Effect of Compound Probiotic Powder on Immune Function of Mice
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摘要:
目的 探究复合益生菌粉在增强机体相关免疫功能的作用，以期为未来更深入地探索和应用该复合益生菌粉提供理论依据和实验支撑。 方法 将160只ICR小鼠随机分为空白对照组、低、中、高剂量组，采用随机平行对照分组法进行分组，每组各40只。实验周期为30 d，空白组灌胃生理盐水30 d，其余各组按照预设剂量灌胃复合益生菌粉30 d，灌胃结束后，活杀小鼠，观察其脏器指数、迟发性变态反应、淋巴细胞转化、血清溶血素、抗体生成细胞、自然杀伤细胞（nutral killer cells，NK）活性以及巨噬细胞吞噬功能等数据整体性评估复合益生菌粉对小鼠免疫机能的作用。 结果 相对于空白对照组，各剂量组小鼠体重和脏器指数差异无统计学意义（F = 0.885，P = 0.458；F = 0.844，P = 0.479；F = 0.732，P = 0.540）；足趾肿胀程度差值，差异有统计学意义（F = 3.252，P = 0.03）；各剂量小鼠脾淋巴细胞增殖能力光密度差值增加，差异有统计学意义（F = 48.786，P = 0.000）；溶血空斑数增加，差异有统计学意义（F = 22.095，P = 0.000）；中、高剂量组半数溶血值升高，差异有统计学意义（F = 30.544，P = 0.000）；廓清指数和吞噬指数升高，差异有统计学意义且呈剂量依赖性（F = 338.79，P = 0.000；F = 120.271，P = 0.000）；NK细胞活性同样升高，差异有统计学意义且呈剂量依赖性（F = 466.491，P = 0.000）。 结论 复合益生菌粉能提高小鼠免疫力，结果符合《保健食品检验与评价技术规范》中“具有增强免疫力功能”的评价标准。 -
关键词:
- 鼠李糖乳杆菌R9639 /
- 干酪乳杆菌Zhang /
- 植物乳杆菌P9 /
- 体液免疫 /
- 细胞免疫
Abstract:Objective To explore the effect of compound probiotic powder on enhancing related immune function of organism, so as to provide theoretical basis and experimental support for further exploration and application of compound probiotic powder in the future. Methods 160 ICR mice were randomly divided into control group, low, medium and high dose groups, and divided into groups by random parallel control grouping method, with 40 mice in each group. The experimental period lasts 30 days, the control group was given normal saline for the same time, and the other groups were given compound probiotic powder for 30 days. After the gavage, the mice were killed alive, and their organ index, delayed allergic reaction, lymphocyte transformation, serum hemolysin, antibody-producing cells, NK cell activity and macrophage phagocytosis were observed to evaluate the influence of compound probiotic powder on the immunity of mice. Results Compared with the control group, there was no significant difference in body weight and organ index of mice in each dose group （F = 0.885, P = 0.458; F = 0.844, P = 0.479; F = 0.732, P = 0.540）; The difference of toe swelling degree was statistically significant （F = 3.252, P = 0.03）.The difference of optical density