expression Omnibus （GEO）. Differentially expressed LRGs related to the survival of BC in the TCGA database were screened by differential analysis and single factor proportional hazards model （COX） regression analysis via R software. LASSO regression was used to construct a prognostic risk model. BC patients were divided into the high and low risk groups according to the median risk score. Survival analysis were used to compare the survival differences between the high-risk and low-risk groups of BC patients, and validate in GEO database. Univariate and multivariate cox regression analysis were used to verify whether the risk scores were an independent risk factor affecting the prognosis of BC patients. The receiver operating characteristic （ROC） curve was used to evaluate the accuracy of prognostic model predictions. GO and KEGG enrichment analysis were used to explore the biological functions and signaling pathways of differentially expressed genes between the high-risk and low-risk groups. Immunoassay was used to explore the differences in immune function between the high-risk and low-risk groups. Results A total of 44 differentially expressed lysosomal related genes were screened, of which 9 genes related to the prognosis were used to construct the prognosis model in this study. Survival analysis showed that the prognosis of the low-risk group was significantly better than that of the high-risk group （P < 0.05）, which was verified in GEO database. The area under the ROC curve （AUC） of the BC prognosis risk scoring model to predict the 1-, 3- and 5-year survival of patients were 0.696, 0.717 and 0.738, respectively. Independent prognostic analysis showed that this prognostic risk model was an independent prognostic factor for BC patients. GO enrichment analysis indicated that the differential genes between the high-risk and low-risk groups were mainly involved in cell structure and function correlation. KEGG enrichment analysis suggested that the differential genes were mainly enriched in PI3K-Akt signaling pathway. Immunological analysis showed that there were significant differences in immune cell infiltration and immune function between the two groups. Conclusion Risk model of lysosomal related genes in BC can accurately and effectively predict the prognosis of BC patients. -
Key words:
- Bladder cancer /
- Lysosomal related genes /
- Prognostic model /
- Bioinformatics
