Changes of Genebody Methylation in Lingual Carcinogenesis
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摘要:
目的 了解舌粘膜癌变中基因体甲基化的差异表达基因。 方法 用浓度50 mg/L的4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）诱导C57BL/6小鼠舌癌。基因芯片和甲基化DNA免疫沉淀测序（MeDIP-Seq）检测0周、12周、28周（代表正常、癌前、癌变）的舌粘膜的基因表达和基因组DNA甲基化。在人正常舌粘膜和癌前病变组织中用qRT-PCR和飞行质谱检测泛素羧基水解酶CYLD的mRNA表达和基因体甲基化。 结果 正常、癌前和舌癌3组间基因体MeDIP-score（mean±s）分别是（5.58±14.80）、（5.79±13.35）、（5.83±17.25），差异无统计学意义（H = 100.75，P > 0.05）。3组间145个差异表达基因伴基因体甲基化改变。CYLD在人癌前病变组织中表达降低伴有基因体甲基化降低（P < 0.05）。 结论 舌粘膜癌变有多个基因体甲基化异常的差异表达基因，CYLD在人癌前病变中低表达可能与基因体甲基化有关。 Abstract:Objective To evaluate differentially expressed genes with correlation of gene body methylation . Methods The lingual carcinogenesis was induced through the delivery of drinking water of 4-nitroquinoline-1-oxide（4NQO） with a density of 50 mg/L. The lingual mucosae specimens were harvested at 0, 12, 28 weeks, which represented normal, pre-cancer, and cancer individually. The microarray and methylated DNA immunoprecipitation sequencing （MeDIP-Seq） were used for the evaluation of gene expression and global DNA methylation in these specimens. The mRNA expression of Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase CYLD was tested with qRT-PCR in human normal and dysplasia mucosa. Results There were no statistical differences in gene body methylation among normal（C）, pre-cancer（M）, and cancer（E）（mean±sofMeDIP-score were 5.58±14.80, 5.79±13.35, 5.83±17.25 individually, H = 100.75, P > 0.05）There presented 145 differentially expressed genes with positive correlation to gene body methylation changes.The expression of CYLD mRNA was decreased in human dysplasia compared to normal mucosa with downregulation of gene body methylation. Conclusions There are many differentially expressed genes with a positive correlation to gene body methylations. The expression of CYLD is downregulated with the downregulation of gene body methylation in earlier stage during tongue carcinogenesis. -
Key words:
- Tongue cancer /
- Animal model /
- Methylation /
- Gene body /
- Differentially expressed gene
