Molecular Characterization of the VP1 Region of Coxsackievirus 16 in Kunming，Yunnan in 2022
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摘要:
目的 对昆明市某医院2022年从手足口病患儿分离的柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus A16，CVA16）的全VP1基因区分子特征分析。 方法 对昆明市某医院2022年从手足口病（hand foot mouth disease，HFMD）患儿200份临床样品粪便标本进行处理，分别通过RD细胞和Vero细胞分离，对经3次培养后仍产生细胞效应（cytopathogenic effect，CPE）的细胞培养液提取病毒核酸，然后用通用引物222/224经RT-PCR扩增并测序，序列经BLAST比对确定其血清型，对鉴定为柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus A16，CVA16）的再用特异引物CA16VP1F/CA16VP1R扩增其全VP1区并测序和拼接。下载CVA16病毒标准序列，采用Geneious 5.4.1和MEGA 6.05等软件对本研究CVA16的全VP1区的核苷酸和氨基酸序列分析。 结果 经鉴定后共检出22株从Vero细胞分离CVA16和6株RD细胞分离的CVA16毒株，进一步通过特异引物扩增获得21株可用的CVA16 VP1全长序列，基于全VP1基因系统进化分析，这21株CVA16全属于B1a基因型。21株CVA16全长VP1基因之间的核苷酸和氨基酸序列同源性均较高，分别为91.9%～99.6%和89.2%～99.3%；与中国CVA16 B1a基因型的其他株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.7%～96.3%和89.2%～97.0%。与CVA16 B1b其他参考株对比，其核苷酸和氨基酸序列同源性分别在84.3%～87.2% 和89.2%～97.0%。与其它CVA16的B1a基因亚型相比较发现21个氨基酸位点出现变异。 结论 2022年中国云南省昆明某医院引起HFMD的CVA16毒株属于B1a基因型，应继续监测以明确其流行特征。 -
关键词:
- 柯萨奇病毒A组16型 /
- 全VP1基因 /
- 序列分析
Abstract:Objective To analyze the molecular characteristics of the whole VP1 gene region of coxsackievirus A16 （CVA16） isolated from children with hand, foot and mouth disease （HFMD） in 2022 from a hospital in Kunming, Yunnan. Methods Two hundreds fecal specimens of HFMD clinical samples from 2022 in a hospital in kunming, were processed and isolated by RD cells and Vero cells, respectively, and viral nucleic acids were extracted from the cell cultures that still produced cytopathogenic effect （CPE） after three times of incubation, then amplified and sequenced by RT- PCR using universal primers 222/224, and sequenced, and the sequences were compared by BLAST to determine the serotypes, and then the full VP1 region of CVA16 was amplified with specific primers CA16VP1F/CA16VP1R , then sequenced and spliced. The standard sequences of CVA16 virus were downloaded, and the nucleotide and amino acid sequences of the whole VP1 region of CVA16 in this study were analyzed using software such as Geneious 5.4.1 and Mega 6.05. Results 22 strains of CVA16 isolated from Vero cells and 6 strains isolated from RD cells were detected by RT-PCR using universal primers, and the available sequences of 21 strains of full-length CVA16 VP1 region were further amplified by the specific primers of CVA16, and the nucleotide and amino acid sequences of the 21 strains of full-length CVA16 VP1 genes were highly homologous to each other, with 91.9%～99.6% and 89.2%～99.3%, respectively. The nucleotide and amino acid sequence homology with other strains of the chinese B1a genotype ranged from 89.7%～96.3% and 