of spleen lymphocyte proliferation in mice with different doses increased, and the difference was statistically significant （F = 48.786, P = 0.000）. The number of hemolytic plaque increased with statistical significance （F = 22.095, P = 0.000）. The half hemolysis value of middle and high dose groups increased, and the difference was statistically significant （F = 30.544, P = 0.000）. The clearance index and phagocytosis index increased, and the difference was statistically significant and dose-dependent （F = 338.79, P = 0.000; F = 120.271, P = 0.000）; NK cell activity also increased, and the difference was statistically significant and dose-dependent （F = 466.491, P = 0.000）. Conclusion The compound probiotic powder can improve the immunity of mice, and the results meet the evaluation standard of "having the function of enhancing immunity" in the Technical Specification for Inspection and Evaluation of Health Food. -
益生菌是一种在自然界或宿主自身筛选出的安全稳定的菌[1]。益生菌可以起到多种重要的保护作用，包括抵御自由基、减少胆固醇的摄入、阻止癌细胞的生成、增强身体的免疫功能等[2]，从而达到预防疾病的目的。最近有研究发现，摄入益生菌后，人体黏膜的微生态与酶平衡有所增强，且不同类型的免疫功能同样得到了提升，机体的抗病力和免疫力也因此有所提高[3]。植物乳杆菌基于提高NK细胞的代谢水平和介导巨噬细胞的极化，起到增强机体免疫、防癌、降低糖尿病和心血管疾病风险等效果[4]。然而在需制定对益生菌个性化应用的方案的背景下，益生元与免疫系统的全面作用机制和最佳匹配剂量仍需深入探索。因此，本文采用鼠李糖R9639、干酪乳杆菌Zhang、植物乳杆菌P9 3种益生菌基于特定比例制得复合益生菌粉，基于分析复合益生菌粉的应用剂量和ICR小鼠免疫功能强度的关联性，为前者的保健效果评估与最佳利用效率提供数据支撑并奠定充分基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
复合益生菌粉：由鼠李糖乳杆菌R9639、干酪乳杆菌Zhang、植物乳杆菌P9按40%：20%：40%比例混合而成，产品活菌数均为2.0×1011 CFU·g-1。均购自北京科拓恒通生物技术股份有限公司（批号分别为：
20210716001 、20210518008 、20210805002 ）。1.2 实验动物
SPF级雌性ICR小鼠（18～20 g）160只（北京斯贝福实验动物技术有限公司）许可证号：SCXK（京）2019-0010；实验单位使用许可证编号：SYXK（京）2020-0033。先于北京中医药大学动物培养室内饲养5 d，在此期间进水与摄食均不受限制，每天晚上6:00按时补充食物和饮用水，饲养温度18 ℃-28 ℃，湿度38%～40%，光照不进行干预。
1.3 主要仪器和试剂
主要仪器：分析天平、冷冻离心机、CO2培养箱、酶标仪等。主要试剂：绵羊红细胞（SRBC）（鸿泉生物）、鸡红细胞（鸿泉生物）、Hanks液（pH7.2）（华奥正生科技有限公司）、RPMI1640培养基（华奥正生科技有限公司）、刀豆蛋白A（ConA）（华奥正生科技有限公司）、FBS（血清）（武汉普诺赛生命科技有限公司）、YAC-1细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司）、SA缓冲液（Servicebio）、印度墨汁（Servicebio）、0.1%Na2CO3（Servicebio）、Giemsa染液（Servicebio）等。
1.4 实验动物分组及给药
将160只小鼠随机分为空白对照组、低剂量组（0.42 mg/kg）、中剂量组（0.84 mg/kg）、高剂量组（2.5 mg/kg），每组各40只实验前各组差异没有可比性（P > 0.05）。按照上述剂量配置成20 mL/kg的浓度进行灌胃给药，空白组给予去离子水灌胃。持续给药30 d。给药结束后，脱颈处死，进行手术取材并检测相应的免疫指标。
