Application and Evaluation of Day Care Laparoscopic Cholecystectomy
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摘要:
目的 基于云南曲靖地区胆囊切除患者手术情况，分析和讨论日间腹腔镜胆囊切除术（ambulatory laparoscopic cholecystectomy，ALC）的安全性和可行性。 方法 回顾性选择曲靖市第一人民医院2019年9月至2020年10月收治的行腹腔镜胆囊切除术患者77例作为研究对象，按照手术管理流程的不同，将77例患者分为ALC组（n = 38）和传统腹腔镜胆囊切除术（traditional laparoscopic cholecystectomy，TLC）组（n = 39），比较2组患者术前一般情况，手术安全性、卫生经济学、满意度指标。 结果 2组患者在病例特点、性别、年龄、手术时间、术中出血、术后并发症、术后满意度的差异均无统计学意义（P > 0.05），2组患者术前等待时间、住院时长和住院费用的差异有统计学意义（P < 0.05），其中ALC组在术前等待时间、住院时间较TLC组明显减少，ALC组在手术费用方面较TLC组明显下降。 结论 精准微创外科操作下配合延续性护理服务、多模式镇痛理念、快速康复理念的围术期管理，能显著缩短术前及住院时长、降低住院费用、并且无术后并发症的增加，故ALC是可实践，安全有效，有益患者、地区医疗资源的。可结合各地实际情况开展。 Abstract:Objective To analyze and discuss the safety and feasibility of ambulatory laparoscopic cholecystectomy （ALC） based on the surgical situation of gallbladder resection patients in Qujing, Yunnan. Methods A retrospective analysis was conducted on 77 patients who underwent laparoscopic cholecystectomy at the First People's Hospital of Qujing City from September 2019 to October 2020. Based on the different treatment methods, the 77 patients were divided into the ALC group （n = 38） and the traditional laparoscopic cholecystectomy （TLC） group （n = 39）, and comparisons were made on the general preoperative conditions, surgical safety, health economics, and satisfaction indicators of the two groups. Results There were no statistically significant differences between the two groups of patients in terms of medical history, gender, age, surgery time, intraoperative bleeding, postoperative complications, and postoperative satisfaction （P > 0.05）. The differences in preoperative waiting time, length of hospital stay, and hospital costs were statistically significant between the two groups （P < 0.05）, with the ALC group showing a significant reduction in preoperative waiting time and hospital stay compared to the TLC group, and a significant decrease in surgical costs compared to the TLC group. Conclusion Precise minimally invasive surgical procedures combined with continuous postoperative care services, multi-modal pain management concepts, and fast recovery concepts in perioperative management can significantly shorten the preoperative and hospital stay duration, reduce hospital costs, and avoid an increase in postoperative complications. Therefore, ALC is practical, safe, effective, and beneficial to patients and regional medical resources. It can be implemented in combination with the actual situation in different regions. -