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慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的一种持续性炎症疾病[1- 2]。据2019年统计，我国约有
2335 万名HBV感染者，占全球感染者的29.0%，男女患者比例接近3∶2，20%～30%的CHB患者可能随时间发展为肝硬化、肝细胞癌或肝衰竭，对全球公共卫生构成严重威胁[3]。目前，治疗CHB的药物主要包括聚乙二醇干扰素α（interferon alfa，Peg-IFN-α）和核苷（酸）类似物（nucleos（t）ide analogues，NAs），如恩替卡韦（entecavir，ETV）、富马酸替诺福韦二吡酯（tenofovir disoproxil fumarate，TDF）和艾米替诺福韦（tenofovir amibufenamide，TMF）[4−5]。这些药物是通过HBV逆转录酶嵌入到病毒DNA中，导致DNA链终止从而抑制HBV复制的药物，是治疗HBV感染的核心药物[6−8]。TMF是替诺福韦（Tenofovir，TFV）的一种新型磷酸化前药，其生物利用度在三种TFV的前药（TDF、TAF和TMF）中最高[9]。TMF进入肝细胞后被组织蛋白酶A和羧酸酯酶1水解生成TFV，然后磷酸化生成TFV-DP，对HBV复制起到关键抑制作用[10]。TMF在肝脏中选择性激活，提高TFV-DP在肝脏中浓度，降低其血清和肾脏浓度，减少了对肾脏等其他组织的损伤，从而提高了疗效和安全性[11−12]。然而，随着用药群体的扩大和用药时间的延长，NAs的耐药性问题日益严重[13−14]。Peg-IFN-α是一种免疫调节剂，Peg-IFN-α包括Peg-IFN-α-2a和Peg-IFN-α-2b，能够减少共价闭合环状DNA（cccDNA）的存在，直接激活患者的免疫系统，效果显著，是已获批准的治疗HBV感染的药物之一，且与NAs之间也没有药代动力学相互作用[15−16]。研究[16]表明，与ETV和TDF单药治疗相比，联用Peg-IFN-α可提高HBeAg血清转化率。此外，阿德福韦酯（adefovir dipivoxil，ADV）在治疗HBV阴性患者方面，与Peg-IFN-α对HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者的治疗存在协同作用[17]。本研究旨在探讨不同NAs单药治疗与联合Peg-IFN-α-2b治疗CHB的疗效，为临床治疗方案的选择提供参考。1. 资料与方法
1.1 一般资料
收集2022年9月至2023年8月就诊于昆明市第三人民医院肝病科的CHB患者229例。纳入标准：（1）根据中华医学会感染病学分会和肝病学分会联合发布的《慢性乙型肝炎防治指南（2022年版）》[18]确诊为CHB；（2）病例资料完整；（3）年龄>18岁；（4）依从性良好。排除标准：（1）合并肝恶性肿瘤或其他传染性病毒感染的患者；（2）妊娠期或哺乳期妇女；（3）未规律接受抗HBV治疗的患者；（4）既往有肝脏、脾脏或胆道手术及介入操作的患者。（5）临床资料不完整的患者。（6）治疗期间更换治疗方案的患者。所有患者均签署了治疗知情同意书，本研究经昆明市第三人民医院医学伦理委员会批准通过（KSLL202401300010）。
1.2 治疗方案及分组
根据抗病毒治疗方案，患者被分为A、B、C、D、E、F共6组：
A组（n = 47）：接受恩替卡韦片（国药准字H20052237，中美上海施）0.5 mg口服，1次/d；
B组（n = 19）：接受恩替卡韦片0.5 mg口服， 1次/d，同时加用聚乙二醇干扰素α-2b（国药准字S20174006，厦门特宝生物）注射液135 µg，每周1次皮下注射；
C组（n = 64）：接受艾米替诺福韦片（国药准字H20210029，常州恒邦）250 mg口服，1次/d；
D组（n = 35）：接受艾米替诺福韦片250 mg口服，1次/d，同时加用聚乙二醇干扰素α-2b注射液135 µg，每周1次皮下注射；
E组（n = 29）：接受富马酸替诺福韦二吡呋酯片（国药准字H20173303，江苏正大天晴）300 mg口服，1次/d；
F组（n = 35）：接受富马酸替诺福韦二吡呋酯片300 mg口服，1次/d，同时加用聚乙二醇干扰素α-2b注射液135 µg，每周1次皮下注射。
所有患者均接受了为期24周的治疗，并在治疗结束后观察相关指标。
1.3 观察指标
在基线及治疗24周时，对患者的血常规、肝功能、肾功能、HBV血清学标志物及HBV-DNA等指标进行全面检测。随后，参照《慢性乙型肝炎防治指南（2022年版）》[18]进行评估。
1.4 评价标准
患者抗HBV有效的判定标准为是否达到CHB的临床治愈[18]，具体为：（1）HBV-DNA检测结果转为阴性；（2）HBsAg值下降至
1000 以下；（3）HBeAg检测结果转为阴性；（4）肝功能各项指标恢复至正常范围。若患者治疗后同时满足上述四项条件，则判定为显效；若满足三项或三项以上条件，则判定为有效（包括显效数）；若未满足三项条件，则判定为无效。
1.5 统计学分析
应用Graph Pad Prism9.5.0及SPSS 20.0软件进行统计学分析。分类资料用百分率 [n（%）]表示，采用卡方检验；对计量资料先行Shapiro-Wilk检验，判断是否服从正态分布；对符合正态分布者，以均数±标准差（$\bar x \pm s $）表示，同组前后采用配对t检验，多组间采用方差分析；不符合正态分布者，以中位数（四分位数）[M（P25，P75）]表示，同组前后采用Wilcoxon 配对符号秩检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。P < 0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 各组患者一般资料比较