1.5 实验方法
1.5.1 小鼠胸腺、脾脏脏器指数测定实验
记录小鼠末次给药后体重，取脾脏和胸腺，对其重量进行检测，按下式进行计算脏器指数[5]：
小鼠胸腺指数 = 胸腺重量（mg）/小鼠体重（g）
小鼠脾脏指数 = 脾脏重量（mg）/小鼠体重（g）。
1.5.2 足趾增厚法（DTH）测定迟发型变态反应
新鲜羊血去纤维，生理盐水稀释3次（
2000 r/min，10 min），得到20%和2%（v/v）的溶液，在灌胃26 d时，腹腔注射2%的SRBC 0.2 mL，注射后第4天，卡尺检测小鼠左后足跖部厚度，重复3次。继续向左后足跖部皮下注射20%的SRBC 20 µL，隔天测左后足跖部厚度，处理前后足跖厚度的差值即为DTH结果。1.5.3 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验
无菌环境下取脾，Hank's液洗3次，漂洗后
1000 r/min离心10 min，检测细胞浓度，并将终浓度稀释为1×106个/mL，每孔加0.1 mL细胞悬液，继续补充培养基到总体积为1 mL，其中1孔中加25 µLConA液（7.5 µg/mL），另1孔作空白对照，37 ℃5%CO2饱和湿度孵箱中继续培养72 h并设3个平行孔。提前4 h把原来的培养液倒掉，再次向孔内补充新鲜的RPM1640培养基与MTT（5 mg/mL）50 µL ，培养至反应结束。完成后将培养液吸除，向所有孔内补加1 mL异丙醇，震荡溶解，酶标仪（570 nm）测吸光度。1.5.4 血清溶血素溶血值的检测
小鼠灌胃第24 d，取绵羊红细胞，按照1.5.2方法稀释得到2%（v/v）的溶液，腹腔注射2%（v/v）的SRBC 0.2 mL，第28天，摘眼球取血，
2000 r/min离心10 min，上清液中加入300倍体积的生理盐水，取1 mL到试管内，分别加入10% SRBC 0.5 mL以及1 mL补体，水浴锅内37℃加热30 min，随后转移至冰内。1500 r/min离心10 min，取上清液1 mL补充3倍体积的文齐氏试剂，取10%（v/v）SRBC0.25 mL，补充16倍体积的文齐氏试剂。反应10 min，分别用酶标仪（540 nm）测OD值。按式（1）得半数溶血值（HC50）即为所求。$$ \mathrm{样品HC50 = (OD}_{ \mathrm{样品}} \mathrm{/OD}_{ \mathrm{SRBC半数溶血}} \mathrm{)\times 稀释倍数} $$ (1) 1.5.5 Jerne改良玻片法检测抗体生成细胞
灌胃第25 d，腹腔注射0.2 mL 2%（v/v）SRBC悬液，免疫后的第5 d，取材，脾制成单细胞悬液，浓度调至2×107个/mL。取1 mL压积SRBC补充至5 mL血清内，4℃，30 min，反复振荡，离心取上清。琼脂糖1 g，双蒸水补足至100 mL制成表层培养基，加热溶解，45℃保温，与两倍体积Hank's液混合并摇匀，各取0.5 mL置于试管内，补充50 µL10% SRBC及20 µL脾单细胞悬液，试管中混匀，铺在琼脂糖薄层的玻片表面，琼脂凝固后，玻片架上水平扣放，二氧化碳培养箱内进行温育1.5 h，向玻片架凹槽中补充8倍体积的补体，继续温育1.5 h，统计溶血空斑总量。
1.5.6 乳酸脱氢酶LDH法测定NK细胞活性
参照《中药药理实验方法学》的实验操作，将YAC-1靶细胞进行标记处理，小鼠酒精灭菌，取脾脏，制成细胞悬液，细胞浓度为2×107个/mL。50∶1的比例取总体积为100 µL的效应和靶细胞，转移至96孔板内；自然释放孔加100 µL靶细胞及培养液；最大释放孔加同体积的1%NP40及靶细胞，设置3个平行，培养箱内孵育4 h，随即
1500 r/min处理5 min，在新的培养板中，每孔加上清液100 µL，并将同体积的LDH基质液加入培养板，避光反应10 min，继续补充30 µL 1 mol/L的稀盐酸，酶标仪（490 nm）测OD值，统计NK细胞活性，公式如下：$$ \begin{aligned} \mathrm {NK}{\text{细胞活性}}=&\text{（}{\mathrm{OD}}_{ \text{反应孔}} -\mathrm{OD}_{ \text{自然释放孔}} \text{）}/\\ &{\text{（}{\mathrm{OD}}}_{ \text{最大释放孔}} \mathrm{-OD}_{ \text{自然释放孔}} \text{）} \end{aligned}$$ 1.5.7 小鼠碳廓清试验
最后1次给药1 h后，尾静脉注射印度墨汁，浓度为0.1 mL/10 g，注射后立即计时，2 min（t1）和10 min（t2）进行小鼠眼眶后取血20 μL，溶于2 mL 0.1%（即1 g/L）的Na2CO3溶液中，洗净吸管壁附着的血，摇匀。置分光光度计（600 nm）下比色，测定光密度（OD）。随即采取脱颈的方式将小鼠处死，取出肝、脾脏和胸腺，称重。随后计算各组小鼠胸腺指数、脾指数以及廓清指数、吞噬指数，计算公式如下：