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黑色素瘤是一种由黑色素细胞转变来的恶性肿瘤，过去40 a间，其发病率呈快速增长趋势，严重危及人民健康[1-2]。黑色素瘤恶性程度高，不同部位、类型黑色素瘤治疗原则不同[3-4]。为掌握云南省黑色素瘤的发病特点及其趋势，为云南省黑色素瘤预防及治疗提供参考，现对云南省肿瘤医院2007年1月至2021年12月收治的1203例患者临床资料进行分析。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
收集2007年1月至2021年12月于云南省肿瘤医院（昆明医科大学第三附属医院）门诊或住院确诊的黑色素瘤患者的临床资料，共1 203例，其中男性598例，女性605例，年龄11～90岁，中位年龄57岁。
1.2 纳入标准和排除标准[5]
将2007年1月至2021年12月门诊或住院确诊黑色素瘤，且经病理复查诊断符合黑色素瘤的患者临床资料纳入本研究。确诊时间不在该范围内、无病理切片复查或复查病理诊断存疑的患者予以排除。
1.3 研究方法
按原发部位分为皮肤黑色素瘤、黏膜黑色素瘤和原发灶不明3大类；进一步按解剖部位进行二级分类，最后对其发病部位、性别、发病年龄、发病趋势进行分析。
1.4 统计学处理
将患者临床病例资料导入SPSS 25.0，建立患者数据库，并利用软件分析性别、年龄、肿瘤原发部位等特征的黑色素瘤构成比，使用χ2检验、Kruskal-Walis H检验验证，P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 云南省肿瘤医院确诊黑色素瘤构成
1 203例黑色素瘤患者临床资料中：男598例，女605例；原发于皮肤930例、黏膜208例、原发组织不明65例。原发于皮肤的黑色素瘤包括：头颈部65例、躯干65例、肢端684例、四肢（肢端除外）116例；原发于黏膜的黑色素瘤包括：眼结膜/脉络膜22例、鼻腔鼻窦黏膜73例、口腔黏膜20例、内脏黏膜22例、胃肠黏膜50例、生殖系统黏膜21例，见表1、图1。
表 1 云南省肿瘤医院2007年~2021年黑色素瘤发病部位统计Table 1. Melanoma primary sites diagnosed in Yunnan Cancer Hospital from 2007 to 2021原发灶部位 n 构成比（%） 皮肤 肢端 684 56.9 四肢/肢端除外 116 9.6 躯干 65 5.4 头颈部 65 5.4 黏膜 鼻腔副鼻窦 73 6.1 胃肠 50 4.2 眼结膜/脉络膜 22 1.8 内脏 22 1.8 生殖系统 21 1.7 口腔 20 1.7 不明 65 5.4 
图 1 云南省肿瘤医院2007年～2021年黑色素瘤发病部位构成Figure 1. Melanoma primary sites composition diagnosed in Yunnan Cancer Hospital from 2007 to 20212.2 性别与发病部位相关性
黑色素瘤发病部位前5位在两性别中都为肢端皮肤、四肢皮肤（肢端除外）、鼻腔副鼻窦黏膜、头颈部皮肤、躯干皮肤，占所有发病部位的83.4%。不同性别发病部位，差异有统计学意义（P < 0.05）。原发于皮肤的黑色素瘤，除肢端皮肤多见于男性外，头颈部皮肤、躯干皮肤和四肢皮肤以女性多见；原发于黏膜的黑色素瘤，生殖系统黏膜和内脏黏膜多见于女性，口腔黏膜、鼻腔副鼻窦黏膜和胃肠黏膜多见于男性，眼结膜/脉络膜则男女比例相当，见表2。
表 2 不同性别黑色素瘤患者发病部位分布情况Table 2. Distribution of primary sites of melanoma patients in different gender原发灶部位 男 女 χ2 P n 构成比（%） n 构成比（%） 皮肤 头颈部 25 2.1 40 3.3 肢端 366 30.4 318 26.4 躯干 24 2.0 41 3.4 四肢/肢端除外 49 4.1 67 5.6 黏膜 口腔 13 1.1 7 0.6 内脏 10 0.8 12 1.0 30.115 < 0.001* 鼻腔副鼻窦 38 3.2 35 2.9 生殖系统 2 0.2 19 1.6 胃肠 26 2.2 24 2.0 眼结膜/脉络膜 11 0.9 11 0.9 不明 34 2.8% 31 2.58% *P < 0.05。 2.3 年龄段与发病部位的相关性
本组患者中位年龄57岁（11～90岁），31～70岁年龄段患病人数最多（82.8%）。不同年龄段发病部位，差异有统计学意义（P < 0.05），见表3。
表 3 不同年龄段黑色素瘤患者发病部位分布情况Table 3. Distribution of primary sites of melanoma patients in different age groups原发灶
部位30岁及以下 31～50岁 51～70岁 71岁及以上 H
Pn 构成比
（%）n 构成比
（%）n 构成比
（%）n 构成比