共纳入229例乙肝患者，其中男性154例，女性75例，年龄范围（18～76）岁，平均年龄为（43.03±11.54）岁。各组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0. 05），具有可比性，见表1。
表 1 各组一般资料比较[n（%）/（$ \bar x \pm s $）]Table 1. Comparison of general data of each group [n（%）/（$ \bar x \pm s $）]分组 年龄
（岁）BMI
（kg/m2）性别 饮酒史 乙肝史 男 女 有 无 5年以下 5年及以上 A 44.43±10.91 23.70±3.78 31（66.0） 16（34.0） 13（27.7） 34（72.3） 17（36.2） 30（63.8） B 39.58±11.16 23.36±4.09 14（73.7） 5（26.3） 3（15.8） 16（84.2） 5（26.3） 14（73.7） C 45.94±11.49 23.98±2.87 41（64.1） 23（35.9） 11（17.2） 53（82.8） 19（29.7） 45（70.3） D 41.54±9.79 23.45±2.33 24（68.6） 11（31.4） 9（25.7） 26（74.3） 7（20.0） 28（80.0） E 42.24±13.40 22.15±2.30 18（62.1） 11（37.9） 10（34.5） 19（65.5） 7（24.1） 22（75.8） F 40.05±11.79 22.37±3.67 26（74.3） 9（25.7） 10（28.6） 25（71.4） 10（28.6） 25（71.4） F/χ2 1.966 2.121 1.891 4.793 2.963 P 0.085 0.064 0.869 0.442 0.706 2.2 各组疗效比较
在治疗24周后，不同治疗方案的有效率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。各组治疗前后有效率见表2，A组有效率最高，F组有效率最低；E组显效率最高，B组显效率最低。
表 2 各组疗效比较[n（%）]Table 2. Comparison of curative effects of each group [n（%）]组别 显效 有效 无效 A（n=47） 5（10.6） 25（53.2） 22（46.8） B（n=19） 1（5.3） 10（52.6） 9（47.4） C（n=64） 9（14.1） 39（60.9） 25（39.1） D（n=35） 6（17.1） 24（68.8） 11（31.4） E（n=29） 5（17.2） 19（65.5） 10（34.5） F（n=35） 3（8.6） 16（45.7） 19（54.3） H 6.114 P 0.295 2.3 各组HBV-DNA比较
治疗24周后，B组和F组的HBV-DNA阳性率与治疗前比较，差异无统计学意义（P > 0.05），其余四组治疗后HBV-DNA阳性率显著低于治疗前，差异有统计学意义（P < 0.05）。各组间HBV-DNA阳性率比较，差异无统计学意义（P > 0.05），见表3。
表 3 各组HBV-DNA比较[n（%）]Table 3. Comparison of HBV-DNA of each group [n （%）]分组 治疗前 治疗后 χ2 P A 阳性 21（44.7） 10（21.3） 5.824 0.016* 阴性 26（55.3） 37（78.7） B 阳性 6（31.6） 2（10.5） 2.533 0.111 阴性 13（68.4） 17（89.5） C 阳性 40（62.5） 27（42.2） 5.293 0.021* 阴性 24（37.5） 37（57.8） D 阳性 21（60.0） 10（28.6） 7.006 0.008** 阴性 14（40.0） 25（71.4） E 阳性 19（65.5） 11（37.9） 4.419 0.036* 阴性 10（34.5） 18（62.1） F 阳性 19（54.3） 13（37.1） 2.072 0.150 阴性 16（45.7） 22（62.9） H 9.305 10.619 P 0.098 0.059 *P < 0.05；**P < 0.01。 2.4 各组血清 HBsAg比较
治疗24周后，A组和E组血清HBsAg水平与治疗前比较，差异无统计学意义（P > 0.05），其余四组治疗后血清HBsAg水平显著低于治疗前，差异有统计学意义（P < 0.05）。各组组间比较，差异有统计学意义（P < 0.05），见表4。
