FGF2 Regulates Hypoxia-Induced Proliferation and Collagen Metabolism of Scleral Fibroblasts Through the PERK/EIF2α/ATF4 Signaling Pathway
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摘要:
目的 研究FGF2对缺氧诱导的巩膜成纤维细胞（scleral fibroblasts，SF）增殖和胶原的影响并探讨其可能调节的下游信号通路。 方法 用5% O2刺激SF 24 h诱导近视SF模型，RT-qPCR检测FGF2 mRNA表达，Western blot检测FGF2蛋白表达。细胞计数试剂盒8（Cell Count Kit-8，CCK-8）、流式细胞术和Western blot分别检测细胞增殖活力、细胞凋亡和胶原代谢相关蛋白collagen Ⅰ、MMP2以及通路蛋白PERK、p-PERK、EIF2α、EIF2α、ATF4表达。 结果 缺氧刺激可促进FGF2 mRNA和蛋白表达升高（P < 0.01）并激活PERK/EIF2α/ATF4通路（P < 0.001），抑制SF细胞增殖（P < 0.001）和collagen Ⅰ表达（P < 0.001），诱导MMP2表达（P < 0.001）及细胞凋亡（P < 0.001）。敲降FGF2或经PERK抑制剂GSK2606414处理可逆转缺氧对SF细胞的作用，促进细胞增殖活力（P < 0.001）和collagen Ⅰ表达（P < 0.01），减少细胞凋亡（P < 0.01）。 结论 FGF2通过调节PERK/EIF2α/ATF4通路的激活，影响缺氧诱导的SF增殖及胶原代谢。 Abstract:Objectives To investigate the effects of FGF2 on the proliferation and collagen production of hypoxia-induced scleral fibroblasts （SF） and explore the downstream signaling pathways it regulates. Methods 5% O2 was used to stimulate the SF to induce myopia SF model for 24 hours. RT-qPCR was used to detect FGF2 mRNA expression, and Western blot analysis was used to check FGF2 protein expression. The Cell Counting Kit-8 （CCK-8）, flow cytometry, and Western blot were used to assess cell proliferation vitality, cell apoptosis, and the expression of collagen metabolism-related proteins collagen I, MMP2, and pathway proteins PERK, p-PERK, EIF2α, EIF2α, and ATF4. Results Hypoxia increased FGF2 mRNA and protein expression （P < 0.01） , activated the PERK/EIF2α/ATF4 pathway （P < 0.001）, inhibited SF cell proliferation （P < 0.001） and collagen I expression （P < 0.001）, while induced MMP2 expression （P < 0.001） and apoptosis （P < 0.001）. Knocking down FGF2 or treating with PERK inhibitor GSK2606414 reversed the effect of hypoxia on SF cells, increased cell proliferation （P < 0.001） and collagen Ⅰ expression （P < 0.01）, and suppressed cell apoptosis （P < 0.01）. Mechanism study revealed that FGF2 knockdown dampened the activation of PERK/EIF2α/ATF4 pathway. Conclusion FGF2 affects hypoxia-induced SF proliferation and collagen metabolism by regulating the activation of PERK/EIF2α/ATF4 signaling pathway. -
