MicroreaderTM 23HS Plex ID System中23个常染色体STR基因座在中国北方汉族人群中多态性调查
doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20240723
Polymorphism Investigation of 23 Autosome STR Loci in the MicroreaderTM 23HS Plex ID System in Han Population in Northern China
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摘要:
目的 评价MicroreaderTM 23HS Plex ID System试剂盒中包含的23个常染色体STR基因座在中国北方汉族人群中等位基因频率分布,获得群体遗传数据,探究其在法医学中的应用价值。 方法 使用MicroreaderTM 23HS Plex ID System试剂盒对中国北方汉族人群548例无关样本DNA进行检测,收集分型数据,计算各基因座的等位基因频率、样本的杂合度(heterozygosity,H) 、这些常染色体STR基因座的多态信息含量(polymorphism information content,PIC)、个体识别力(power of discrimination,DP)和非父排除率(probability of paternity exclusion,PE)并使用统计软件对各基因座是否符合Hardy-Weinberg平衡进行检验;同时对MicroreaderTM 23HS Plex ID System的累积个体识别能力(CDP)和累积非父排除率( CPE)进行计算。 结果 在548例无关样本中23个STR基因座共计检出260个等位基因,等位基因频率为0.0009~0.5902,H为0.611~0.885,PIC为0.577~0.864,DP为0.815~0.973(平均DP为0.922),PE为0.089~0.406,CDP=1-3.663×10-27,CPE=1-2.668×10-16,所有基因座等位基因的分布符合Hardy-Weinberg平衡。 结论 MicroreaderTM 23HS Plex ID System的23个基因座在中国北方汉族人群中具有良好的多态性,在法医学个人识别、群体遗传学研究、亲子鉴定,特别是复杂亲缘关系鉴定中应用价值较高。 Abstract:Objective To obtain the distribution of allele frequency and population genetic data of 23 autosomal STR loci contained in the MicroreaderTM 23HS Plex ID System kit in the Han population of northern China, and explore its application value in forensic medicine. Methods The MicroreaderTM 23HS Plex ID System kit was used to detect the DNA of 548 unrelated samples which from the Han population in northern China. Then, the allele frequencies, heterozygosity(H) in the samples, polymorphism information content(PIC), power of discrimination(DP), and probability of paternity exclusion(PE) were calculated and Hardy-Weinberg equilibrium was tested on each locus based on the genotyping data of 548 samples we collected. The cumulative individual identification ability (CDP) and cumulative non-paternity exclusion rate (CPE)of the MicroreaderTM 23HS Plex ID System were also calculated. Results A total of 260 alleles were detected in 548 unrelated samples from 23 STR loci which conformed to Hardy-Weinberg equilibrium. And the alleles frequencies ranged from 0.0009 to 0.5902, H ranged from 0.611 to 0.885, PIC ranged from 0.577 to 0.864, DP ranged from 0.815 to 0.973 (mean DP was 0.922) and PE ranged from 0.089 to 0.406. At the same time, the CDP of MicroreaderTM 23HS Plex ID System was 1-3.663×10-27 and CPE was 1-2.668×10-16. Conclusion The 23 loci of MicroreaderTM 23HS Plex ID System have a good polymorphism in the north Chinese Han population, and have high application value in population genetics research, forensic personal identification, paternity testing and complex kinship identification. -