$$ \mathrm{胸腺（脾）指数=胸腺（脾）重（mg）/体重} $$ $$ 廓清指数 \mathrm{K}=\frac{\mathrm{l}\mathrm{o}\mathrm{g}\mathrm{O}\mathrm{D}1-\mathrm{l}\mathrm{o}\mathrm{g}\mathrm{O}\mathrm{D}2}{\mathrm{t}2-\mathrm{t}1} $$ $$ 吞噬指数 \alpha =\sqrt3{\mathrm{K}}\times \mathrm{体}\mathrm{重}/（\mathrm{肝}\mathrm{重}+\mathrm{脾}\mathrm{重}） $$ 1.5.8 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞
取材前30 min，腹腔注射1 mL 20%（V/V）鸡血红细胞悬液，脱颈后继续给予2 mL生理盐水，振荡小鼠1 min，随即在腹壁前剪开小口，用移液枪吸出大约 1 mL的生理盐水洗液，将其以各500 µL的体积分别加入到载玻片中，搪瓷盒提前垫上湿纱布，将在载玻片放入搪瓷盒中，随即放到孵箱中孵育30 min，37℃，处理完用生理盐水洗去游离的细胞，等待水分蒸发，加入等体积丙酮-甲醇溶液固定，4%的Giemsa-磷酸缓冲液浸泡3 min，置于无菌水中洗脱残留溶液，油镜中观察细胞数量。计数100个/片，统计吞噬指数与吞噬率。
$$ \mathrm{吞}\mathrm{噬}\mathrm{率}=\frac{\mathrm{吞}\mathrm{噬}\mathrm{鸡}\mathrm{红}\mathrm{细}\mathrm{胞}\mathrm{的}\mathrm{巨}\mathrm{噬}\mathrm{细}\mathrm{胞}\mathrm{数}}{\mathrm{计}\mathrm{数}\mathrm{的}\mathrm{巨}\mathrm{噬}\mathrm{细}\mathrm{胞}\mathrm{数}}\times 100\text{%} $$ $$ \mathrm{吞}\mathrm{噬}\mathrm{指}\mathrm{数}=\frac{\mathrm{被}\mathrm{吞}\mathrm{噬}\mathrm{的}\mathrm{鸡}\mathrm{红}\mathrm{细}\mathrm{胞}\mathrm{总}\mathrm{数}}{\mathrm{计}\mathrm{数}\mathrm{的}\mathrm{吞}\mathrm{噬}\mathrm{细}\mathrm{胞}\mathrm{数}} $$ 1.6 统计学处理
应用SPSS 25.0软件对以上符合正态分布的计量数据资料进行单因素方差分析和组间LSD检验，若数据资料不符合正态分布，则采用非参数检验统计学处理。结果用平均值±标准差（$\bar x \pm s $）表示，P < 0.05表示差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 复合益生菌粉对小鼠体重的影响
在全部研究阶段，小鼠体征稳定，发育过程平缓，体重稳定增长，无死亡。小鼠经灌胃30 d后，经过统计学分析，与空白对照组比较，各组小鼠体重未见显著性差异（F = 0.885，P = 0.458；P > 0.05）表明小鼠体重增长正常，该益生菌长期口服安全性良好，见表1。
表 1 复合益生菌粉对小鼠体重的影响（$\bar x \pm s $，n = 10）Table 1. Effect of compound probiotic powder on body weight of mice（$\bar x \pm s $，n = 10）组别 初体重（g） 终重（g） 体重差值（g） 空白对照组 23.40 ± 1.01 31.06 ± 1.45 7.67 ± 1.71 低剂量组 19.74 ± 0.36 27.49 ± 1.74 7.75 ± 1.92 中剂量组 20.11 ± 0.53 26.49 ± 3.54 6.38 ± 3.41 高剂量组 20.23 ± 0.53 26.54 ± 2.59 6.31 ± 2.41 F = 0.885，P > 0.05。P为与阴性对照组比较。 2.2 复合益生菌粉对小鼠脏器/体重比值的影响
相较于对照组，各剂量组脏器/体重比无显著差异（F = 0.844，P = 0.479；F = 0.732，P = 0.540；P > 0.05）。显示各剂量水平的复方益生菌粉对小鼠脏器作用程度有限，见表2。
表 2 复合益生菌粉对小鼠脏器/体重比值的影响（$\bar x \pm s $，n = 10）Table 2. Effect of Compound Probiotic Powder on Organ/Body Weight Ratio in Mice（$\bar x \pm s $，n = 10）组别 脾脏/体重（mg/g） 胸腺/体重（mg/g） 空白对照组 4.00 ± 0.29 2.65 ± 0.47 低剂量组 4.05 ± 0.22 2.40 ± 0.39 中剂量组 4.07 ± 0.51 2.43 ± 0.38 高剂量组 4.25 ± 0.26 2.48 ± 0.67 F = 0.844，P > 0.05；F = 0.732，P > 0.05。 2.3 复合益生菌粉对小鼠细胞免疫机能的影响