Key words:
- Scleral fibroblasts /
- Hypoxia /
- FGF2 /
- Proliferation /
- Collagen metabolism
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近视是全世界主要的公共卫生问题之一，高度近视常导致永久性视力损害，甚至失明，目前已成为我国第二大致盲原因[1]。近视的发展可导致眼球轴向伸长，对眼后段产生生物力学拉伸作用，引起眼底并发症，如后巩膜葡萄肿、脉络膜新生血管和视网膜脱离等。巩膜是保护眼内结构的屏障，也是眼球形状和大小的决定因素，主要由胶原蛋白和细胞外基质分子组成[2]。巩膜也被认为是近视中最重要的病理因素之一[3]。巩膜成纤维细胞（scleral fibroblasts，SF）是巩膜中产生和分泌细胞外基质的主要组成部分，在眼睛的发育过程中起重要作用[4]。巩膜缺氧诱导动物和细胞模型是目前常见的近视模型诱导方法[5]，已经用于近视相关的研究，但参与调节近视相关的作用机制仍有待探索。
成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2，FGF2）是一种肝素结合生长因子，在胚胎发育、血管生成、伤口愈合以及细胞分化中起关键作用。FGF2也被报道与眼部各组织的发育和分化密切相关[6]。Qin等[7]表明，外源性FGF2可促进SF的增殖，并逆转年龄相关的成纤维细胞到肌成纤维细胞的分化，与正常眼相比，形式剥夺近视豚鼠眼中FGF2的表达升高[8]。蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）是内质网应激中的传感器蛋白之一，通过检测内质网应激中错误折叠的蛋白积累，最终激活信号级联反应。PERK的激活可诱导真核起始因子2-α（eukaryotic initiation factor 2-alpha，EIF2α）的磷酸化，从而促进激活转录因子4（activating transcription factor 4，ATF4）的核翻译，在调节响应应激信号过程中起着关键作用[9]。据报道，PERK和EIF2α在近视小鼠巩膜组织中被激活[10−11]。但PERK/EIF2α/ATF4信号通路在SF中的作用机制仍然未知。因此，本研究将探讨FGF2对缺氧诱导SF的作用并研究这种调节作用是否由PERK/EIF2α/ATF4信号通路介导。
1. 材料与方法
1.1 细胞培养及缺氧诱导
人SF购自武汉普诺赛生命科技有限公司，SP在含10% FBS和1%双抗的DMEM培养基（武汉普诺赛）中生长，并置于37 ℃、5% CO2培养箱内。SP细胞接种至12孔板（2.5×105个/孔），培养24 h，随后将细胞置于1% O2三气低氧培养箱培养24 h，以诱导缺氧条件下的SF。
1.2 细胞转染和分组处理
si-NC和si-FGF2由苏州吉玛合成。根据试剂盒指导说明，通过Lipofectamine 3000试剂分别将si-NC和si-FGF2转染至SF细胞，细胞在5% CO2细胞培养箱培养48 h，通过Western blot或RT-qPCR检测+si-FGF2转染效率。
转染si-NC和si-FGF2的SF细胞置于1% O2三气低氧培养箱培养24 h获得Hypoxia +si-NC和Hypoxia +si-FGF2组细胞。Hypoxia+GSK2606414组细胞向培养液中加入1 μmol/L GSK2606414并将细胞置于1% O2三气低氧培养箱培养24 h。
1.3 RT-qPCR
采用RT-qPCR检测FGF2 mRNA的相对表达。收集细胞，加入TRIzol（上海碧云天）提取细胞中的总RNA。RQ1 RNase Free DNase（Promega，美国）处理后，用M-MLV逆转录酶（Sigma-Aldrich）和oligdT逆转录合成cDNA。使用特异性引物和Power SYBR Green PCR在实时荧光定量PCR系统上进行RT-qPCR反应。GAPDH作为内参，2-ΔΔCt法计算FGF2 mRNA的相对表达水平，见表1。
表 1 引物序列Table 1. Primer sequences目的基因 引物序列
（F: Forward，R: Reverse，5’-3’）FGF2 F: GTCAAACTACAACTCCAAGCAG R: GAAACACTCTTCTGTAACACACTT GAPDH F: GTGGAGTCATACTGGAACATGTAG R: AATGGTGAAGGTCGGTGTG 1.4 Western blot