Key words:
- Day surgery /
- Laparoscopic cholecystectomy /
- Curative effect /
- Implementation
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Vero细胞，即非洲绿猴肾脏细胞，其通过自发永生化而形成连续的细胞系。Vero细胞被监管机构（world health organization，WHO）认为是最为广泛接受的连续细胞系，低传代（不超过170代）的Vero细胞由于其安全性和对不同病毒的允许性而被广泛用于人类疫苗的生产[1−3]。Vero细胞易感染多种病毒，自1986年WHO批准Vero细胞用于病毒疫苗生产以来，已经用于不仅限于新型冠状病毒、狂犬病毒、脊髓灰质炎病毒、肠道病毒71病毒（EV-71）、流感（单价和多价）和其他疫苗的生产[4−7]。Vero细胞的生长依赖于细胞贴壁，实验室采用的细胞贴壁培养技术获得的细胞往往数量有限不能满足大规模的生产需求。悬浮培养提供了更高的细胞密度和更容易的工艺放大，因此人们也逐渐驯化了一些贴壁依赖性细胞使其进行悬浮培养。目前报道已经成功驯化的贴壁细胞有MDCK（Madin-Darby canine kidney）[8−9]细胞、BHK-21（Baby Hamster Syrian Kidney）[10−12]细胞、CHO（Chinese hamster ovary）[13−14]细胞等。
国内外对于Vero细胞的悬浮培养也取得了一些初步的成果[15]，主要是通过改变细胞培养基的成分和驯化细胞使其适应悬浮培养的环境，但是无成瘤性的Vero细胞悬浮驯化仍然是一个国内外尚未解决的难题。因此，本研究以贴壁培养的Vero细胞为主要研究对象，旨在探索驯化Vero细胞进行悬浮培养的技术，为最终研制出无成瘤性的Vero-S细胞悬浮培养奠定基础和积累经验，同时本研究以驯化的悬浮细胞系接种流感病毒，为流感疫苗的大规模制备提供新思路。
1. 材料与方法
1.1 细胞及病毒
Vero细胞134代来源于欧洲动物细胞收藏中心（European Collection of Animal Cell Cultures，ECACC），编号为03129010，由中国医学科学院医学生物学研究所贴壁培养2次，建立136代的原始Vero细胞库。本实验使用的细胞代次为148代。人二倍体KMB17细胞，由中国医学科学院医学生物学研究所建立和保存。
流感病毒毒株H3N2 A/HongKong4801/2014/NYMCX-263B（编号：15/184E2）、H1N1A/Michigan/45/2015/NYMCX-276/42020（编号：16/248E13）、B型流感病毒B-Y B/Phuket/3073/2013（编号：14/312E3）和B型流感病毒B-V B/Brisbane/60/2008/NYMCBX-35/41950（编号：15/300E13），来源于英国NIBSC，由中国医学科学院医学生物学研究所传代和保藏。
1.2 主要试剂及仪器
DMEM/F12培养基（贴壁培养用）购自苏州宜兴塞尔生物科技有限公司，使用时添加5%新生牛血清（newborn bovine serum，NBS）；Vero细胞无血清悬浮培养基VS-002为实验室自行研制，主要由鸡肝细胞悬浮培养基NF-1（购自四川百诺吉生物公司），并添加2 mg/L转铁蛋白、50 mg/L牛血清白蛋白、3 mg/L地塞米松配制成；NBS购自兰州民海生物工程有限公司。
细胞荧光计数仪（S3）购自上海睿钰生物科技有限公司；二氧化碳恒温摇床购自瑞士阿道夫科耐；125 mL透气三角摇瓶购自美国康宁公司。
1.3 实验动物
SPF级BALB/C无胸腺雌性裸鼠（4～6周龄）购自中国医学科学院医学生物学研究所小动物试验部[许可证号：SCXK（滇）K2022-0002]；实验动物伦理审查批准文号：DWSP202110005，动物实验设施许可证编号：SYXK（滇）K2019-0003。
1.4 Vero细胞悬浮驯化
贴壁培养的Vero培养形成致密单层后，用0.25%胰蛋白酶消化制成细胞悬液，1000 r/min离心10 min去除含血清培养基。用无血清悬浮培养基将细胞沉淀制成15×108个/L单细胞悬液，接种于125 mL摇瓶中，30 mL/瓶。置于CO2恒温恒湿摇床上进行悬浮驯化，设置摇床转速110 r/min、5% CO2、37℃、湿度60%。驯化期间每隔48 h通过1000 r/min离心10 min将1/2旧培养基去除，更换相同体积新鲜培养基，并取样进行细胞镜检、细胞密度检测、活率检测等。重复上述步骤，直至检测到细胞开始增殖。细胞增殖后按1∶4进行传代培养，并进行细胞冻存，命名为Vero-S。