2.3.1 复合益生菌粉对小鼠迟发型变态反应的影响
与空白对照组相比，低、中、高剂量组小鼠的足趾肿胀水平差异显著提升（F = 3.252，P = 0.033；P < 0.05），并呈现剂量依赖性，见表3。
表 3 复方益生菌粉对小鼠迟发型变态反应的影响（$\bar x \pm s $，n = 10）Table 3. Effect of Compound Probiotic Powder on Delayed Allergy in Mice（$\bar x \pm s $，n = 10）组别 足肿胀程度差值（mm） 空白对照组 0.105 ± 0.086 低剂量组 0.117 ± 0.071* 中剂量组 0.170 ± 0.095* 高剂量组 0.215 ± 0.097* F = 3.252，*P < 0.05。 2.3.2 复合益生菌粉对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化过程的作用
与空白对照组相比，不同剂量组的小鼠脾淋巴细胞增殖能力均有显著增强，结果有统计学意义（F = 48.786，P = 0.000；P < 0.05），说明该复合菌粉能够有效提高小鼠脾淋巴细胞的增殖能力，见表4。
表 4 复合益生菌粉对小鼠淋巴细胞增殖能力的影响（$\bar x \pm s $，n = 10）Table 4. Effect of Compound Probiotic Powder on Lymphocyte Proliferation in Mice（$\bar x \pm s $，n = 10）组别 淋巴细胞增殖能力 空白对照组 0.069 ± 0.018 低剂量组 0.095 ± 0.018* 中剂量组 0.112 ± 0.023* 高剂量组 0.174 ± 0.021* F = 48.786，*P < 0.05。 2.4 复合益生菌粉对体液免疫的影响
2.4.1 复合益生菌粉对小鼠半数溶血值（HC50）的作用
相较于对照组，中剂量组与高剂量组的半数溶血值显著升高（F = 30.544，P = 0.000；P < 0.05），见表5。
表 5 复合益生菌粉对小鼠半数溶血值的影响（$\bar x \pm s $，n = 10）Table 5. Effect of Compound Probiotic Powder on Half Hemolytic Value of Mice（$\bar x \pm s $，n = 10）组别 半数溶血值（HC50） 空白对照组 68.86 ± 1.97 低剂量组 66.09 ± 2.46 中剂量组 72.74 ± 2.76* 高剂量组 77.24 ± 2.06* F = 30.544，*P < 0.05。 2.4.2 复合益生菌粉对小鼠抗体细胞生成数的作用
与空白对照组相比，复合益生菌粉各剂量组溶血空斑数显著增加（F = 22.095，P = 0.000；P < 0.01），表明该复合益生菌粉对抗体细胞生成有增强作用，见表6。
表 6 复合益生菌粉对小鼠抗体细胞生成数的影响（$\bar x \pm s $，n = 10）Table 6. Effect of compound probiotic powder on the number of antibody cells in mice（$\bar x \pm s $，n = 10）组别 溶血空斑数（个/全脾细胞） 空白对照组 104.50 ± 18.54 低剂量组 131.38 ± 27.58** 中剂量组 165.29 ± 30.78** 高剂量组 241.67 ± 57.66** F = 22.095，P < 0.05。 2.5 复合益生菌粉对小鼠单核—巨噬细胞吞噬功能的作用
2.5.1 复合益生菌粉对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清能力的作用
低、中、高剂量组的廓清指数和吞噬指数均显著高于空白对照组（F = 338.79，P = 0.000；P < 0.05），且随着菌粉用量的增加，小鼠细胞的碳廓清能力也有所增加。说明该复合益生菌粉能有效提高小鼠的碳廓清能力，见表7。