取RIPA裂解缓冲液裂解各组中细胞，提取细胞中的总蛋白，并通过增强型BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天）检测蛋白质的浓度。取30 μg提取的总蛋白样品加至10% SDS-PAGE上，通过电泳分离，随后转移到PVDF膜上。室温下将PVDF膜与5%脱脂奶粉封闭2 h后，将膜与一抗过夜孵育（兔抗FGF2 1∶
1000 ，兔抗collagen Ⅰ 1∶1000 、兔抗MMP2 1∶300以及兔抗PERK 1：1000 ，兔抗p-PERK 1∶500，EIF2α 1∶2000，兔抗ATF4 1∶1000 ，β-catenin 1∶500，北京博奥森；兔抗p-EIF2α 1∶1000 ，Abcam），Tris缓冲液洗涤3次×5 min。PVDF膜与山羊抗兔二抗（北京博奥森）孵育1 h，TBST漂洗膜3次，凝胶成像系统可视化目的蛋白，Image J软件分析蛋白的灰度值。1.5 细胞计数试剂盒8（Cell count kit-8，CCK-8）
CCK-8用于检测细胞增殖活力。将细胞接种至96孔板中，每孔2000个细胞，成功转染及缺氧处理后的细胞置于5% CO2细胞培养箱培养24 h，向各组细胞中分别加入10 μL CCK-8溶液，利用酶标仪测定450 nm处的吸光度值。
1.6 流式细胞术
收集处理后的SF细胞，以
1000 r/min离心5 min，弃去细胞培养基，PBS漂洗后再次加入PBS重悬细胞。向细胞中分别加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混匀，避光孵育15 min。通过流式细胞仪检测细胞的凋亡率（早期凋亡率+晚期凋亡率）。1.7 统计学处理
GraphPad Prism软件对实验结果进行统计分析，所有数据均表示为“均值±标准差”（$ \bar x \pm s $）。2组间比较采用学生t检验，多组间比较采用单因素方差分析并通过Tukey’ s检验进行事后比较。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 FGF2在缺氧诱导的SF中高表达
SF细胞置于缺氧条件下处理构建近视模型SF细胞，RT-qPCR检测发现，缺氧处理组中FGF2 mRNA表达高于Ctrl组（P < 0.01），见图1A。用Western blot检测FGF2的蛋白表达，与Ctrl组相比，FGF2蛋白相对表达升高（P < 0.01），见图1B-1C。由此表明，FGF2在低氧诱导的SF中高表达。
图 1 FGF2在缺氧诱导的SF中高表达A：缺氧诱导的SF中FGF2 mRNA相对表达；B：缺氧诱导的SF中FGF2蛋白表达电泳图。C：FGF2蛋白表达统计学分析。**P < 0.01。Ctrl：正常对照组，Hypoxia：缺氧组。Figure 1. Overexpression of FGF2 in hypoxia-induced SF2.2 FGF2调控缺氧诱导的SF增殖和胶原代谢
分别将si-NC、si-FGF2#1、si-FGF2#2、si-FGF2#3转染至SF中，Western blot结果显示，转染si-FGF2可降低FGF2蛋白表达（P < 0.001），见图2A，且si-FGF2#3组转染效果更好（P < 0.001）。将si-NC和si-FGF2#3转染至SF中，CCK-8检测细胞的增殖活力，见图2B，缺氧诱导组中SF活力低于Ctrl组（P < 0.001），见图2B，敲降NC组中细胞活力与缺氧组没有明显差异（P > 0.05），敲降FGF2组细胞活力高于敲降NC组（P < 0.001）。细胞凋亡结果见图2C-2D，缺氧处理诱导细胞凋亡（P < 0.001），敲降FGF2组中SF的凋亡率低于敲降NC组（P < 0.05）。Western blot用于检测collagen Ⅰ和MMP2蛋白水平，见图2E-2F，缺氧组中collagen Ⅰ表达降低（P < 0.001），MMP2蛋白表达高于Ctrl组（P < 0.001）。FGF2敲降组中collagen Ⅰ水平升高（P < 0.05），MMP2表达降低（P < 0.01）。随后，利用Western blot检测PERK、p-PERK、EIF2α、EIF2α、ATF4的表达，见图2G-2J。相比较于Ctrl组，p-PERK/PERK、p-EIF2α/EIF2α和ATF4蛋白水平在缺氧诱导组中升高（P < 0.001），在FGF2敲降组中表达降低（P < 0.05）。由此说明，缺氧处理抑制SF细胞增殖、胶原生成，诱导细胞凋亡和PERK/EIF2α/ATF4通路的激活，敲降FGF2可减弱缺氧对SF的作用。