表 4 各组血清HBsAg比较[（M（P25，P75），IU/mL]Table 4. Comparison of serum HBsAg of each group [M（P25，P75），IU/mL]分组 治疗前 治疗后 W/t P A 548.9（157.6， 4091 ）351.8（92.05，1828） −314.0 0.0583 B 492.6（170.0， 3842 ）234.8（29.27， 1173 ）−112.0 0.0230 *C 2258 （519.0，5905 ）1549 （381.00，3576 ）−911.0 0.0003 **D 1233 （137.4，5555 ）857.7（15.99， 2567 ）−337.0 0.0032 **E 2540 （375.5，10473 ）1325 （151.20，5340 ）−93.0 0.2200 F 1031 （87.29，10340 ）533.7（10.14， 5602 ）−363.0 0.0014 **H/F 10.34 11.16 P 0.0663 0.0483 **P < 0.05；**P < 0.01。 2.5 不同方案肝脏硬度值测定（liver stiffness measurement，LSM）比较
各组LSM在治疗前后比较，差异均无统计学意义（P > 0.05），且各组间差异无统计学意义（P > 0.05），见表5。
表 5 各组LSM比较[（$\bar x \pm s $）/M（P25，P75）]Table 5. Comparison of LSM of each group [（$\bar x \pm s $）/M（P25，P75）]分组 治疗前 治疗后 W/t P A 14.9±11.6 14.1±8.72 0.5918 0.5685 B 6.97（6.08，9.03） 6.60（4.90，7.50） 2.000 0.7500 C 7.50（6.10，24.0） 9.10（6.77，15.70） 16.00 0.5693 D 8.60（6.70，11.0） 6.60（6.10，8.95） −5.000 0.6875 E 10.1（9.05，20.9） 10.4（6.50，16.40） −15.00 0.1563 F 6.05（5.38，7.43） 5.35（4.75，10.1） 3.000 0.7500 H/F 2.257 1.362 P 0.0562 0.2457 2.6 各组甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）比较
B组、C组、D组治疗后AFP显著高于治疗前，差异有统计学意义（P < 0.05），其余几组AFP在治疗前后比较，差异均无统计学意义（P > 0.05），且各组间差异无统计学意义（P > 0.05），见表6。
表 6 各组AFP比较[（$\bar x \pm s $）/M（P25，P75），ng/mL]Table 6. Comparison of AFP of each group [（$\bar x \pm s $）/M（P25，P75），ng/mL]分组 治疗前 治疗后 W/t P A 3.66（2.11，6.45） 3.71（2.55，5.56） −167.0 0.3347 B 2.56（2.04，3.45） 3.10（2.68，4.61） 107.0 0.0093 **C 4.39（2.45，18.46） 3.85（2.50，5.60） −557.0 0.0350 *D 2.76（2.28，4.92） 3.36（2.75，6.59） 184.0 0.0358 *E 3.90（2.57，19.43） 3.87（3.26，6.86） −105.0 0.1624 F 2.59（2.09，4.13） 3.49（2.47，7.12） 137.0 0.0830 H/F 0.7987 2.3710 P 0.5517 0.7958 *P < 0.05；**P < 0.01。 2.7 各组肝功能指标比较
A组在治疗后AST、ALT、ALP、GGT均显著低于治疗前，ALB在治疗后显著高于治疗前（P < 0.05）；B组在治疗后GGT水平显著低于治疗前（P < 0.05）；C组在治疗后TBIL、AST、ALT、GGT均显著低于治疗前，ALB在治疗后显著高于治疗前（P < 0.05）；E组在治疗后TBIL、ALT、GGT均显著低于治疗前，ALB在治疗后显著高于治疗前P < 0.05；F组在治疗后GGT显著低于治疗前P < 0.05。TBIL、AST、ALT、ALB、GGT各组间比较，差异均有统计学意义（P < 0.05），见表7。
表 7 各组肝功能指标比较[（$\bar x \pm s $）/M（P25，P75）]Table 7. Comparison of liver function indexes of each group [（$\bar x \pm s $）/M（P25，P75）]指标 A B C D E F H/F P TBIL
（μmol/L）治疗前 14.2
（12.2，22.2）12.4
（9.6，15.1）19.0
（11.9，27.5）15.25±6.679 16.8
（11.3，31.9）14.0
（10.2，18.0）2.075 0.0695 治疗后 18.3
（11.3，24.1）11.6
（8.6，14.9）16.7
（11.5，22.8）13.0
（10.0，16.5）14.0
（10.0，24.8）11.7
（10.0，15.6）20.05 0.0012 **W/t 20.00 −56.00 −484.0 −88.00 −192.0 −158.0 P 0.9186 0.2753 0.0981 0.4783 0.0197 *0.1997 AST
（U/L）治疗前 28
（24，45）46
（27，60）37
（26，52）37
（22，60）40
（27，82）35
（25，53）3.724 0.5898 治疗后 26
（22，36）45
（25，64）28
（23，41）49
（34，65）35
（22，49）54
（32，88）41.41 < 0.0001 **W/t −588.0 44.00 −869.0 161.0 −171.0 192.0 P 0.0010 **0.3897 0.0015 **0.1911 0.0511 0.1177 ALT