1.5 Vero细胞生物学特征
细胞复苏后，按1∶4进行传代培养。取样进行形态学检查、活力检查、生长曲线测定。形态学检查采用显微镜观察法；复苏后悬浮培养于0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168 h取样检测细胞密度和活率，绘制生长曲线，计算倍增时间PDT。（PDT=T/A，其中，A=log2（Y/X），Y表示生长周期中最大密度24 h前的细胞密度，X表示细胞初始接种密度，T表示Y所处生长周期中的时间。
1.6 无菌检查
细菌、真菌和支原体检查采用培养法，按照《中国药典》三部（2020版）[16]生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制规程和检定方法对Vero-S细胞进行污染检查。
1.7 STR鉴定
采用STR鉴定对Vero-S细胞进行物种鉴定，对照为贴壁培养的Vero细胞，此步委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行。
1.8 透射电镜检查
取培养中的Vero-S细胞悬液各0.015 L，1500 r/min离心10 min去除上清，制成细胞沉淀后加入2.5%戊二醛固定液固定，将样品切成70～100 nm范围内，经过丙酮脱水、醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后进行装片、扫描。对照组为贴壁培养的Vero细胞。
1.9 成瘤性检查
将Vero-S细胞和贴壁培养的Vero细胞制成5×1010个/L的活细胞悬液，颈部肩胛骨处皮下接种4～5周的SPF级胸腺缺陷型BALB/C雌性裸鼠，200 µL/只（相当于接种107个活细胞），阴性对照组为148代贴壁培养的Vero细胞。每周观察及触摸所有动物在注射部位是否有结节形成，观察8周，记录观察结果。结节大小采用“长径×短径”（mm×mm）方式记录，结节达2 cm以上时则应处死。按照“椭球形”计算结节体积，体积V=π/6×L×H×W=0.52×L×W2（L为长径，W为短径）。
1.10 流感病毒敏感性
为了测试Vero悬浮驯化前后对流感病毒感染的敏感性，以MOI=0.01分别接种H3N2、H1N1、B-V、B-Y 4种亚型流感病毒于Vero-S细胞和悬浮前贴壁培养的Vero细胞，每种亚型接种3瓶，并且添加TPCK胰蛋白酶至终浓度1 g/L，34.5 ℃培养60 h，收获液于-80 ℃冻融1次，检测血凝效价。
2. 结果
2.1 Vero细胞的悬浮驯化
驯化期间，活细胞密度在前40 d内缓慢下降，第40 d最低，为0.72×109个/L；活细胞密度在第30 d至50 d维持稳定；第50 d缓慢上升，说明此时细胞逐步适应悬浮培养环境，并开始缓慢增殖，见图1。驯化第40 d细胞呈团状、结团较多、无细胞碎片；第60 d细胞大多数呈单个、分散状态，无细胞碎片、大小不均一，但存在结团现象；第70 d细胞呈单个、分散状态，无细胞碎片，大小不均一，见图2。
图 2 Vero细胞驯化期间形态（400×）A：Vero细胞驯化40 d形态； B：Vero细胞驯化60 d形态； C：Vero细胞驯化70 d形态。Figure 2. Morphology of Vero cells during adaptation period （400×）2.2 Vero-S细胞生物学特征
Vero-S细胞生长曲线均呈现典型的“S”型，见图3A。Vero-S细胞延迟期在0～24 h之间、指数生长期在24～72 h之间、平台期在108～144 h之间、衰退期在144 h以后，细胞PDT为36 h。复苏后，显微镜观察到Vero-S细胞呈单个、分散、大小均一的状态，见图3B。荧光计数仪检测到细胞密度在14.01～14.88×108个/L之间，细胞平均圆度在0.73～0.75之间，细胞直径在12.12～14.44 µm之间。
图 3 Vero-S细胞生物学特征A：Vero-S细胞生长曲线；B：Vero-S细胞形态（400×）。Figure 3. Morphology of Vero-S cells2.3 污染检查和STR鉴定结果
细菌及真菌检查为阴性（-）；支原体检查为阴性（-）。使用短串联重复序列（STR）对悬浮Vero细胞系的8个基因座进行分型，Vero-S细胞STR位点基因分型结果见表1、图4。
表 1 Vero-S细胞的STR位点基因分型结果Table 1. Results of STR loci genotyping for Vero-S cellsSTR位点 等位基因1 等位基因2 重复次数 重复次数 D1S518 191.04 194.99 15 16 D4S2408 346.03 349.93 16 17 D5S1467 180.06 10 D6S1017 354.84 358.7 10 11 D8S1106 134.07 12 D17S1304 210.15 214.31 14 15 D19S245 245.76 21 DYS389 328.29 12 
