阿司匹林是1种水杨酸类环氧化酶抑制剂，被广泛应用于心血管领域，是目前临床应用最广泛的药物之一。阿司匹林肠溶片（Bayaspirin^®）于1993年在德国上市，规格为0.1和0.3 g，于1999年获准进口，规格为0.1 g，商品名Bayaspirin^®。临床上主要用于预防脑缺血发作、心肌梗死等，属于临床常用药物，是国内外企业仿制开发的重要产品之一。但因本产品处方组成较为复杂，包衣工艺难度较大；阿司匹林遇水易发生酯键断裂生成水杨酸，在高温潮湿环境下易水解，生产过程需要严格控制诸多关键工艺参数；阿司匹林在人体内药动学参数的高变异性给BE研究带来了较大的挑战，尤其是高脂餐后条件下，由于胃肠道pH和胃排空情况等发生变化，原形药物和代谢物水杨酸吸收均延迟，阿司匹林在人体内释放和吸收速率呈现较大的个体间和个体内差异，达峰时间分布范围变宽；此外，由于阿司匹林易水解的特性，BE研究的生物样本同样面临血浆稳定性和检测准确度的问题；因此，大大增加了该产品仿制难度，目前仿制成功或者通过仿制药一致性评价的数量较少^[1]。

针对以上问题，本研究以国家药品监督管理局公布的第4批参比制剂目录中序号4-20、持证商Bayer S.p.A、商品名Bayaspirin^®为R，开展处方工艺研究，采用完全重复试验设计进行BE研究，以期得到与R体内外质量一致的产品。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

本研究所用的主要仪器设备和试药信息见表1和表2。

表  1  仪器信息表

Table  1.  Instrument information table

名称	型号	厂家
X射线衍射仪	XPERT-3	上海思百吉仪器
全自动溶出仪	Sotax XTEND	瑞士Sotax
pH计	FE28	梅特勒托利多仪器（上海）
高效液相色谱仪	1260	安捷伦科技
液质联用仪	API4500	美国Sciex
水分测定仪	MB-45	奥豪斯仪器（上海）
方锥混合机	HF-3	哈尔滨纳诺科技
高速双出料压片机	GZPS-73	北京翰林航宇科技
高效流动层包衣机	LDB-350	哈尔滨纳诺科技
台秤	Defender	奥豪斯仪器（上海）
分析天平	MS205DU	梅特勒托利多仪器（上海）

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表  2  试药信息表

Table  2.  Trial drug information table

名称	批号	厂家
阿司匹林	Y1807001	山东新华制药
玉米淀粉	F2012004	山东阿华医药
粉状纤维素	F2012004	广州市天润药业
L30D-55水分散体	F2101001	上海昌为医药
滑石粉	F2101001	广西龙胜正大
枸橼酸三乙酯	F2101001	南京威尔药业
阿司匹林对照品	100113-201706	中国食品药品检定研究院
水杨酸对照品	100106-201605	中国食品药品检定研究院
盐酸、冰醋酸、 三水醋酸钠、 磷酸二氢钾、 氢氧化钠等 其他试剂试药	分析纯	/

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1.2   研究方法

1.2.1   阿司匹林肠溶片的制备

100万片批量：将称量好的阿司匹林100 kg、玉米淀粉10 kg、粉状纤维素10 kg混合5 min；按应压片重0.12 g/片压片；用包衣液（20%固含量）进行包衣，控制增重范围为15%～20%（包衣锅转速3～8 r/min、片芯温度25 ℃～50 ℃）^[2]。

1.2.2   体外释放方法

照chp 2020版通则0931第二法^[3]，以900 mL HCL溶液（0.1 mol/L）为体外释放介质，转数50 r/min，经2 h取样5 mL，酸中释放量项下2 h取样后，取出药片，在释放杯中加入37℃ pH值为6.8、6.4和7.2的缓冲溶液900 mL，继续释放，依法操作，经10、15、30、45、60、90和180 min时取样5 mL，补以同温度的同种介质5 mL。和以pH4.0的缓冲溶液900 mL为释放介质，转数为50 r/min，依法操作，经2 h时取样5 mL，pH4.0中释放2 h取样后，取出药片，在释放杯中加入37℃ pH值为6.8的缓冲溶液900 mL，继续释放，依法操作，经10、15、30、45、60、90和180 min时取样5 mL，补以同温度的同种介质5 mL。上述各释放液滤过，分别取各续滤液，即供试品溶液^[4-6]。