（U/L）治疗前 28
（19，47）38
（22，73）33
（23，58）46
（25，83）40
（25，114）51
（23，77）8.469 0.1322 治疗后 25
（17，33）43
（20，67）28
（19，28）44
（32，78）32
（22，49）44
（30，99）47.61 < 0.0001 **W/t −419.0 −5.000 −634.0 46.00 −215.0 94.00 P 0.0105 *0.9295 0.0256 *0.7128 0.0129 *0.3870 ALB
（g/L）治疗前 38.7
（30.7，41.5）42.2
（40.1，43.9）38.1
（34.7，41.3）42.5
（40.3，44.0）37.3±7.91 42.5±3.56 21.739a 0.001** 治疗后 40.7
（35.0，43.1）41.9
（40.3，43.6）40.7
（35.9，43.0）43.6
（40.5，45.6）39.9±5.37 41.7±3.42 W/t 687.0 −10.00 1132 165.0 2.105 1.323 P 0.0002 **0.8519 < 0.0001 **0.1801 0.0444 *0.1947 ALP
（U/L）治疗前 106
（83，130）97
（81，116）101
（86，135）91.3±25 117±45.5 101
（92，132）9.583 0.0880 治疗后 96
（75，126）103
（83，122）99.5
（80，132）91.0±24.3 117±45.2 105
（84，129）9.021 0.1082 W/t −361.0 55.00 −258.0 0.07598 0.5590 47.00 P 0.0482 *0.2415 0.3575 0.9399 0.5811 0.6530 GGT
（U/L）治疗前 28
（18，80）38
（16，77）44
（26，68）54
（21，109）52
（24，97）33
（16，69）6.038 0.3025 治疗后 26
（20，39）54
（30，82）32
（21，55）55
（34，107）38
（23，71）53
（32，77）30.76 < 0.0001 **W/t −373.0 110.0 −903.0 139.0 −204.0 207.0 P 0.0345 *0.0258 *0.0022 **0.2602 0.0024 **0.0322 **P < 0.05；**P < 0.01；a ALB组组间比较采用治疗前后差值进行的H检验。 2.8 各组血液指标比较
B组在治疗后WBC、NEUT、PLT水平显著低于治疗前（P < 0.05）； D组在治疗后WBC、NEUT、PLT水平显著低于治疗前（P < 0.05）；F组在治疗后WBC、NEUT、INR、PLT均显著低于治疗前（P < 0.05）；WBC、NEUT、PLT组间比较，差异有统计学意义（P < 0.05），见表8。
表 8 血液指标比较[（$\bar x \pm s $）/M（P25，P75）]Table 8. Comparison of blood indexes of each group [（$\bar x \pm s $）/M（P25，P75）]指标 A B C D E F H/F P WBC
（×109/L）治疗前 5.13
（3.87，6.05）4.50±1.69 5.13±2.27 4.77
（2.74，6.03）5.2±1.65 4.68
（3.41，5.61）3.637 0.6028 治疗后 4.99
（3.22，5.94）3.35±1.15 4.85±1.99 2.98
（2.13，4.37）5.1±2.12 3.14
（2.54，3.84）38.67 < 0.0001 **W/t 476.0 2.536 1.033 −366.0 0.3792 −423.0 P 0.8285 0.0213 *0.3059 0.0021 **0.7079 < 0.0001 **NEUT
（×1012/L）治疗前 2.63
（1.88，3.68）2.33
（1.63，3.78）2.50
（1.96，3.75）2.47
（1.20，3.89）2.74
（1.96，3.90）2.42
（1.58，3.50）4.649 0.4602 治疗后 2.91
（1.60，3.78）1.60
（1.26，2.13）2.67
（1.72，3.63）1.49
（1.09，2.27）2.97
（1.95，4.01）1.46
（1.11，1.92）44.89 < 0.0001 **W/t 33.00 −102.0 −219.0 −321.0 45.00 −433.0 P 0.8511 0.0242 *0.3882 0.0052 **0.5318 0.0002 **INR 治疗前 1.15
（1.07，1.43）1.05±0.08 1.16
（1.04，1.32）0.99
（0.96，1.10）1.16
（1.06，1.25）1.06
（1.00，1.11）14.34a 0.014* 治疗后 1.18
（1.05，1.39）1.03±0.06 1.20
（1.06，1.34）0.98
（0.94，0.99）1.15
（1.06，1.38）0.97
（0.94，1.02）W/t −85.00 0.7379 −277.0 −72.00 −21.00 −96.00 P 0.4127 0.4794 0.0838 0.1856 0.6051 0.0353 *PLT