图 4 Vero-S cells的STR位点基因分型图A：D1S518位点基因型为15/16； B：D5S1467位点基因型为10； C：D4S2408位点基因型为16/17； D：D6S1017位点基因型为10/11； E：D8S1106位点基因型为12； F：D17S1304位点基因型为14/15； G：D19S245位点基因型为21； H：DYS389位点基因型为12。Figure 4. STR loci genotyping chart of Vero-S cells2.4 透射电镜检查结果
从电镜图可以看出，Vero-S细胞和贴壁培养的Vero细胞细胞膜、细胞核和细胞中的细胞器完整，细胞状态良好。Vero-S细胞和贴壁培养的Vero细胞之间未发现明显的结构差异，见图5。
图 5 Vero细胞电镜图片A1～A3：不同视野下贴壁培养的Vero细胞形态； B1：1500倍电镜下Vero-S细胞形态； B2～B3：3000倍电镜下不同视野的Vero-S细胞形态。Figure 5. Electron microscopy image of Vero cells2.5 成瘤性检查结果
Vero-S细胞接种了6只裸鼠，均出现肿瘤，成瘤性为100%，并且体积在1.47 cm3～1.61 cm3之间。对照组悬浮前的Vero细胞（P150）和人二倍体KMB17细胞共接种了5只裸鼠，期间未观察到有肿瘤性结节产生，也未发生死亡情况，见图6。说明悬浮前的Vero细胞和KMB17细胞都不具有成瘤性。此外，观察期内未发现裸鼠有不进食、不进水或其它异常行为。
图 6 成瘤性检查裸鼠情况A：接种悬浮前的Vero细胞（P150）的裸鼠未出现肿瘤； B：接种人二倍体KMB17细胞的裸鼠未出现肿瘤； C1～C6：接种悬浮培养的Vero-S细胞的6只裸鼠均出现不同大小的肿瘤。Figure 6. Tumorigenicity assessment in nude mice2.6 流感病毒敏感性
血凝实验显示，贴壁培养的Vero细胞对流感病毒H3N2、H1N1、B-V、B-Y血凝效价分别为1∶1024、1∶512、1∶512、1∶256；Vero-S细胞对流感病毒H3N2、H1N1、B-V、B-Y共4种亚型的血凝效价均为0，与阴性对照组一致，说明Vero-S细胞对流感病毒不敏感，可能是由于驯化过程改变了细胞的特性。
3. 讨论
Vero细胞系作为第1个被WHO批准用于人类用病毒疫苗的连续细胞系，由于其干扰素表达缺陷，对许多病毒敏感，这种广泛的易感性导致了基于Vero细胞生产的相应致病病毒疫苗的开发，包括全灭活、减毒、活病毒疫苗等类型，具有极高的商业价值。为了降低制造成本，从上游生物工艺开发的角度来看，作为生产基质的细胞越多，可以产生的病毒就越多。因此，悬浮Vero细胞系的开发显得尤为重要，在悬浮培养中，细胞不需要受到贴壁面积的限制，而且无需胰蛋白酶消化，在已经建立了其他哺乳动物细胞系（HEK293和CHO）的情况下，Vero细胞的悬浮培养也成为一种可能情况。然而，Vero细胞系在悬浮培养物中的生长适应是一个非常具有挑战性的过程，由于底物、代谢物、产物的扩散障碍，单细胞悬浮比细胞聚集体更具有开发价值。尽管已经建立了微载体和固定床生物反应器技术，悬浮细胞系仍然是病毒生产的最佳底物[17]。
在长期的、大规模的人工培养过程中，细胞群体的生理活动可能会受到损害，例如分泌功能和代谢能力的改变。有研究表明，细胞代谢状态以及表观遗传的改变可能导致细胞成瘤性增加[18]，Vero细胞在无血清培养介质中悬浮生长时，需要大量能量以满足自身生存要求，如可能依赖高水平的糖酵解以满足ATP供应，这与正常贴壁细胞明显不同，正常细胞则主要依赖发生氧化磷酸化来满足代谢增殖要求，上述观点与Otto Warburg的癌症起源学说也相符合，Weinberg认为线粒体代谢的改变以及活性氧大量产生可能是细胞成瘤性增加的原因之一[19]。同时，与贴壁细胞不同的是，悬浮细胞在传代时较难鉴定细胞代次，高代次的Vero细胞也是成瘤性增加的可能原因[20]。目前对于一些动物细胞系是否可以在不改变其遗传或抗原特性的情况下扩增病毒尚不可知，需对细胞库进行鉴定和测试以及开发适合多种疫苗毒株复制和增殖的细胞基质。此外，动物细胞容易受到来自呼吸道病毒、肠道病毒、疱疹病毒的病原体感染，因此需要更严格的质量控制，以确保细胞基质疫苗接种的安全性。在建立能够稳定增殖的细胞系基础上，未来动物细胞培养技术的发展应侧重于优化细胞培养环境、改变细胞生物学特性，以提高生产规模和疫苗生产[21]。