（%）皮肤 头颈部 3 0.4 8 0.7 41 3.4 14 1.2 255.735 < 0.001* 肢端 34 2.8 297 24.7 308 25.6 45 3.7 躯干 1 0.1 6 0.5 45 3.7 13 1.1 四肢/肢端除外 2 0.2 8 0.7 77 6.4 29 2.4 黏膜 口腔 0 0.0 3 0.2 15 1.2 2 0.2 内脏 0 0.0 1 0.1 18 1.5 2 0.2 鼻腔副鼻窦 1 0.1 4 0.3 14 1.2 54 4.5 生殖系统 0 0.0 0 0.0 20 1.7 1 0.1 胃肠 1 0.1 3 0.2 43 3.6 3 0.2 眼结膜/脉络膜 0 0.0 1 0.1 20 1.7 1 0.1 不明 0 0.0 13 1.1 50 4.2 2 0.2 总计 42 3.7 344 28.6 651 54.2 166 13.9 *P < 0.05。 2.4 不同时间段黑色素瘤确诊例数变化
根据诊断时间将患者分成3组（每5 a为1组），发现黑色素瘤就诊率呈逐渐上升趋势，提示笔者应加强对黑色素瘤的诊治，见表4、图2。
图 2 2007年～2021年云南省肿瘤医院黑色素瘤确诊例数变化Figure 2. Changing trends in the number of diagnosed melanoma cases in Yunnan Cancer Hospital from 2007 to 2021表 4 2007年～2021年云南省肿瘤医院黑色素瘤确诊例数变化趋势Table 4. Changing trends in the number of diagnosed melanoma cases in Yunnan Cancer Hospital from 2007 to 2021时间段（年） n 百分比（%） 2007~2011 220 18.3 2012~2016 395 32.8 2017~2021 588 48.9 总计 1203 100 2.5 云南省肿瘤医院确诊头颈部黑色素瘤情况
该时间范围，云南省肿瘤医院收治头颈部皮肤（65例）和黏膜（115例）黑色素瘤共180例，占全身黑色素瘤的15%（180/1203）；头颈部黏膜黑色素瘤占头颈部黑色素瘤的63.9%（115/180），全身其他部位黏膜黑色素瘤占其他部位黑色素瘤的9.7%（93/958）。头颈黏膜黑色素瘤占全身黏膜黑色素瘤的55.3%（115/208）。
3. 讨论
黑色素瘤是一种罕见恶性肿瘤，恶性程度高，近年来发病率增长较快，每年新发病例约2万例，是我国发病率增长最快的恶性肿瘤之一[6]。黑色素瘤的原发灶部位广泛，不同组织类型的黑色素瘤所采取的诊治措施也不尽相同。早期发现黑色素瘤是降低其死亡率的关键[7]，疾病分期和病灶范围是影响黑色素瘤预后最重要的指标[3, 8]。这进一步说明早发现、早诊断、早治疗极端重要。
黑色素瘤的发病机制尚不明确，目前认为它由遗传和环境等因素相互作用所引起[7]，其进展是由多基因参与、多通路协同作用的结果[9]。紫外线辐射通过损伤DNA、增加基因突变频率成为黑色素瘤发生的主要环境风险因素[10]。黑色素瘤家族史是相关性最强的遗传危险因素[11]，在20%～40%易患黑色素瘤家族中，存在CDKN2A基因突变[12]。BRAF、NARS、KIT是最常见的突变基因[9, 13]，与黑色素瘤细胞增殖、生存、侵袭有关的信号传导通路主要是MAPK[14]和PI3K通路[15]。我国黑色素瘤主要发生于肢端和黏膜等非紫外线暴露部位[16]，发病与基因突变关系更为密切。中国黑色素瘤患者发生BRAF基因突变率为25.9%，其中87.3%为V600E突变；发生CKIT基因突变率为10.8%、扩增率为7.4%[6]。
云南省肿瘤医院是云南省唯一一所三级甲等肿瘤专科医院，接收来自云南全省的患者，其疾病构成谱可大概反映云南省黑色素瘤的疾病构成。本研究受主、客观因素影响，具有一定的局限性，但本研究样本量较大、时间跨度长，仍然具有较高代表性，也在一定程度上保证了研究结果的可靠性。
本资料显示：2007年1月至2021年12月于云南省肿瘤医院确诊黑色素瘤的患者1 203例，31～70岁年龄段患病人数最多，达到82.8%。且近15a来云南省肿瘤医院收治的黑色素瘤病例呈逐渐上升趋势，提示笔者需要高度重视黑色素瘤的防治。
黑色素瘤最常发生于皮肤，其次为黏膜，原发灶不明（病理诊断提示转移性黑色素瘤）者少见。
原发于皮肤的黑色素瘤最常见于肢端皮肤，占全身皮肤黑色素瘤的73.5%（684/930）；四肢皮肤黑色素瘤合计占全身皮肤黑色素瘤的86%，提示笔者应该重点关注四肢皮肤黑色素瘤。其中，肢端皮肤黑色素瘤多见于男性（P < 0.05），可能与男性较女性参与更多户外活动相关[2]，提示对于云南等高紫外线劳动环境的地区，加强劳动过程中紫外线防护对于降低暴露部位皮肤黑色素瘤发病率至关重要。
原发于黏膜的黑色素瘤最常见于鼻腔鼻窦黏膜，占全身黏膜黑色素瘤的35.1%（73/208）；其次为胃肠黏膜，占全身黏膜黑色素瘤的24%（50/208）。与既往研究相似，以直肠肛管黏膜黑色素瘤最为常见[17]。生殖系统黏膜黑色素瘤多见于女性（P < 0.05），主要发生于阴道黏膜，其次为宫颈黏膜。在黏膜黑色素瘤整体中，头颈黏膜黑色素瘤占全身黏膜黑色素瘤的55.3%。头颈部黏膜黑色素瘤占头颈部黑色素瘤63.9%（115/180），而全身其他部位黏膜黑色素瘤占其他部位黑色素瘤的9.7%（93/958），提示头颈发生黏膜黑色素瘤的比例为其他部位黏膜黑色素瘤发病率的5.58倍。提示笔者应特别加强头颈黏膜黑色素瘤的诊治。