94.6%～99.0%, respectively; and nucleotide and amino acid sequence homology was in the range of 84.3%～87.2% and 89.2%～97.0%, respectively, when compared with the other reference strains of B1b. The phylogenetic analysis showed that all 21 CVA16 strains belonged to the B1a genotype. The 21 mutations were found by compared with that of other B1a strains. Conclusions The CVA16 strain that caused HFMD in a hospital in Kunming, Yunnan Province, China in 2022 belongs to the B1a genotype. Surveillance should be continued to clarify its epidemiological characteristics. -
Key words:
- Coxsackievirus A16 /
- Complete VP1 gene /
- Sequence analysis
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柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus A16，CVA16） 属于肠道病毒A组病毒，是引起手足口病（hand foot mouth disease，HFMD）的主要病原体之一[1−2]。CVA16是单股正链无包膜RNA病毒，其基因组全长约7400个核苷酸，包含1个5'端非编码区、1个单独开放阅读码区以及1个3'端非编码区，其读码区编码P1、P2和P3前蛋白，随后分别被切割成VP1～VP4、2A～2C和3A～3D[3]。根CVA16分型标准，依据 VP1 基因序列，可将 CVA16毒株分为A和B 2个基因型，其中B基因型可进一步分为3个基因亚型（B1a～B1c）[4−6]。除HFMD外，CVA16常引起疱疹性咽峡炎和无菌性脑炎，个别也可导致死亡[7]。近年来，中国大陆对CVA16的监测发现表明B1b和B1a基因亚型共同流行[8−9]，其中以B1b为优势[10−11] 。本研究对云南省昆明市2022年HFMD分离到CVA16病毒全VP1区序列扩增、拼接和分析，了解昆明地区的流行的CVA16病毒分子特征，可为我国HFMD预防和控制提供一定依据。
1. 材料与方法
1.1 检验标本
200份临床标本来自2022年5月至7月昆明市某医院临床诊断为HFMD的患儿粪便（-80 ℃冻存保存） 。本研究已通过昆明市妇幼保健院医学伦理委员会审核批准（2022-02-17）。
1.2 主要试剂
RT-PCR试剂盒：PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2（大连宝生物工程有限公司）；病毒RNA提取试剂盒：AxyPrep Body Fluid viral DNA/RNA kit （爱思进生物技术（杭州）有限公司）；其他试剂均为分析纯。
1.3 病毒分离培养
取1 g粪便，加入5 mL PBS振荡混匀，2000r/min 离心4 ℃ 30 min，上清通过0.45 μm滤器分别种到人横纹肌肉瘤细胞（human rhabdomyosarcoma，RD）和Vero细胞，并置于5% CO2 37 ℃培养。当出现细胞病变效应（cytopathogenic effect，CPE）时收集，冻融3次，盲传3次后仍产生细胞病变效应，判定该样品为阳性。
1.4 病毒核酸提取和肠道病毒鉴定
将病毒分离获得的阳性样品（细胞培养上清）按AxyPrep Body Fluid viral DNA/RNA kit操作步骤提取病毒核酸，根据文献以提取RNA为模板，用通用引物222和224进行肠道病毒部分VP1扩增和测序，并将序列通过Blast比对确定其血清型（核苷酸序列大于75%为相同血清型）[9]。
1.5 CVA16全长VP1基因的扩增和测序
将鉴定为CVA16样品，并基于课题组前期设计CVA16引物CA16VP1F：5′ GGCYTTGGCAGCAGCTCARG 3′ 和CA16VP1R ：5′ ACCACCCTATAGTTGCCCAC-3′ 。按PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2说明书进行试验，其反应体系为：2×reaction buffer 25 μL，RT-PCR MIX 2 μL， CVA16VP1F 20 pmol，CVA16VP1R 20 pmol，RNA模板 5 μL，加水至50 μL。反应条件为：先逆转录为cDNA，50 ℃ 30 min，变性：94 ℃ 2 min；然后以94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，和72 ℃ 1 min为35个循环。最后经1%琼脂糖凝胶电泳判为，阳性即送昆明擎科生物技术有限公司测序。
1.6 序列分析
利用NCBI BLAST对所测定的节段序列进行比对和拼接；利用Mega 6.06软件对CVA16分离株和GenBank中登录的21株CVA16，通过邻近法构建全VP1基因核苷酸系统进化树，并与21个参考株的序列进行比较。
2. 结 果
2.1 CVA16 毒株分离培养与鉴定
从 2022年HFMD临床样品经细胞分离培养并经RT-PCR、测序和Blast比对发现22株和6株CVA16分别分离于Vero细胞和RD细胞。其中6株RD细胞分离的CVA16与相对应Vero细胞分离的样品一致。21株昆明CVA16属于B1a 与最近中国大陆流行的B1a在同一分枝，见图1。这提示本次分离CVA16株为中国流行株。