Key words:
- Forensic genetics /
- Genetic polymorphism /
- STR loci
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肝内胆管癌是一种来源于肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤,具有高度恶性、高病死率、低诊断率特点,严重威胁患者生命健康[1-2]。我国胆管癌发病率为0.01%~0.46%,且调查显示其占恶性肿瘤总数的2%,好发于中老年人。由于胆管癌早期容易侵袭周围组织器官以及出现远处转移是预后差、手术切除率低的根本原因,目前诊断和治疗水平尚无取得突破性进展,且具体病机制尚未完全明确,而从肿瘤生物学角度寻求更好的预防以及治疗方法是研究热点[3-4]。近年来研究发现,细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及NF-κB与恶性肿瘤发生、发展密切相关[5-6]。髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)是近年来发现的具有免疫调节功能的一类免疫细胞亚群,在自身免疫、炎症及肿瘤中发挥重要作用。本文研究旨在探讨ICAM-1、MMP-9及NF-κB在胆管癌中的表达及与外周血中CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC的关系。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取昆明医科大学附属甘美医院于2017年12月至2019年12月收治的胆管癌患者60例研究对象,均行根治性手术治疗,且均经病理学证实,患者均未采取抗肿瘤治疗,及3个月未使用免疫抑制剂。60例患者中,男性38例,女性22例;年龄36~78岁,平均(58.39±10.21)岁;临床分期:I~II期19例,III~IV期41例;病理分级:低分化34例,中高分化26例;淋巴结转移21例。经昆明医科大学附属甘美医院伦理委员会审查同意开展研究。
诊断标准:依据《胆管癌诊断与治疗--外科专家共识》[7]关于肝内胆管癌诊断标准,临床表现出现腹部不适、腹痛、上腹肿块、乏力、恶心、发热等,经超声检查证实肝内局限性肿块。纳入标准:(1)符合肝内胆管癌诊断标准,均行根治性手术治疗,且经病理学证实为肝内胆管癌;(2)均未采取抗肿瘤治疗;(3)3个月未使用免疫抑制剂。排除标准:(1)其他类型胆管癌及合并其他恶性肿瘤者;(2)临床资料和随访资料不完整。
1.2 主要试剂和仪器
主要试剂:鼠抗人ICAM-1抗体,兔抗MMP-9单克隆抗体,兔抗NF-κB单克隆抗体,均购自武汉博士德生物试剂公司。主要仪器:美国BD公司流式细胞仪。
1.3 方法
(1)免疫组织化学技术检测ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白及NF-κB蛋白:取患者癌组织和癌旁正常组织标本,经10%福尔马林液固定,石蜡包埋,4 μm厚连续切片,按照免疫组化SP法进行实验操作,检测ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白及NF-κB蛋白,以PBS代替一抗作为阴性对照,试剂公司提供的阳性着色图片为阳性对照。于光学显微镜下观察染色结果,着色的结果判定采用半定量法,首先以细胞着色强弱度评分[1]:以无着色者为计分0分,以浅黄色者为计分1分,以棕黄色者计分为2分,以棕褐色者计分为3分。且记录镜下阳性细胞数所占的百分比:无阳性细胞者为计分0分,阳性细胞≤10%者为计分1分,阳性细胞数为计分11%~50%者为计分2分,在51%~75%者为计分4分。再按照上述两者所得评分相乘结果划分等级:其中以积分≤3分即为“-”,以积分3~5分为“+”,以积分5~8分为“++”,以积分9~12分则为“+++”[1]。
(2)流式细胞术检测外周血中CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC比例:所有研究对象均于入院第2 d清晨空腹采集患者3 mL外周静脉血,以肝素抗凝,取抗凝全血100 μL,以红细胞裂解液充分裂解后,根据试剂盒说明书量取不同荧光标记抗体直接标记,对外周血 CD14、CD11b和HLA-DR抗原表达检测,且标记同型对照,放置于4 ℃下避光孵育30 min,采用流式缓冲液洗涤2次后上机检测。圈取CD14+CD11b+的细胞群,再选择HLA-DR-细胞群即为MDSC。
1.4 观察指标
(1)观察胆管癌组织与癌旁组织ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白和NF-κB蛋白表达;(2)观察不同病理特征ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白和NF-κB蛋白表达;(3)观察不同病理特征外周血中CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC比例;(4)分析ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白和NF-κB蛋白表达与外周血中CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC比例相关性。
1.5 统计学处理