图 2 FGF2调控缺氧诱导的SF增殖和胶原代谢A：转染si-FGF2的SF中FGF2蛋白相对表达水平；B：细胞增殖活力；C～D：细胞凋亡率；E：collagen Ⅰ和MMP2蛋白表达电泳图；F：collagen Ⅰ和MMP2蛋白表达统计学分析；G：PERK、p-PERK、EIF2α、p-EIF2α、ATF4蛋白表达电泳图；H：p-PERK/PERK蛋白表达统计学分析；I：p-EIF2α/EIF2α蛋白表达统计学分析；J：ATF4蛋白表达统计学分析。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。Ctrl：正常对照组，Hypoxia：缺氧组。Figure 2. FGF2 regulates proliferation and collagen metabolism in hypoxia-induced SF2.3 PERK/EIF2α/ATF4通路调控缺氧诱导的SF增殖及胶原代谢
前面的研究发现PERK/EIF2α/ATF4通路在缺氧诱导的SF中被激活，敲降FGF2抑制通路的激活，但PERK/EIF2α/ATF4信号通路在SF中的作用仍不明确。用PERK抑制剂（GSK2606414）刺激缺氧诱导的SF，实验结果表明，GSK2606414处理组中p-PERK/PERK（P < 0.01），见图3A～3B、p-EIF2α/EIF2α（P < 0.05，见图3A和3C）和ATF4表达低于缺氧组（P < 0.01），见图3A和3D，SF细胞的增殖活力与缺氧组相比增加（P < 0.001），见图3E，凋亡被抑制（P < 0.01），见图3F-3G，collagen Ⅰ表达升高（P < 0.01），见图3H～3I、MMP2低表达（P < 0.001），见图3H和3J。由此说明，FGF2敲降可抑制PERK/EIF2α/ATF4通路的激活，可缓解缺氧对SF细胞增殖和collagen Ⅰ表达的抑制作用，减少细胞凋亡。
图 3 PERK/EIF2α/ATF4通路调控缺氧诱导的SF增殖及胶原代谢A：PERK、p-PERK、EIF2α、p-EIF2α、ATF4蛋白的蛋白表达电泳图；B：p-PERK/PERK蛋白表达统计学分析；C：p-EIF2α/EIF2α蛋白表达统计学分析；D：ATF4蛋白表达统计学分析；E：细胞增殖活力；F：细胞凋亡率统计；G：细胞凋亡图；H：collagen Ⅰ和MMP2蛋白表达电泳图：I：collagen Ⅰ蛋白表达统计学分析；J：MMP2蛋白表达统计学分析。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。Ctrl：正常对照组，Hypoxia：缺氧组。Figure 3. PERK/EIF2α/ATF4 pathway regulates proliferation and collagen metabolism in hypoxia-induced SF3. 讨论
3.1 近视相关机制研究现状
近视的流行正成为现代社会的重大公共卫生问题。据统计分析和预测，全球近视人口的比例将从2010年的28.3%上升到2050年的49.8%[12]，且约有20%的病例发展为高度近视，这也是引起不可逆失明的主要原因[13]。控制近视的方法包括行为、药物以及光学干预，但这些途径都存在一定的局限性。目前，对近视发病机制的研究显示，在外界异常视觉信息的作用下，涉及多种神经递质、生长因子等信号通路通过视网膜 - 脉络膜 - 巩膜途径最终导致巩膜重塑和眼轴延长，从而引起近视。如：多巴胺（dopamine，DA）信号通路，DA是视网膜中的一种重要神经递质，D1受体过度激活可导致远视漂移，D2受体则导致近视进展[10]；表皮生长因子（EGF）受体（EGFR），EGF介导赤道后部RPE细胞基膜过度生长，Bruch膜扩张和延长，使脉络膜受压变薄、血供减少，进而引起巩膜缺氧、重塑；胆碱能信号，阿托品等毒蕈碱样（M）受体拮抗剂可以作用于巩膜、脉络膜和RPE，通过胆碱能通路的M受体来发挥近视控制作用；维甲酸（RA），RA在豚鼠的近视模型中可以加强视网膜的外屏障功能，使水和离子从RPE流入脉络膜的量减少，进而使脉络膜变薄，促进近视发展。本研究中，笔者发现FGF2通过激活PERK/EIF2α/ATF4信号通路，抑制缺氧诱导的SF细胞增殖和collagen Ⅰ水平，促进凋亡。
3.2 FGF2与眼部疾病的相关研究
FGF2是成纤维细胞生长因子家族的成员，通过结合和激活FGR受体（FGFR1-4）调节多种细胞的生物学过程。近来，研究发现异常表达的FGF2参与调控多种眼部疾病的发与发展过程[14]。FGF2在小鼠角膜内皮细胞中诱导内皮间质转化相关基因Snail、Zeb1、Col1a1、Col1a2、Fn1、Vim、Cdk2和Ccne1的表达，促进细胞的内皮间质转化；FGF2敲低抑制小鼠角膜内皮细胞损伤依赖性角膜的形成[15]。在人角膜内皮细胞中，IL-1β通过刺激AP-1和NF-κB通路激活，诱导FGF2的表达并促进细胞迁移[16]。FGF2可促进TGF-β2处理的晶状体上皮细胞的上皮间质转化[17]。未成熟的SCA-1细胞通过FGF2和AKT信号通路可使衰老视网膜中的干细胞重新繁殖，减少急性视网膜缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡[18]。笔者的研究发现，FGF2在缺氧刺激的SF中高表达，敲低FGF2可促进SF细胞增殖和collagen Ⅰ的合成、减少细胞凋亡，同时，敲降FGF2可抑制PERK/EIF2α/ATF4信号通路的激活。