尽管黑色素瘤总体发病率不高，但我国人口基数大，黑色素瘤患者绝对人数仍多，且预后极差。云南紫外线强度高，应加强暴露部位的防护以减少皮肤黑色素瘤的发生；对于头颈部黑色素瘤，应特别加强黏膜黑色素瘤的诊治。
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图 1 4NQO诱导C57BL/6舌粘膜癌变（HE，×200）
A：0周，正常粘膜；B：12周，中度不典型增生；C：28周，鳞癌。
Figure 1. The lingual carcinogenesis in C57BL/6 mice induced by 4NQO （HE，×200）
图 2 人正常舌黏膜和异常增生（×200）
A：正常舌黏膜；B：舌黏膜异常增生。
Figure 2. Human normal tongue mucosa and moderate dysplasia. magnification of （×200）
图 3 舌黏膜癌变基因体甲基化构成
MeDIP-score < 4.19定义为未甲基化，介于4.19～41.01定义为部分甲基化，> 41.01为甲基化。
Figure 3. Numbers of methylated，partially methylated and unmethylated gene bodies
图 4 人异常增生舌组织中CYLD的mRNA表达较正常粘膜降低
Figure 4. Expression of CYLD mRNA downregulated in human dysplasia mucosa compared to normal mucosa
图 5 人舌粘膜、异常增生CYLD基因体甲基化飞行质谱检测结果
甲基化圆点图标尺颜色越浅代表甲基化程度越低。基因的序列标尺上方是碱基位置，下方是CpG的标识及大致位置。L12～16为异常增生舌黏膜，L17～21为人正常舌黏膜。
Figure 5. The MassaARRAY results of CYLD gene body methylation
表 1 基因体甲基化异常的差异表达基因
Table 1. Differentially expressed genes with positive correlation to gene body methylation
序号 癌前vs正常 癌变vs正常 癌变vs癌前 上调 下调 上调 下调 上调 下调 1 Gm12657 Ddx25 Hps3 Irf3 Odf2 Msln 2 Rnf14 Cyld Mreg Zfp939 Uba1 Slc35a5 3 Rsbn1l 2610507B11Rik Gm12657 Tesk1 2010012O05Rik Csprs 4 Celf2 5330434G04Rik Edaradd Gab3 Wdyhv1 Ywhaz 5 Mapk3 Dclk2 Gm7120 Ntng1 Cdca5 Ada 6 Rdh9 Ecsit Pemt Sema3b Fbxo24 Bpifb6 7 Ache Il20 Plekhb2 Ptges3l Tmem37 A730008H23Rik 8 Stard10 AI846148 Nop14 Bace2 Spp1 Stard10 9 Klhl7 Iars2 Hivep1 Gm3086 Plekhg4 Casc4 10 Mfsd1 Gm3086 Fam98b Kcnn4 Fam81a Igsf5 11 Arf4 Zfp763 Oas2 a Fubp1 12 Zbtb18 Pptc7 Tbx22 Ewsr1 Cdkl5 13 Kcnj2 Cdc42se2 Mfsd2a Fut2 14 Ap1s2 Slfn4 Shc4 H2-T9 15 Setd1b Npl Tspan32 16 Cyth3 Exoc6 Car4 17 Nek1 Son Mapkapk2 18 Cpn1 Rsbn1l Slc25a39 19 Aqr Nacad Eif5a 20 Abca5 Ddx20 Bace2 21 Pomgnt1 Atf1 Hira 22 Nfkb1 Vps37c Azgp1 23 Kalrn Nfkbiz Hmgcll1 24 Dsg1b Prkaa1 Cfl1 25 Sec62 Pik3c2a Mamstr 26 Camk2a Ankfn1 Celf2 27 Ube2q2 Mfsd1 Gfra4 28 Ppp4r2 Cdk1 Papss2 29 Lrrc58 Bcas2 Smurf2 30 Tnpo1 Rad21 Cat 31 Zfp763 Zfand1 Myoz3 32 Il2rg Mmgt1 Tmed3 33 Slc25a39 Trip13 Prb1 34 Nfe2l1 Dyrk1b 35 Tob1 Prrt2 36 H2-T10 37 Gyk 38 Tmem55b 39 Zfp386 40 Akr1b3 41 Tnfaip6 
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