本研究中释放介质配制方法见表3。

表  3  释放介质配制方法

Table  3.  Configuration method of dissolution media

释放介质	配制方法	参考标准
pH1.0缓冲溶液	取盐酸溶液9 mL，加水稀释至1000 mL，摇匀，即得。	欧洲药典
pH4.0缓冲溶液	2 mol/L醋酸溶液：取28.5 mL冰醋酸，加水稀释至250 mL，摇匀，即得。 取三水醋酸钠1.22 g，用2 mol/L醋酸溶液20.5 mL使其溶解，加水稀释至1000 mL， 摇匀，即得。	欧洲药典
pH6.4缓冲溶液	取6.80 g磷酸二氢钾，加58 mL 0.2 mol/L氢氧化钠液（取8.0 g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1000 mL，即得）和适量水溶解后，再加水稀释至1000 mL，摇匀，即得。	欧洲药典
pH6.8缓冲溶液	取6.80 g磷酸二氢钾，加112 mL 0.2 mol/L氢氧化钠液（取8.0 g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1000 mL，即得）和适量水溶解后，再加水稀释至1000 mL，摇匀，即得。	欧洲药典
pH7.2缓冲溶液	取6.80 g磷酸二氢钾，加173.5 mL 0.2 mol/L氢氧化钠液（取8.0 g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1000 mL，即得）和适量水溶解后，再加水稀释至1000 mL，摇匀，即得。	欧洲药典

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对照品溶液的配制和色谱条件参照chp 2020版阿司匹林肠溶片含量和溶出度测定方法^[7]。

测定法：精密量取阿司匹林肠溶片供试品溶液、对照品溶液，进样。以阿司匹林、水杨酸的峰面积，用外标法分别计算阿司匹林、水杨酸的含量。以纵坐标（释放率）、横坐标（释放时间），绘制阿司匹林肠溶片释放曲线。

1.2.3   BE研究方法

受试者：本试验伦理通过苏州大学附属第二医院伦理委员会审查批准(批件号为JD-LS-2021-074-01)。本试验的所有受试者均签订了阿司匹林肠溶片BE试验知情同意书。

试验设计：参照相关指导原则，开展餐后状态下BE研究。文献报道^[8-13]本品最大个体内变异系数≥30%，故将本试验设计为单中心、两制剂、两顺序、四周期、单次口服给药。入组受试者共12人，随机分为2组，每组6人。

餐后给药方法：每周期在餐后条件下给予1片试验药物阿司匹林肠溶片T或R。受试者将在每周期的给药前1 d到达研究中心，统一清淡饮食，给药前至少禁食10 h以上，受试者于服药当日早上进食高脂、高热量(约800 kcal～1000 kcal)早餐，并在30 min内用餐完毕，在开始进餐后30 min口服100 mg试验用药品（T或R），240 mL温开水送服。

按照方案规定的时间点，采集全血3 mL，置含抗凝剂(EDTA-K2-NaF)的采血管(常温)中，并立即轻轻的摇匀，使所采集的血液与相应的抗凝剂充分混合，采血管应直立在试管架（冰浴）上，直至离心。采血后1 h内将血样在2 ℃～8 ℃（1700 g±10 g）条件下离心10 min。所有离心后血浆样本分成两份，吸入冻存管中（A、B 2个冻存管），其中取约800 μl血浆加入到待测管A中，相同的操作将剩余血浆分至备份管B，B管体积不得超出标示量刻度。已分离的血浆，可以暂存在冰箱（-20 ℃及以下），但需在采血后12 h内，转移至冰箱（-80 ℃）保存，待生物样本全部采集完毕后采用冷链运输至分析测试单位。

2.   结果

2.1   影响阿司匹林肠溶片质量因素的考察

2.1.1   原料药晶型

使用XRPD仪分别对R和T的原料药晶型进行考察，同时考察其在制剂生产过程中的稳定性。结果表明，阿司匹林原料药的晶型在阿司匹林肠溶片制剂生产过程中，没有发生明显的改变，且T原料药晶型与R原料药晶型一致，见图1和图2。

图  1  R中原料药和不同厂家原料药X-射线粉末衍射图

Figure  1.  X-ray powder diffraction patterns of R raw materials and raw materials from different manufacturers

