Establishment of a Smooth Muscle Cell Model for Venous Grafts after Coronary Bypass Surgery
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摘要:
目的 探索冠脉搭桥静脉桥体外细胞模型的建立。 方法 体外培养大鼠静脉平滑肌细胞，正常对照组，5%张应力组，10%张应力组，15%张应力组4组，细胞拉伸装置不同拉伸幅度拉伸细胞，观察细胞形态变化，CCK-8检测观察细胞活性变化，Edu染色观察细胞增殖变化，划痕实验观察细胞迁移能力变化。 结果 与正常对照组相比较，5%张应力对细胞活度无显著影响（P > 0.05）；10%张应力明显促进细胞活力（P < 0.05）；而 15%张应力则明显抑制细胞活力（P < 0.01）。 与正常对照组相比，5%张应力对细胞增殖无显著影响（P > 0.05）；10%张应力明显促进细胞增殖（P < 0.01）；15%张应力明显抑制细胞增殖（P < 0.05）。与正常组对比，5%张应力对细胞迁移能力无明显影响（P > 0.05）；10%张应力促进细胞迁移能力（P < 0.05）；15%张应力明显抑制细胞迁移能力（P < 0.05）。 结论 建立模型在频率1HZ，拉伸变形幅度10%参数设定下，血管平滑肌细胞与临床静脉桥再狭窄增生细胞生物行为表现一致。 Abstract:Objective To explore the establishment of in vitro model of coronary artery bypass venous bridge in coronary artery bypass graft （CABG）. Methods Rat venous smooth muscle cells were cultured in vitro and divided into 4 groups. The cells were stretched by cell stretching device in order to simulate the mechanical environment of vein bridge. The changes of cell morphology were observed by CCK-8 detection, cell activity was observed by Edu staining, and cell migration ability was observed by scratch test. Results Compared to the normal control group, 5% tensile stress had no significant effect on cell viability （P > 0.05）; 10% tensile stress significantly enhanced cell vitality （P < 0.05）; while 15% tensile stress significantly suppressed cell vitality （P < 0.01）. In terms of cell proliferation, 5% tensile stress showed no significant effect compared to the normal control group （P > 0.05）; 10% tensile stress significantly promoted cell proliferation （P < 0.01）; and 15% tensile stress significantly inhibited cell proliferation （P < 0.05）. Compared to the normal group, 5% tensile stress had no obvious impact on cell migration capability （P > 0.05）; 10% tensile stress promoted cell migration ability （P < 