本研究使用商业化鸡肝细胞悬浮培养基NF-1，并添加2 mg/L转铁蛋白、50 mg/L牛血清白蛋白、3 mg/L地塞米松配制成Vero细胞悬浮培养基，采用“摇床驯化法”初步驯化了贴壁培养的Vero细胞进行悬浮培养，整个驯化时间约70 d，细胞倍增时间为36 h，复苏后细胞呈透亮、球形（圆度0.73～0.75）、分散无聚团状态，大小均一（12.12～14.44）µm、无细胞碎片，细胞增殖良好。STR鉴定结果表明悬浮的Vero细胞与Almeida等[22]报道的分型结果完全一致，表明悬浮Vero细胞具有完全的遗传稳定性。据报道，Litwin等[23]于1992年开发出了Vero细胞悬浮培养基，并证明悬浮细胞若要达到1×109个/L的细胞密度水平需要长达20～30 d的停滞期。Paillet等[24]报道VeroE6细胞在自制的无血清培养基SFM中经过120 d驯化适应后得到可悬浮培养的Vero细胞，并且Vero细胞一旦适应悬浮培养后将持续保持悬浮培养特性，细胞无聚团现象。SamiaRourou等[25]利用重组胰蛋白酶将贴壁的Vero细胞分离后通过自制IPT-AFM无血清培养基驯化贴壁的Vero细胞悬浮培养只用了60 d，比Paillet等[24]用时减少了一半。笔者的结果显示，Vero细胞从贴壁驯化为悬浮培养需要70 d，与文献报道相当[23]。虽然已有Vero细胞悬浮培养的报道，但总体发现目前的Vero细胞悬浮培养仅仅限于实验室的研发和科研，且驯化时间较长，最短为60 d，并且Vero细胞悬浮培养基都源于实验室自制，尚未有商业化的Vero细胞悬浮培养基。由于笔者驯化获得的Vero-S细胞具有成瘤性，尚不能用于人用生物制品的生产，仍需继续努力探索悬浮培养技术。同时，对于Vero-S细胞可以进一步开展基因组学和病毒敏感性的研究，积累科学数据。
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图 1 2组患者出院1月后满意度调查的独立样本Kruskal-Wallis检验
Figure 1. Kruskal-Wallis test of independent samples of the satisfaction survey of the two groups of patients 1 month after discharge
表 1 2组患者术前观察指标的分析比较[$\bar x \pm s $/n（%）]
Table 1. Analysis and comparison of preoperative observation indexes between the two groups[$\bar x \pm s $/n（%）]
项目 观察组（ALC）
n=38对照组（TLC）
n=39t/χ2 P 年龄（岁） 43.16±11.61 42.69±12.55 0.169 0.866 性别 男 8（21.1） 10（25.6） 0.226 0.634 女 30（78.9） 29（74.4） 疾病类型 胆囊结石 34（89.5） 34（87.2） 0.098 0.754 胆囊息肉 4（10.5） 5（12.8） 
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表 2 2组患者手术相关指标的分析比较（$\bar x \pm s $）
Table 2. Analysis and comparison of operation-related indicators between the two groups（$\bar x \pm s $）
项目 观察组（ALC）n=38 对照组（TLC）n=39 t P 术前等待时间（h） 34.97±4.83 41.79±4.56 6.378 <0.001* 手术时间（min） 46.03±8.98 45.08±7.94 0.492 0.624 术中出血量（mL） 12.50±5.90 11.54±4.61 3.054 0.085 住院时间（h） 18.16±2.76 93.28±13.13 34.948 <0.001* 住院费用（元） 7823.67 ±405.5710183.80 ±810.8216.216 <0.001* *P < 0.05。
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表 3 2组患者术后并发症分析比较[n（%）]
Table 3. Analysis and comparison of postoperative complications between the two groups [n（%）]
项目 观察组（ALC）
n=38对照组（TLC）
n=39χ2 P 有并发症 3（8.1） 4（10.3） 0.105 0.746 无并发症 35（91.9） 35（89.7）
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表 4 2组患者出院1月后满意度调查的非参数检验[n（%）]
Table 4. Nonparametric test of satisfaction survey of two groups of patients after one month of discharge[n（%）]
项目 观察组（ALC）
n=38对照组（TLC）
n=39H P 非常满意 20（52.6） 23（59.0） 0.187 0.665 满意 12（31.6） 10（25.6） 一般 4（10.5） 3（7.7） 不满意 2（5.3） 3（7.7）
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