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图  2  R和T中原料药X-射线粉末衍射图

Figure  2.  X-ray powder diffraction patterns of raw materials in R and T

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2.1.2   原料药粒径

本品为高溶解性药物，原料药粒径对制剂释放度影响较小，但处方中原料药占比高达83%，原料药粒径可能影响药物释放，故需进行原料药粒径的影响研究。照“2.1”项下方法，以24目～50目、50目～65目和65目～80目粒径范围的原料药分别制备片剂，照“2.2”项下方法考察体外释放行为。结果表明，阿司匹林原料药粒径对阿司匹林肠溶片制剂的体外释放没有明显的影响，30 min时释放率均可达到80%以上，计算与R释放曲线的f₂值分别为52、95和74，原料药粒径为50目～65目样品的释放曲线与R释放曲线几乎重叠，见图3。

图  3  不同原料药粒径阿司匹林肠溶片与R的体外释放曲线图

Figure  3.  In vitro release curves of aspirin enteric coated tablets with different particle sizes and R

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2.1.3   包衣液配方

由R说明书可知，本品肠溶包衣配方为L30D-55水分散体、滑石粉和枸橼酸三乙酯，但不清楚具体用量，因此需对肠溶包衣材料配比进行筛选^[14]。L30D-55水分散体厂家提供的包衣配方及文献资料显示，L30D-55水分散体与枸橼酸三乙酯的配比均为1∶0.1。故固定L30D-55水分散体与枸橼酸三乙酯比例为1∶0.1，调整滑石粉用量。照“2.1”项下方法制备，照“2.2”项下方法考察体外释放行为。结果表明，滑石粉用量不影响制剂释放，但配方1（1∶0.5∶0.1）和配方3（1∶1.5∶0.1）在包衣过程出现粉尘较大、堵枪、粘片等情况，故优选包衣配方2（1∶1∶0.1），见图4。

图  4  不同包衣配方阿司匹林肠溶片与R的体外释放曲线图

Figure  4.  In vitro release curves of aspirin enteric coated tablets with different coating formulations and R

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2.1.4   包衣增重

配制20%的肠溶衣包衣液进行包衣，控制肠溶层包衣増重分别为10%、15%和20%。包衣结束后考察肠溶包衣增重对阿司匹林肠溶片体外释放行为的影响。结果表明，当包衣增重在15%～20%时，其体外释放行为与R相似，见图5。

图  5  不同包衣增重阿司匹林肠溶片与R的体外释放曲线图

Figure  5.  In vitro release curves of aspirin enteric coated tablets with different coatings for weight gain and R

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2.2   验证试验

2.2.1   考察T的体外释放行为

照“2.1”项下方法制备3批100万片样品（ZBA2101S、ZCB2101S、ZDB2101S），照“2.2”项下方法考察体外释放行为。结果表明，本品制备工艺重现性好，质量稳定，见图6。

图  6  3批100万片样品（ZBA2101S、ZCB2101S、ZDB2101S）体外释药行为

Figure  6.  In vitro drug release behavior of 3 batches of 1 million samples （ZBA2101S，ZCB2101S，ZDB2101S）

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2.2.2   评价T与R的体外释放行为

照“2.2”项下方法，评价T（ZBA2101S、ZCB2101S、ZDB2101S）与R（BJ53633）的体外释放行为，结果f₂相似因子均大于72，表明阿司匹林肠溶片T与R的体外释放行为相似。

表  4  T（ZBA2101S、ZCB2101S、ZDB2101S）与R（BJ53633）体外释放行为评价结果

Table  4.  Evaluation results of in vitro release behavior of T （ZBA2101S，ZCB2101S，ZDB2101S） and R （BJ53633）

释放介质	ZBA2101S	ZCB2101S	ZDB2101S
pH1.0+pH6.8	94	86	88
pH4.0+pH6.8	69	75	73
pH1.0+pH6.4	73	75	72
pH1.0+pH7.2	71	76	75

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2.3   BE研究结果

参考《高变异药物BE研究技术指导原则》^[10]，采用SAS9.4软件对主要药动学参数（AUC、C_max）进行BE评价。根据R个体内标准差（SWR）选择评价方法（评价乙酰水杨酸）。若SWR < 0.294（即R个体内变异系数CV% < 30%)，采用平均生物等效性（ABE）评价方法，等效标准为：T和R药动学参数C_max、AUC_0-t、AUC_0-∞几何平均值比的90%置信区间在80.00%～125.00%范围内。若SWR≥0.294（即R个体内变异系数CV%≥30%），采用R标度的平均生物等效性（RSABE）评价方法，通过WinNonlin软件计算的T和R药动学参数C_max、AUC_0-t、AUC_0-∞几何均值比的点估计值在80.00%～125.00%范围内，且C_max、AUC_0-t、AUC_0-∞的95%置信区间上限小于等于0，则两制剂生物等效。只有AUC和C_max均判定等效才可申明该T与R具有生物等效性。结果餐后状态下，检测物乙酰水杨酸的C_max、AUC_0-t和AUC_0-∞均满足相应的RSABE或ABE生物等效性评价标准，T和R具有良好的生物等效性，见表5～表6和图7。