0.05）; and 15% tensile stress significantly inhibited cell migration ability （P < 0.05）. Conclusion Under establishment the parameters of 1 Hz frequency and 10% stretch deformation, the biological behavior of vascular smooth muscle cells is consistent with that of clinical stenosis-restenosis cells. -
Key words:
- Venous bridge /
- Model /
- In vitro /
- Venous smooth muscle cells /
- Coronary artery bypass graft
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冠脉搭桥术是临床治疗冠心病的主要手段，但最常选用的静脉桥血管容易发生再狭窄，严重影响冠脉搭桥术预后。既往的研究显示静脉桥再狭窄是静脉移植到动脉系统后，应力环境改变引起血管内膜增厚所致，而血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖和迁移能力的改变是静脉桥内膜增厚导致再狭窄的细胞学基础[1-2]。因此，模拟静脉桥移植到动脉系统的力学环境，观察VSMC的细胞活性变化，建立冠脉搭桥静脉桥体外细胞模型对于攻克静脉桥再狭窄这一临床难题就有非常主要的意义。
1. 材料与方法
1.1 VSMC分离培养
选取100～200 g SD雄性大鼠，10%水合氯醛按0.3 mL/100 g腹腔注射，并腹部皮下注射肝素25 μg/100 g抗凝。待大鼠麻醉后取仰卧位固定，备皮后常规碘伏消毒，先作左侧颈部纵切口，钝性分离显露左侧颈外静脉约1.5 cm，8-0棉纶线先结扎静脉近心端至颈内外静脉分叉处，后结扎远心端，眼科剪迅速剪断远心端及近心端，将剪下的颈外静脉条移至超净工作台，用D-Hank’ s液将颈外静脉条冲洗2～3遍，洗去组织上的血污及破损细胞，沿纵轴剪开颈外静脉，内膜面向上，用手术刀片小心刮去内膜，D-Hank’ s液冲洗，从内面用眼科镊小心剥下中膜，剪成约1×1 mm的正方形组织块，放在经组织培养液处理的培养瓶上，加入培养基。再以上述方法对右侧颈外静脉进行同样处理。一旦细胞从组织中迁移出来，将组织块取出并丢弃。通过用抗平滑肌肌动蛋白抗体进行免疫细胞化学染色证实了平滑肌细胞表型，使用第 3～8 代的平滑肌细胞完成细胞实验。过量麻醉法处死大鼠。实验经昆明医科大学动物实验伦理审查委员会批准（kmmu20230350）。
1.2 VSMC细胞形态鉴定
对原代培养的VSMC细胞进行白光拍照。
1.3 VSMC细胞免疫荧光鉴定
（1）吸去细胞培养液，PBS溶液浸洗3次，吸去PBS溶液，4%多聚甲醛固定细胞爬片，室温30 min；（2）0.01 mol/L PBS溶液浸洗， 5 min×3次；（3）0.2% Triton X-100（PBS配制）室温通透20 min；（4）0.01 mol/L PBS溶液浸洗， 5 min×3次；（5）5%羊血清溶液封闭，37 ℃恒温烘箱孵育1 h；（6）吸去多余的封闭液，滴加已配好的一抗（稀释液为2%羊血清溶液）于细胞爬片上，4 ℃冰箱孵育过夜；（7）0.01 mol/L PBST溶液浸洗 ，5 min×4次；（8）吸去PBST溶液，滴加已配好的荧光二抗（稀释液为PBST溶液）于细胞爬片上，37 ℃恒温烘箱避光孵育1 h；（9）0.01 mol PBST溶液浸洗 ，5 min×3次 ；（10）吸取多余的溶液，每张细胞爬片上滴加50 μL的抗淬灭封片剂（含DAPI）封片，荧光显微镜下观察并采集图片。
DAPI染出来的细胞核在紫外的激发光下为蓝色，一抗α-SMA、smMHC、CD31对应的荧光二抗Affinuty purified Antibody Daylight 488 Labeled Goat anti-Mouse IgG（H+L）在紫外的激发光下为绿色，即阳性表达呈现颜色为绿色，其中α-SMA、smMHC抗体阳性表达定位在胞质，CD31无表达。