（×109/L）治疗前 153.8±86.66 192.8±74.54 174
（75，240）172.1±66.83 163.4±78.31 193
（130，226）5.841 0.3220 治疗后 157.9±92.95 144.5±57.73 170
（68，230）121.9±43.52 162.5±86.06 118
（91，175）4.500 0.4799 W/t 0.2639 2.614 −36.00 5.063 0.005265 −383.0 P 0.7931 0.0182 *0.8915 < 0.0001 **0.9958 0.0012 ***P < 0.05；**P < 0.01；a INR组组间比较采用治疗前后差值进行的H检验。 2.9 各组肾功能指标比较
各组肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR） 在治疗前后比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；各组间比较，差异无统计学意义（P > 0.05），见表9。
表 9 各组GFR比较（mL/min） [（$\bar x \pm s $）/M（P25，P75）]Table 9. Comparison of （mL/min） of each group [（$\bar x \pm s $）/M（P25，P75）]分组 治疗前 治疗后 W/t P A 103.4（72.8，124.7） 96.0（80.4，112.3） -53.00 0.7388 B 123.3±30.88 112.1±30.80 1.748 0.0975 C 117.0±29.35 111.7±29.09 1.404 0.1654 D 119.3±24.9 116.5±38.7 0.5201 0.6065 E 118.7±34.47 113.7±35.38 1.216 0.2348 F 118.3（95.0，147.6） 122.1（105.7，144.8） 123.0 0.2798 H/F 1.705 1.726 P 0.1345 0.1297 3. 讨论
由于cccDNA的稳定性和在病毒生命周期中的中心作用，它被认为是导致HBV持续感染和复发的主要因素[19]。NAs类药物通过抑制HBV的复制，对改善肝脏病理状况具有显著效果。然而，它们无法消除或灭活cccDNA。cccDNA在肝细胞核内的持续存在，意味着病毒可以在停止NAs治疗后迅速恢复复制。因此，大多数CHB患者需要长期，甚至终生接受NAs治疗以控制病毒复制[20−21]。口服是NAs的优势，但它们对病毒消除或治疗后实现长期抑制方面存在局限性。血清中HBV-DNA水平降至无法检测，HBsAg的清除依然难以实现[22−23]。Peg-IFNα-2b是一种新型单Peg-IFN，与其他的Peg-IFN相比，它只有一种主要形式，具有更长的作用持续时间，允许每两周或更长时间注射一次，具有更高的耐受性[24]。IFNα是机体受到病毒等刺激时分泌的一种糖蛋白类物质，可以促进免疫细胞活化，具有直接或间接抗病毒活性[25]。IFNα可降低细胞中HBV-DNA、HBeAg和HBsAg水平，持久且可显著改善远期不良结局，约有5%的患者实现了HBsAg血清清除[26]。IFNα能够调节先天性免疫和适应性免疫，从而间接消除cccDNA，是当前唯一具有潜在消除肝细胞中cccDNA能力的药物[27]。然而，其低抗病毒效力和耐受性差限制了其广泛应用。IFNα与NAs作用机制与作用靶点不同，两类药物联合使用不会出现交叉耐药的情况。抗病毒治疗的目标是通过抑制病毒复制和增强病毒的免疫控制，以预防或减少肝脏炎症，阻断或延缓肝病的进展[28]。这种联合治疗策略旨在提高治疗效果，为患者提供更多的治疗选择。
3.1 NAs单用与联用Peg-IFN-α-2b的有效性分析
在本研究中，不同治疗方案间的有效率差异无统计学意义（P > 0.05），但NAs单用有效率分别为53.2%（ETV）、60.9%（TMF）、65.5%（TDF），当这些药物与Peg-IFN-α-2b联用后，有效率分别为52.6%（ETV+ Peg-IFN-α-2b）、68.8%（TMF+ Peg-IFN-α-2b）、45.7%（TDF+ Peg-IFN-α-2b）。值得注意的是，ETV和TDF与Peg-IFN-α-2b联合使用时，HBV-DNA水平的变化不显著（P > 0.05），表明这些联合治疗方案的病毒学应答率较低，与较低的有效率相一致。进一步分析表明，单独使用TDF的高有效率可能与其有效改善肝功能指标有关，包括总胆红素（TBIL）（P =
0.0197 ）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）（P =0.0129 ）、血清γ谷氨酰转移酶（GGT）（P =0.0024 ），从而导致的有效率较高。同理，单用ETV可以有效降低天冬氨酸氨基转移酶（AST）（P =0.0010 ）、碱性磷酸酶（ALP）（P =0.0482 ）、ALT（P =0.0105 ）、GGT（P =0.0345 ），增加血清白蛋白（ALB）（P =0.0002 ），这也是单用ETV组有效率较高的原因。在本研究中，TMF与Peg-IFN-α-2b联合使用时有效率最高，而TDF与Peg-IFN-α-2b联合使用时有效率有所下降。此外，对于使用ETV有效的患者，特别是那些基线HBsAg水平较低的患者，联合使用IFN和其他免疫调节剂可以有效降低HBsAg水平。这种反应可能与自然杀伤（NK）细胞的活性有关[29]。本研究中ETV联用 Peg-IFN-α-2b的有效率低于单用ETV，这可能与治疗周期不够长有关。Lee等[30]研究显示，在ETV治疗基础上增加peg-IFN可显著提高100周时HBsAg血清清除率，并指出24周时提前停止Peg-IFN-α治疗可能优化成本效益。Marcellin等[31]研究表明，接受TDF联合Peg-IFN治疗48周的患者，HBsAg清除比例明显高于单独接受TDF或聚乙二醇干扰素治疗的患者。本研究中不同治疗方案 HBsAg 水平有显著差异（P =