表  5  T与R药代动力学参数

Table  5.  Pharmacokinetic parameters of T and R

参数	餐后
	T	R
Cmax （ng/mL）	671.08±127.44	597.58±225.55
AUC0−t （h·ng/mL）	844.63±304.08	795.02±416.46
AUC0−∞ （h·ng/mL）	854.91±354.17	866.05±212.65

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图  7  餐后药时曲线图

Figure  7.  Postprandial medication time curve

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3.   讨论

3.1   关于体外评价的讨论

日本橙皮书^[9]中收载了R在50 r/min （pH1.0、pH6.0、pH6.8），100 r/min（pH6.0）等多种条件下的体外释放行为，经试验，本品T和R在pH6.0介质中释放度均极低，不适用。故改用pH6.4、pH6.8和pH7.2缓冲溶液考察T和R的体外释放行为，更好的结合肠溶制剂及人体空腹、餐后胃肠道pH变化规律，有较好的区分力多种pH值溶出介质中的溶出曲线是剖析原研固体制剂内在质量的关键手段。该手段可用于寻找仿制制剂与参比制剂之间的质量差异，指导仿制药的研发，降低仿制药与原研药出现临床疗效差异的风险^[6]。

表  6  乙酰水杨酸（ASA）C_max、AUC_0-t及AUC_0-∞ ABE方法和RSABE方法结果（BES，n=12）

Table  6.  Results of Acetylsalicylic Acid （ASA） C_max，AUC_0-t，and AUC_0-∞ ABE and RSABE methods （BES，n=12）

参数	平均生物等效性（ABE）						参比制剂标度的平均生物等效性（RSABE）			采用 方法	是否 等效
	Geo Test （ng/mL）	Geo Ref （ng/mL）	GMR （%）	90% 置信下限	90% 置信上限		SWR [≥0.294]	GMR点估计 [0.80，1.25]	95%置信上限 [<=0]
Cmax（ng·mL−1）	671.08	597.58	112.30	81.36	155.01		0.653	1.0887	−0.0742	RSABE	是
AUC0−t（h·ng/mL）	844.63	795.02	106.24	84.07	134.26		0.366	1.0209	−0.0099	RSABE	是
AUC0−∞（h·ng/mL）	854.91	866.05	98.71	80.77	120.65		0.254	0.8873	0.1441	ABE	是

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3.2   关于BE研究的讨论

从BE研究数据可见，阿司匹林肠溶片在人体内药动学参数表现为高变异药物特征。试验前应充分估计所需的样本量并考虑可能的受试者脱落等因素，以保证足够的检验效能。血浆中乙酰水杨酸和水杨酸的达峰时间不同并且二者的半衰期均较短，需合理设计样品采集时间点，使药物浓度-时间曲线包含乙酰水杨酸和水杨酸的吸收、分布、消除相。需要注意的是，高脂餐后条件下阿司匹林吸收延迟，达峰时间分布范围变宽但生物利用度没有显著降低。此外，阿司匹林易水解为水杨酸，需要在血样采集和前处理等过程中格外关注，并对检测物质的转化情况进行相应考察，以保证生物分析结果的准确性^[1]。

3.3   关于逆向工程的讨论

逆向工程对仿制药的研究与开发至关重要，可以大大缩短仿制药开发的时间，在一致性评价工作中发挥着重要的作用^[15-18]。本研究采用逆向工程研究技术对R的外观、物理和化学性质，R原料药粒径以及包衣配方等进行检测分析，对阿司匹林肠溶片仿制药开发提供重要的指导意义。本研究所制备的阿司匹林肠溶片，其处方工艺可实现稳定生产，重现性良好。体内外评价结果表明，T与R的体外释放和体内餐后药动学行为具有较好的一致性，为阿司匹林肠溶片的仿制药开发提供了有力的科学依据。