3.3 PERK/EIF2α/ATF4信号通路的相关研究
PERK是未折叠蛋白反应的关键跨膜蛋白之一，未折叠蛋白反应是指细胞内质网应激的进化保守途径，通过关键跨膜蛋白（ATF6、IRE1和PERK）介导相应的途径抑制蛋白质合成，促进未折叠蛋白质的降解，从而缓解内质网应激，恢复内质网功能。在内质网应激期间，磷酸化的PERK激活其经典底物EIF2α的磷酸化，减弱细胞质翻译并诱导ATF4表达以维持细胞稳态[19]。研究发现，PERK/EIF2α/ATF4信号通路在调节内质网应激在肿瘤生长、神经退行性病变[20]、免疫反应[21]等过程中发挥关键作用。Ikeda等[11]发现，晶状体诱导近视激活巩膜中IRE1、PERK、ATF6，利用药理学抑制PERK和ATF6可抑制近视的进展。氧诱导的视网膜病变小鼠视网膜中PERK磷酸化水平增加，抑制PERK磷酸化显著减少视网膜新生血管形成和视网膜神经节细胞的损伤，改善小鼠视网膜损伤[22]。本研究发现，在缺氧诱导的SF中PERK和EIF2α磷酸化水平被激活，ATF4表达升高。敲降FGF2抑制PERK和EIF2α的激活并降低ATF4表达。通过PERK抑制剂GSK2606414处理抑制PERK/EIF2α/ATF4信号通路的激活，促进SF细胞增殖和collagen Ⅰ合成、减少细胞凋亡。
综上所述，缺氧刺激诱导SF中FGF2高表达，敲降FGF2通过抑制PERK/EIF2α/ATF4信号通路激活，促进SF增殖和collagen Ⅰ合成，降低细胞凋亡率。FGF2可能是缺氧引起的近视治疗的潜在靶标。
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图 1 FGF2在缺氧诱导的SF中高表达
A：缺氧诱导的SF中FGF2 mRNA相对表达；B：缺氧诱导的SF中FGF2蛋白表达电泳图。C：FGF2蛋白表达统计学分析。**P < 0.01。Ctrl：正常对照组，Hypoxia：缺氧组。
Figure 1. Overexpression of FGF2 in hypoxia-induced SF
图 2 FGF2调控缺氧诱导的SF增殖和胶原代谢
A：转染si-FGF2的SF中FGF2蛋白相对表达水平；B：细胞增殖活力；C～D：细胞凋亡率；E：collagen Ⅰ和MMP2蛋白表达电泳图；F：collagen Ⅰ和MMP2蛋白表达统计学分析；G：PERK、p-PERK、EIF2α、p-EIF2α、ATF4蛋白表达电泳图；H：p-PERK/PERK蛋白表达统计学分析；I：p-EIF2α/EIF2α蛋白表达统计学分析；J：ATF4蛋白表达统计学分析。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。Ctrl：正常对照组，Hypoxia：缺氧组。
Figure 2. FGF2 regulates proliferation and collagen metabolism in hypoxia-induced SF
图 3 PERK/EIF2α/ATF4通路调控缺氧诱导的SF增殖及胶原代谢
A：PERK、p-PERK、EIF2α、p-EIF2α、ATF4蛋白的蛋白表达电泳图；B：p-PERK/PERK蛋白表达统计学分析；C：p-EIF2α/EIF2α蛋白表达统计学分析；D：ATF4蛋白表达统计学分析；E：细胞增殖活力；F：细胞凋亡率统计；G：细胞凋亡图；H：collagen Ⅰ和MMP2蛋白表达电泳图：I：collagen Ⅰ蛋白表达统计学分析；J：MMP2蛋白表达统计学分析。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。Ctrl：正常对照组，Hypoxia：缺氧组。
Figure 3. PERK/EIF2α/ATF4 pathway regulates proliferation and collagen metabolism in hypoxia-induced SF
表 1 引物序列
Table 1. Primer sequences
目的基因 引物序列
（F: Forward，R: Reverse，5’-3’）FGF2 F: GTCAAACTACAACTCCAAGCAG R: GAAACACTCTTCTGTAACACACTT GAPDH F: GTGGAGTCATACTGGAACATGTAG R: AATGGTGAAGGTCGGTGTG 
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