0.0483 ），联用Peg-IFN-α-2b的方案均显著降低血清HBsAg水平（P < 0.05），这些发现强调了联合治疗策略在提高CHB治疗效果中的潜力，同时也提示了治疗周期长度和患者基线特征在治疗响应中的重要性。未来的研究需要进一步探索最佳的治疗方案和治疗持续时间，以实现更好的临床结果。3.2 NAs单用与联用Peg-IFN-α-2b的安全性分析
有研究[32]证明LSM及AFP是肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的高危因素。LSM可以作为评价肝纤维化程度的指标。在本研究中，不同治疗方案LSM的差异无统计学意义（P > 0.05），6种治疗方案治疗前后LSM也无显著差异（P > 0.05），说明无论是单用NAs还是联用Peg-IFN-α-2b均对肝纤维化无明显影响，且对HCC无明显影响。AFP是一种单链糖蛋白，在肝癌的发展中扮演着复杂的角色，它可以通过多种机制影响肝癌细胞的分化、生长、转移、侵袭和凋亡。作为1种分泌蛋白，当AFP在血清中的表达量增加时，它还能影响免疫细胞的功能[33- 34]。AFP在急慢性肝炎，肝硬化患者血清中也可检出，会出现AFP的中度升高，但随着病情好转，常在短时间内下降至正常水平，此即AFP“一过性升高”[35]。对于接受ETV联用Peg-IFN-α-2b治疗的患者，研究发现治疗后他们的AFP水平显著高于治疗前（P =
0.0093 ），尽管如此，这些水平仍然处于5～8 ng/mL的正常范围内，这可能被认为是另一种形式的AFP“一过性升高”。在一项Peg-IFN-α-2b治疗低级别淋巴瘤样肉芽肿病的研究[36]中，最常见的3级或更严重不良事件包括中性粒细胞（NEUT）减少（53%）、淋巴细胞减少（47%）和白细胞（WBC）减少（47%）。此外，还有研究指出，所有联合使用Peg-IFN的治疗方案都可能伴有轻度但稳定的血小板（PLT）和WBC计数下降，但对人体几乎没有肝毒性[37]。在本研究中，联合使用Peg-IFN-α-2b的治疗方案导致WBC、NEUT、PLT显著下降（P < 0.05），这强调了在采用此类联合治疗方案时，需要定期监测患者的血液指标，以确保安全和及时调整治疗方案。血液指标的监测有助于及早发现潜在的血液学不良事件，并允许医生在必要时采取措施，如调整剂量或暂时中断治疗，以减轻患者的不良反应。
TDF联用Peg-IFN-α-2b的治疗方案中，治疗前后国际标准比值（international normalized ratio，INR）有显著下降（P =
0.0353 ），表明可能对肝脏凝血因子合成功能的积极影响。机体内多种凝血、抗凝及纤溶因子主要在肝脏内合成，当肝脏受损时，由于肝细胞广泛变性坏死，凝血因子合成减少，从而导致凝血机制异常[38]。INR值在治疗后下降，这可能表明肝脏合成凝血因子的能力有所改善。此外，INR的下降保持在正常范围内，意味着患者的凝血状态稳定，未出现凝血异常的风险。肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）是反应肾功能的一个指标。本研究中，不同治疗方案间的GFR的差异无统计学意义（P > 0.05），且6种治疗方案治疗前后GFR均无显著差异，说明无论是单用NAs，还是联用Peg-IFN-α-2b均对肾功能无明显影响。然而，有相关研究[39]表明，因TDF通过肾脏代谢，会增加肾小管的毒性风险，相比之下，TMF的药代动力学特性使其对肾脏具有良好的安全性。本研究中未观察到显著差异，可能的原因是研究周期较短。因此，对于长期使用TDF的患者，仍需持续监测其肾功能，以确保药物使用的安全性。
本研究存在一定的局限性，这些局限性可能会影响研究结果的普遍性和结论的强度。首先，样本量较小，特别是ETV联合Peg-IFN-α-2b治疗组的样本量较小，这可能会限制统计分析的灵敏度和结果的代表性。小样本量可能导致结果的偶然性增加，减少发现真实效应的能力；其次，研究仅纳入了24周的治疗病例，这意味着研究未能探讨治疗方案的长期效果和获益。长期跟踪研究对于评估治疗效果的持久性、病毒抑制的持续性以及患者生活质量的改善至关重要。以及研究中未充分考虑不同保肝药物的使用及其对肝脏指标的影响。保肝药物可能对改善肝脏炎症和ALT正常化率有积极作用，不同药物的获益和影响程度可能有所不同。这一点在评估治疗方案效果时非常重要，因为保肝药物的使用可能会影响肝功能指标的改善[40]。
综上所述，NAs单用与联用Peg-IFN-α-2b的方案比较，各有优势，联用Peg-IFN-α-2b可明显降低血清HBsAg水平，但联用也会导致增加骨髓抑制等不良反应，增加治疗成本。故在选择治疗方案时，医生需要综合考虑患者的个体情况和治疗偏好，权衡利弊后谨慎选用，以确保患者获得最佳的治疗效果和生活质量。
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图 1 差异表达基因热图（左）及火山图（右）
A：差异表达基因热图；B：火山图。
Figure 1. Heat map （left） and volcanic map （right） of differentially expressed genes