采用统计学软件SPSS 22.0进行数据处理分析,计数资料比较采用χ2检验,以率表示,计量资料比较采用t检验,以均数±标准差表示。采用Pearson相关性分析 ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白及NF-κB蛋白表达与CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC比例相关性。以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 胆管癌组织与癌旁正常组织ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白和NF-κB蛋白表达比较
胆管癌组织ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白和NF-κB蛋白表达阳性率均高于癌旁正常组,差异均有统计学意义(P < 0.05),见 表1和图1~图3。
表 1 胆管癌组织与癌旁正常组织ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白和NF-κB蛋白表达比较[n(%)]Table 1. Comparison of ICAM-1 protein, MMP-9 protein and NF- κ B protein expression between cholangiocarcinoma and adjacent normal tissues [n(%)]组别 n ICAM-1蛋白阳性率 MMP-9蛋白阳性率 NF-κB蛋白阳性率 胆管癌组织 60 41(68.33) 38(63.33) 47(78.33) 癌旁正常组织 60 11(18.33) 6(10.00) 8(13.33) χ2 - 30.543 36.746 51.054 P - < 0.001* < 0.001* < 0.001* *P< 0.05。 2.2 不同病理特征ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白、NF-κB蛋白以及CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC表达比较
不同性别、年龄、病理分级和淋巴结转移ICAM-1蛋白表达比较无明显差异(P > 0.05);III~IV期ICAM-1蛋白表达阳性率高于I~II期( P < 0.05)。不同性别、年龄、病理分级和临床分期MMP-9蛋白表达比较无明显差异( P > 0.05);淋巴结转移MMP-9蛋白表达阳性率高于无淋巴结转移( P < 0.05)。不同性别、年龄、病理分级和淋巴结转移NF-κB蛋白表达比较无明显差异( P > 0.05);III~IV期NF-κB蛋白表达阳性率高于I~II期( P < 0.05)。不同性别、年龄、病理分级和淋巴结转移CD14 +CD11b+HAL-DR-MDSC比例比较无明显差异(P > 0.05);III~IV期CD14 +CD11b+HAL-DR-MDSC比例高于I~II期(P < 0.05),见 表2。
表 2 不同病理特征ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白、NF-κB蛋白以及CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC表达比较[n(%)]Table 2. Comparison of ICAM-1 protein MMP-9 protein NF-κB protein and NF-κB protein expression in different pathological features [n(%)]病理特征(例) ICAM-1
蛋白阳性χ2/P MMP-9
蛋白阳性χ2/P NF-κB
蛋白阳性χ2/P CD14+CD11b+HAL-DR−
MDSC比例(%)t/P 性别 男性(38) 28(73.68) 1.371/0.242 24(63.16) 0.001/0.970 32(84.21) 1.271/0.260 3.19 ± 0.92 0.243/0.809 女性(22) 13(59.09) 14(63.64) 15(68.18) 3.10 ± 0.95 年龄 > 60岁(26) 19(73.08) 0.447/0.490 19(73.08) 1.876/0.171 21(80.77) 0.160/0.689 3.23 ± 0.98 0.739/0.463 ≤60岁(34) 22(64.71) 19(55.88) 26(76.47) 3.05 ± 0.90 临床分期 I~II期(19) 6(31.58) 17.358/< 0.001* 9(47.37) 3.052/0.081 9(47.37) 13.152/< 0.001* 2.32 ± 0.83 6.069/< 0.001* III~IV期(41) 35(83.37) 29(70.73) 38(92.68) 3.97 ± 1.04 病理分级 低分化(34) 26(76.47) 2.401/0.121 23(67.65) 0.629/0.428 24(70.59) 2.773/0.096 3.20 ± 0.89 0.488/0.627 中高分化(26) 15(57.69) 15(57.69) 23(88.46) 3.08 ± 1.01 淋巴结转移 有(21) 15(71.43) 0.143/0.705 15(71.43) 7.959/0.005* 15(71.43) 0.390/0.533 3.28 ± 1.02 1.590/0.117 无(39) 26(66.67) 13(33.33) 32(82.05) 2.89 ± 0.84 *P < 0.05。 2.3 ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白及NF-κB蛋白表达与CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC比例相关性
ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白及NF-κB蛋白表达与CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC比例呈线性正相关,见表3。
表 3 ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白及NF-κB蛋白表达与CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC比例相关性Table 3. Expression of ICAM-1 protein, MMP-9 protein and NF- κB protein and its correlation with the proportion of CD14 + CD11b + HAL-DR-MDSC蛋白 CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC比例 r P ICAM-1蛋白 0.819 <0.001* MMP-9蛋白 0.528 0.010* NF-κB蛋白 0.736 0.002* *P< 0.05。 3. 讨论
胆管癌是常见的一种胆道恶性肿瘤,通常情况下其症状出现晚,且具有较高发病率和病死率,严重威胁患者生命健康[7-9]。因此,采取及时有效的诊断和治疗胆管癌方法尤为重要。
ICAM-1人体正常组织中表达极低,仅某些淋巴细胞、上皮细胞少量表达。ICAM-1主要通过街道肿瘤细胞与白细胞黏附,导致原发肿瘤分离和坏死,增加转移和浸润;血循环中瘤细胞/白细胞结合体,容易在毛细血管床滞留着床[10]。通常情况下,高表达ICAM-1瘤细胞经人淋巴细胞功能相关抗原(LFA-1)结合,从而抑制免疫细胞对肿瘤细胞的杀灭和识别[11]。此外,ICAM-1参与肿瘤与基质的粘附,以及促进癌细胞生长和转移,并且与胆管癌预后关系紧密[12]。本文研究发现,胆管癌患者胆管癌组织中ICAM-1高表达,且于临床分期密切相关。基质金属蛋白酶(MMPs)是形成和影响肿瘤微环境的一种蛋白水解酶家族,其中MMP-9是MMPs中分子量最大成员。MMP-9最初主要以酶原形式分泌而产生,而其被激活后形成IV型胶原酶,使肿瘤表面细胞外基质和基底膜降解、破坏,且可使IV、V、VII和X型胶原降解,以及使肿瘤细胞沿缺失的基膜浸润周围,而造成肿瘤细胞的侵袭和转移,进而促进演变恶性肿瘤[13-15]。研究报道显示,MMP-9的阳性表达与胆管癌组织分化程度、临床分期和转移复发呈正相关[16]。而本文研究发现,胆管癌患者胆管癌组织中MMP-9高表达,且与淋巴结转移密切相关,而与上述研究存在一些差异,其原因可能是由于本文样本量相对较少,还需后续增加样本量进一步研究。NF-κB是细胞内重要的一种转录因子,通常于静息状态下以异源或同源二聚体形式与抑制蛋白结合存在于细胞质中,当细胞受外源性刺激,抑制蛋白与NF-κB剥离,进入细胞核,从而发挥其调控作用[17]。研究报道显示,NF-κB是肿瘤与连续持续炎症的重要中介因子[18]。此外,研究报道显示,NF-κB在胆管癌组织中呈过表达,以及其在肿瘤组中表达水平高于正常组与胆管结石炎症组[19]。本文研究发现,胆管癌患者胆管癌组织NF-κB高表达,且与临床分期密切相关。MDSC是近年来研究发现的具有免疫调节功能一种免疫细胞亚群,能够通过多种途径抑制机体的免疫应答反应且在移植免疫、炎症、肿瘤及自身免疫中发挥重要作用。同时,MDSC限制肿瘤免疫治疗的效果,且参与肿瘤的免疫逃逸。研究报道显示,肿瘤患者外周血中免疫抑制细胞的比例增加,且可促进肿瘤的免疫逃逸[20]。本文研究发现,胆管癌患者中外周血中CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC比例升高,且与临床分期密切相关。
综上所述,ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白及NF-κB蛋白表在胆管癌中高表达,外周血中CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC比例升高,且ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白及NF-κB蛋白表达与CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC比例呈线性正相关。
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表 1 23个常染色体STR基因座等位基因频率分布(n = 548)(1)
Table 1. Allele frequency distribution of 23 autosomal STR loci (n = 548)(1)