1.4 体外细胞模型建立
本研究采用Flexcell 细胞拉伸系统（FL4000）对VSMC细胞拉伸，FL4000由监视器，计算机，控制模块和底板组成。将特殊制造的 6 孔组织培养板（柔性底板，底部由硅制成）倒入位于 CO2 培养箱中的底板垫片中。控制模块可调节底部和底部的 Flexcell 培养板下方的空气压力和抽气速率。在负压模式下，培养孔底以大体均匀的方式向下拉，在正压模式下，将孔底向上推，从而在整个培养板表面上产生更均匀的双轴应变场。排空速率和压力调节单次形变拉伸的性质。重复变形会产生细胞拉伸的频率。可以通过计算机编程不同的变形参数以匹配体内组织的变形参数。通过调节施加于柔性底板的压力和时间，可以在体外模拟人体动脉相同的频率，振幅和持续时间。从而模拟静脉桥VSMC的动脉力学环境。
1.5 实验分组
实验分4组，正常对照组（对细胞不施加任何拉伸），5%张应力组（对细胞施加频率为1 Hz，应力拉伸变形幅度为5%），10%张应力组（对细胞施加频率为1 Hz，应力拉伸变形幅度为10%），15%张应力组（对细胞施加频率为1 Hz，应力拉伸变形幅度为15%）。
以上实验分组，作用 24 h后，进行以下检测或实验。
1.6 统计学处理
应用 SPSS软件进行统计学分析，所有数据符合正态分布和方差齐性，计量资料用均数±标准差（$\bar x \pm s $）表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 显微镜下观察
加力后细胞状态变差，速度缓慢，且随着拉伸变形幅度变大，生长越慢，见图1。
图 1 各组VSMC形态观察（×25）A：正常对照组；B：5%张应力组；C：10% 张应力组；D：15%张应力组。Figure 1. Morphology in each group of VSMC （×25）2.2 免疫荧光染色结果性显示
标志性物α-SMA、smMHC 表达呈阳性，而内皮标志物 CD31 表达呈阴性，见图2。
2.3 细胞活力检测试剂盒（CCK-8） 检测结果显示
与正常对照组相比较，5%张应力组细胞活力变化无统计学意义（P > 0.05）；10%张应力组细胞活力率显著高于对照组（P < 0.05）；15%张应力组细胞活力率显著低于对照组（P < 0.01），见图3。
2.4 EDU染色结果显示
与正常对照组相比较，5%张应力组，EDU阳性细胞变化无统计学意义（P > 0.05）；10%张应力组，EDU阳性细胞数量显著增多（P < 0.01）；15%张应力组，EDU阳性细胞数量显著减少（P < 0.05），见图4。
图 4 各组EDU染色结果与正常对照组比较，**P < 0.05，***P < 0.01。Figure 4. EDU staining in each group of VSMC2.5 细胞划痕实验结果显示
与正常组比较，5%张应力组划痕愈合率改变无统计学意义（P > 0.05）；10%张应力组划痕愈合率显著高于对照组（P < 0.05；15%张应力组划痕愈合率显著低于对照组（P < 0.05），见图5。
图 5 各组划痕愈率的统计分析结果与正常对照组比较，ns P > 0.05，**P < 0.05。Figure 5. Statistical analysis of the proportion of wound healing in each group of VSMC3. 讨论
3.1 冠心病搭桥术治疗现状
冠心病是全球首位死亡原因[3]。根据国内 2022 年的心血管疾病报告推算，在城市和农村居民中，冠心病的死亡率分别为 121.59/10 万和 130.14/10 万[4]。通过移植自体血管恢复冠心病患者心肌灌注（再血管化）的冠脉搭桥术（coronary artery bypass graft，CABG）是临床上广泛应用的治疗手段[5]。2021 年我国完成CABG 手术近 6 万例，占心脏总手术量的 21.5%[6]。大隐静脉是 80% 的CABG再血管化中选用的桥血管[7]。但静脉桥容易发生狭窄或闭塞，会增加患者发生心绞痛、心肌梗死、再次血运重建甚至死亡的风险，严重制约了 CABG 的疗效[8]。
3.2 静脉桥再狭窄研究成果