图 3 lasso回归（左）和交叉验证（右）图形
Figure 3. Lasso regression （left） and cross-validation （right） graph
图 4 训练集和验证集的Kaplan-Meier分析曲线
Figure 4. Kaplan-Meier analysis curve of training and verification sets
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[1] Bray F,Ferlay J,Soerjomataram I,et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA:A Cancer Journal for Clinicians,2018,68(6):394-424. doi: 10.3322/caac.21492 [2] Zheng R,Zhang S,Zeng H,et al. Cancer incidence and mortality in China,2016[J]. Journal of the National Cancer Center,2022,2(1):1-9. doi: 10.1016/j.jncc.2022.02.002 [3] De Duve C. The lysosome turns fifty[J]. Nature Cell Biology,2005,7(9):847-849. doi: 10.1038/ncb0905-847 [4] Patel V G,Oh W K,Galsky M D. Treatment of muscle‐invasive and advanced bladder cancer in 2020[J]. CA:A Cancer Journal for Clinicians,2020,70(5):404-423. doi: 10.3322/caac.21631 [5] Kallunki T,Olsen O D,Jäättelä M. Cancer-associated lysosomal changes: Friends or foes?[J]. Oncogene,2013,32(16):1995-2004. doi: 10.1038/onc.2012.292 [6] Reddy A. Plasma membrane repair is mediated by calcium (2+)-regulated exocytosis of lysosomes[J]. Yale University,2001,106(2):157-169. [7] Mohamed M M,Sloane B F. Multifunctional enzymes in cancer[J]. Nature Reviews Cancer,2006,6(10):764-775. doi: 10.1038/nrc1949 [8] Dykes S S,Gray A L,Coleman D T,et al. The Arf-like GTPase Arl8b is essential for three-dimensional invasive growth of prostate cancer in vitro and xenograft formation and growth in vivo[J]. Oncotarget,2016,7(21):31037-31052. doi: 10.18632/oncotarget.8832 [9] Tan J X,Wang X Y,Su X L,et al. Upregulation of HYAL1 expression in breast cancer promoted tumor cell proliferation,migration,invasion and angiogenesis[J]. PLoS One,2011,6(7):e22836. doi: 10.1371/journal.pone.0022836 [10] Zhu S,Yao R,Li Y,et al. Lysosomal quality control of cell fate: A novel therapeutic target for human diseases[J]. Cell Death & Disease,2020,11(9):1-13. [11] Meo-Evoli N,Almacellas E,Massucci F A,et al. V-ATPase: A master effector of E2F1-mediated lysosomal trafficking,mTORC1 activation and autophagy[J]. Oncotarget,2015,6(29):28057-28070. doi: 10.18632/oncotarget.4812 [12] Rezaei S,Nikpanjeh N,Rezaee A,et al. PI3K/Akt signaling in urological cancers: Tumorigenesis function,therapeutic potential,and therapy response regulation[J]. European Journal of Pharmacology,2023,955(15):175909. -
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