D10S2325 D11S4463 D13S305 D16S3391 D19S400 基因型 频率 基因型 频率 基因型 频率 基因型 频率 基因型 频率 6 0.0138 9 0.0018 12 0.0037 8 0.0009 7 0.0009 7 0.3226 11 0.0009 13 0.0101 9 0.0419 8 0.1564 8 0.0194 12 0.0583 14 0.0221 10 0.1883 9 0.0505 9 0.0652 13 0.2054 15 0.0419 11 0.0563 10 0.0496 10 0.0991 14 0.3382 16 0.0948 12 0.151 11 0.3507 11 0.1321 14.2 0.0009 17 0.1575 13 0.2852 12 0.1673 12 0.1438 15 0.2613 17.2 0.0009 14 0.2111 13 0.0878 13 0.0991 16 0.1132 18 0.2503 15 0.0534 14 0.069 14 0.0555 17 0.0221 18.2 0.0009 16 0.0037 15 0.0525 15 0.0222 18 0.0027 18.3 0.0009 D18S1364 16 0.0092 16 0.011 D12S391 19 0.2275 基因型 频率 17 0.0009 17 0.0055 基因型 频率 20 0.1371 11 0.0009 D1S2142 18 0.0009 15 0.0129 20.2 0.0009 12 0.0353 基因型 频率 19 0.0009 16 0.0101 21 0.0429 13 0.1906 12 0.3479 19.3 0.0009 17 0.1162 22 0.0092 14 0.1906 13 0.1193 20 0.0027 18 0.2491 23 0.0009 15 0.2031 14 0.041 21 0.0037 19 0.2193 D1S549 16 0.1985 15 0.2077 22 0.0009 20 0.1499 基因型 频率 17 0.0391 16 0.1861 23 0.0009 21 0.0979 9 0.0009 18 0.0838 17 0.0958 25 0.0009 22 0.0729 11 0.0651 19 0.0534 18 0.0101 26 0.0009 23 0.0438 12 0.1531 20 0.0101 D2S1360 27 0.0009 24 0.0175 13 0.1009 D22S1045 基因型 频率 31 0.0009 25 0.0101 14 0.2663 基因型 频率 15 0.0009 D20S161 26 0.0046 15 0.3232 11 0.2406 19 0.0055 基因型 频率 D20S85 16 0.0709 12 0.0037 20 0.0037 15 0.0602 基因型 频率 16.2 0.0009 13 0.0082 21 0.175 16 0.2263 10 0.4301 17 0.0138 14 0.0119 22 0.5902 17 0.378 11 0.0101 D21S2055 15 0.2454 23 0.1235 18 0.1319 12 0.0486 基因型 频率 16 0.2903 24 0.0306 19 0.1245 13 0.0888 9.1 0.0989 17 0.1783 25 0.0259 20 0.0612 14 0.1542 10.1 0.0082 18 0.0175 26 0.0184 21 0.0156 15 0.164 11.1 0.0027 19 0.0064 27 0.0166 22 0.0009 16 0.0898 12.1 0.0018 21 0.0009 28 0.0092 表 2 23个STR基因座群体遗传学参数(n = 548)
Table 2. Population genetic parameters of 23 STR loci (n = 548)
基因座 等位基因数 H PIC DP PE P D10S2325 23 0.837 0.815 0.955 0.860 0.6301 D11S4463 10 0.768 0.722 0.905 0.724 0.173 D12S391 12 0.845 0.820 0.955 0.855 0.6883 D13S305 16 0.832 0.806 0.949 0.838 0.2321 D16S3391 9 0.792 0.775 0.934 0.796 0.8283 D18S1364 10 0.845 0.816 0.953 0.846 0.7616 D19S400 11 0.794 0.776 0.937 0.813 0.4041 D1S2142 7 0.792 0.749 0.921 0.764 0.9114 D1S549 9 0.772 0.748 0.920 0.764 0.3281 D20S161 8 0.763 0.734 0.913 0.752 0.5123 D20S85 9 0.754 0.723 0.910 0.752 0.2897 D21S2055 21 0.885 0.864 0.973 0.911 0.5406 D22S1045 10 0.772 0.728 0.906 0.722 0.4319 D2S1360 13 0.611 0.577 0.815 0.594 0.8615 D2S1776 9 0.755 0.704 0.895 0.709 0.1836 D2S441 12 0.790 0.752 0.922 0.769 0.6277 D3S1545 12 0.774 0.726 0.907 0.730 0.2043 D3S1744 9 0.797 0.797 0.945 0.830 0.4183 D3S2459 11 0.796 0.777 0.934 0.794 0.8106 D4S2408 6 0.750 0.702 0.891 0.686 0.3683 D6S1017 7 0.703 0.671 0.872 0.651 0.3375 D7S1517 16 0.859 0.862 0.971 0.901 0.1698 D9S2157 10 0.796 0.755 0.923 0.770 0.6738 H:杂合度;PIC:多态信息含量;DP:个体识别力;PE:非父排除率;P:Hardy-Weinberg不平衡精确检验的概率值,P > 0.05表明该基因座符合Hardy-Weinberg平衡。 -
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