目前针对静脉桥再狭窄临床主要采用抗血小板治疗及他汀类降脂药，但效果有限，1项Meta分析显示，只服用阿司匹林的患者有20%的静脉桥闭塞，服用阿司匹林加替格瑞洛的患者依然有11.2%的静脉桥闭塞，但出血风险增加[9]。临床对于静脉桥再狭窄的治疗遇到了瓶颈。
研究显示静脉桥再狭窄是静脉移植到动脉系统后，应力环境改变引起血管内膜增厚所致，血管平滑肌细胞增殖和迁移是内膜增厚的细胞学基础。研究显示由动脉搏动引起的周期性拉伸增加在内膜增生中起重要作用[10−11]。周期性拉伸，其定义为血管壁随着血压有节奏地扩张和松弛而引起的细胞反复变形，这是静脉桥再狭窄的关键病理因素。静脉桥再狭窄，可以看作静脉所处血流应力环境改变后（动脉压力和动脉搏动血流），移植静脉为了适应新应力环境发生“动脉化”的过程[12−14]。而抗血小板药物和他汀类稳斑药对血管平滑肌细胞增殖和迁移无效，这也许就是目前CABG术后临床药物治疗静脉桥再狭窄的瓶颈所在，笔者前期研究发现，在CABG动物模型上，静脉桥再狭窄机制与血管平滑肌细胞增殖有关[15]。
3.3 建立冠脉搭桥静脉桥体外平滑肌细胞模型的意义及依据
未来针对CABG静脉桥再狭窄预防的药物研究要聚焦于血管平滑肌细胞增殖和迁移的作用，能否成功建立CABG静脉桥体外血管平滑肌细胞模型成为此类研究的基础。
笔者体外培养静脉血管平滑肌细胞，通过免疫鉴定，确定培养的是平滑肌细胞而不是内皮细胞。本研究中，免疫荧光检测VSMC标志性物α-SMA和smMHC及内皮标志物CD31的荧光强度。DAPI染出来的细胞核在紫外的激发光下为蓝色，一抗α-SMA、smMHC、CD31对应的荧光二抗affinuty purified antibody daylight 488 labeled goat anti-mouse IgG（H+L）在紫外的激发光下为绿色，即阳性表达呈现颜色为绿色。免疫荧光染色结果性显示：培养细胞标志性物α-SMA、smMHC表达呈阳性，而内皮标志物CD31表达呈阴性，以此证明笔者培养的细胞是血管平滑肌细胞。
笔者再通过周期性拉伸血管平滑肌细胞模拟静脉桥移植到冠状动脉后的血管平滑肌细胞生存的力学环境。通过设定好细胞拉伸系统装置的参数模拟动脉搏动，在不同牵张幅度下观察血管平滑肌细胞的生物学特性。细胞活力检测试剂盒（CCK-8） 检测结果显示，与正常对照组相比较，5%张应力组细胞活力改变无统计学意义（P > 0.05），提示5%张应力组对细胞活度无明显影响；10%张应力组细胞活力率显著高于对照组（P < 0.05），提示10%张应力明显促进细胞活力；15%张应力组细胞活力率显著低于对照组（P < 0.01），提示 15%张应力则明显抑制细胞活力。 EDU染色结果显示，与正常对照组相比较，5%张应力组，EDU阳性细胞变化无统计学意义（P > 0.05），提示5%应力对细胞增殖无明显影响；10%张应力组EDU阳性细胞数量显著增多（P < 0.01），提示10%张应力明显促进VSMC增殖；15%张应力组EDU阳性细胞数量显著减少（P < 0.05），提示15%应力明显抑制VSMC增殖。细胞划痕实验结果显示，与正常组对比，5%张应力组划痕愈合率变化无统计学意义（P > 0.05），提示5%张应力对细胞迁移无明显影响；10%张应力组划痕愈合率显著高于对照组（P < 0.05），提示10%张应力明显促进细胞迁移能力；15%张应力组划痕愈合率显著低于对照组（P < 0.05），提示15%张应力明显抑制细胞迁移能力。
本研究发现频率为1 Hz，应力拉伸变形幅度10%时血管静脉平滑肌细胞细胞活力增加，细胞增殖能力提高，细胞迁移能力提高，与临床上静脉桥再狭窄增生细胞生物行为表现一致，冠脉搭桥静脉桥体外血管平滑肌细胞模型建立成功。
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图 1 各组VSMC形态观察（×25）
A：正常对照组；B：5%张应力组；C：10% 张应力组；D：15%张应力组。
Figure 1. Morphology in each group of VSMC （×25）
图 4 各组EDU染色结果
与正常对照组比较，**P < 0.05，***P < 0.01。
Figure 4. EDU staining in each group of VSMC
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