图 1 CVA16全VP1区推测氨基酸序列的比对Figure 1. Comparison of putative amino acid sequences of the full VP1 region of CVA16 strains2.2 基于全VP1基因的系统进化分析
为了确定CVA16的遗传特征，经比对和序列拼接全VP1基因序列，21株CVA16的全VP1序列可用，基因登录号为OQ942646-OQ942666。通过MEGA 6.05软件分析发现，21株昆明CVA16属于B1a 与最近中国大陆流行的B1a在同一分枝，见图2。这提示本次分离CVA16株为中国流行株。
图 2 基于全VP1区核苷酸序列的CVA16的系统进化树Figure 2. Phylogenetic tree based on full VP1 sequences of CVA16 strains2.3 CVA16VP1基因核苷酸序列的同源性
本次分离的21株CVA16的全VP1的核苷酸序列同源性在91.9%～99.6%之间， 而KM199/YN/CHN/2022和KM200/YN/CHN/2022株之间同源性最低（91.9%）。KM156/YN/CHN/2022和KM157/YN/CHN/2022株之间最高（99.6%）；与CVA16其他B1a参考病毒的核苷酸序列同源性为89.7%～96.3%，其中与Tainan/5079/98（AF177911） 分离株较低；与CVA16其他B1b病毒株的核苷酸序列同源性在84.3%～87.2%之间。
2.4 CVA16 VP1氨基酸序列的同源性
本次分离的21株CVA16 VP1之间的氨基酸序列同源性较高，在89.2%～99.3%之间；与CVA16其他B1a病毒株的氨基酸序列同源性为89.2%～99.1%，其中与Tainan/5079/98株最低；与CVA16其他B1b病毒株的氨基酸序列同源性在89.2%～97.0%之间。
2.5 CVA16 VP1氨基酸突变分析
本次分离的21株 CV-A16 毒株 全长VP1 基因均为 891 bp，推测的氨基酸为297 个，符合CVA16VP1氨基酸标准。VP1 氨基酸序列分析结果表明，2022年 21 株病毒与其它CVA16的B1a基因亚型发现总计21 个氨基酸位点出现变异，但在164和251位点与2021年分离株CVA16-2021-71-TY-SX-CHN相比较未发生变异，但在第25位点上发生变异（A25V） 。 CVA16的B1b 基因亚型病毒易变异位点（第 23位）未发现变异。
3. 讨论
3.1 系统进化分析
自2008年阜阳HFMD暴发和2016年EV71灭活疫苗广泛接种以来，CVA16仍为引起中国大陆HFMD的主要病原体之一[12−17]。并且在HFMD死亡病例中，CVA16仍占优势地位[18]。由于CVA16的VP1编码区包含了病毒主要的中和抗原决定簇和比较保守，目前普遍以VP1基因作为CVA16分子流行病学调查和变异分析。目前根据CVA16VP1基因序列分析，发现中国大陆流行的CVA16基因型稳定，主要为 B1a 和 B1b亚：如在 2019 年冬季青岛地区CVA16的B1a 与 B1b亚型同时流行[19]，陕西省2019年手足口病病原以 CVA16 为流行优势病原，其基因亚型以B1a 和B1b 共存[20]。在江苏省2009—2017年[21]，2018—2019年北京市[22]和安徽省2018—2019[23]引起HFMD 的CVA16为B1a和B1b亚型共同循环，但B1b亚型占为优势，但安徽省2019年CVA16 B1a基因亚型毒株占比高于2018 年[23]。而昆明市2021 年HFMD 病例的 CVA16 优势亚型为 B1a 亚型，极少量属于 B1b 亚型[24]。而本研究是基于全 VP1 基因序列系统进化分析发现，2022 年云南省昆明地区分离到的全部CVA16 流行株均为 B1a 基因亚型，未检测到CVA16的 B1b基因亚型病毒，这与云南省昆明地区CVA16 B1a 和B1b基因亚型共同流行报道不一致。另外也发现2022年云南省保山市引起手足口病的CVA16属于B1a 亚型，未检测到CVA16的B1b基因亚型病毒[25]。但由于目前CVA16序列数有限，目前尚不清楚B1a是否也已成为云南省或昆明地区流行期间的优势基因型或以B1b转化为B1a亚型单独流行模式，这需要进一步监测以证实。
3.2 VP1区氨基酸变异
CVA16属于RNA病毒，其复制缺乏校正功能，容易突变，而变异是其进化的重要机制之一。本次分离株的VP1编码区的氨基酸出现多个突变，这符合与其易变异的特点。这也提示CVA16 B1a毒株在环境压力下也在不断的进化。另外，以前研究认为B1a毒株存在 VP1-164T251V型和 VP1-164K/N251I两种形式[24]。 本研究对2022年昆明的21株分离株发现均为VP1-164K/251I 流行模式。这与近年流行株中主要呈VP1-164K/251I 氨基酸模式相一致[25]。而VP1-164位点位于中和抗原表位，这提示该位点该流行的基因型的抗原位点保守，未发生变异。这与早期B1a毒株不同（VP1 164T）。因此，本次研究的 CVA16 VP1氨基酸位点变异是否引起 CVA16 流行株抗原性的变化，还有待研究。并且这些变异是毒株本身的变异位点，还是由于病毒在适应性传代过程中发生突变也需进一步研究。
3.3 细胞敏感性分析
本研究中，200份HFMD样品经巢式RT-PCR、测序和比对，共检查到54份CVA16（27.0%），而细胞分离仅为22株（11.0%），这也进一步验证细胞分离不如RT-PCR敏感。同时也发现CVA16对Vero细胞要比RD细胞敏感，这提示分离CVA16毒株优先选择Vero细胞。
综上所述，需要继续监测CVA16 VP1的变异情况，对CVA16全基因序列分析不仅利于掌握中国大陆CVA16的进化，也可为相关疾病的防控和疫苗的研究提供一定参考。
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图 1 CVA16全VP1区推测氨基酸序列的比对
Figure 1. Comparison of putative amino acid sequences of the full VP1 region of CVA16 strains
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