表 7 复合益生菌粉对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清能力的作用（$\bar x \pm s $，n = 10）Table 7. Effect of compound probiotic powder on carbon clearance of monocyte-macrophage in mice（$\bar x \pm s $，n = 10）组别 廓清指数 吞噬指数 空白对照组 0.0049 ±0.0015 4.3025 ±0.2626 低剂量组 0.0105 ±0.0015 *5.0439 ±0.1829 *中剂量组 0.0208 ±0.0027 *6.1996 ±0.1770 *高剂量组 0.0445 ±0.0049 *7.0339 ±0.2683 *F = 338.79，*P < 0.05。 2.5.2 复合益生菌粉对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的作用
与空白对照组相比，各剂量组小鼠的巨噬细胞吞噬率显著升高（F = 113.625，P = 0.000；F = 120.271，P = 0.000；P < 0.05），说明该复合益生菌粉能够有效提高小鼠巨噬细胞对外源细胞的吞噬作用，增强其细胞活性，见表8。
表 8 复合益生菌粉对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响（$\bar x \pm s $，n = 10）Table 8. Effect of compound probiotic powder on phagocytosis of chicken red blood cells by mouse macrophages（$\bar x \pm s $，n = 10）组别 吞噬率（%） 吞噬指数 空白对照组 0.812 ± 0.136 0.0080 ±0.0012 低剂量组 1.187 ± 0.270* 0.0118 ±0.0028 *中剂量组 1.998 ± 0.179* 0.0200 ±0.0018 *高剂量组 2.892 ± 0.402* 0.0289 ±0.0039 *F = 113.625，P = 0.000 < 0.05；F = 120.271，P = 0.000 < 0.05。 2.6 复合益生菌粉对小鼠NK细胞活性的影响
相对于对照组，中、高剂量组的NK细胞活性显著提高，（F = 466.491，P = 0.000；P < 0.05），且NK细胞活性能力随着剂量的增加而增强，这说明利用复合益生菌粉能够改善小鼠NK细胞活性，增强NK细胞功能，见表9。
表 9 复合益生菌粉对小鼠NK细胞活性的影响（$\bar x \pm s $，n = 10）Table 9. Effect of compound probiotic powder on NK cell activity in mice（$\bar x \pm s $，n = 10）组别 NK细胞活性（%） 空白对照组 28.36 ± 7.62 低剂量组 34.94 ± 4.28 中剂量组 75.92 ± 4.57* 高剂量组 114.06 ± 6.23* F = 466.491，*P < 0.05。 3. 结论
益生菌的研究是目前医学科学中一个有价值的研究领域，益生菌是活的微生物，是有益于宿主健康的微生物菌株，在使用特定的剂量喂养宿主后，其会为宿主带来诸多健康优势，比如能够调节肠道微生物群和免疫机能。鼠李糖乳杆菌R9639可改善小鼠肠道菌群并增强小鼠免疫功能[6−8]。干酪乳杆菌Zhang在稳定肠道生态、抗氧化、预防治疗肿瘤、增强免疫等方面具有显著功能[9]。植物乳杆菌P9在促进农药降解、抗氧化、调节肠道菌群等方面具有强大活性[10]。有研究表明3种菌株均具有胃肠消化液良好的耐受性，能够以活的状态进入人体肠道，有良好的生物活性。
免疫包括先天免疫及特异性免疫，是指机体通过识别“自我”和“非我”后产生免疫识别、免疫应答等一系列免疫反应的过程。其中先天免疫又叫非特异性免疫被认为是抵御病原体的第一线防御系统，而这种一线防御系统在绝大部分情况下受到吞噬细胞与免疫活性分子的总量，通过传递给抗原呈递细胞信号来激活脊椎动物的特异性免疫[11]。适应性免疫又叫特异性免疫，该反应的关键参与者是B淋巴细胞和T淋巴细胞，其中，T淋巴细胞主要参与细胞免疫，B淋巴细胞主要参与体液免疫[12]。T淋巴细胞转化、增殖至致敏淋巴细胞的过程可通过SRBC刺激实现[13]。当B淋巴细胞接触到红细胞时，会产生一种特异性的抗体，即血清溶血素，当这种抗体与特异性抗原SRBC结合时，其水平可以反映出机体对这种抗体的抵抗能力[14]。
通过将3种益生菌鼠李糖乳杆菌R9639、干酪乳杆菌Zhang、植物乳杆菌P9按照特定的比例混合应用，笔者发现该复合益生菌粉能够显著地改善小鼠的免疫系统，从而为深入探索这3种益生菌之间的协同机制，和益生菌粉未来在不同场景的利用提供参考。在本篇文章中，通过实验来评估小鼠的免疫系统，包括对胸腺、脾脏、溶血素、淋巴细胞、吞噬细胞、碳廓清以及NK细胞的监控。这些实验旨在更好的理解小鼠的细胞免疫、体液体液、吞噬细胞的功能，以及对抗病毒的非特异性免疫反应[15−17]。
在本研究中，全部纳入实验的小鼠体重增加情况良好，脾脏和胸腺指数相较于对照差异不显著，说明该复合益生菌粉的口服安全性良好且对小鼠免疫器官的影响较小。小鼠足趾用SRBC来刺激，造成免疫反应致小鼠足趾肿胀，通过观察其肿胀度，能够评价小鼠细胞免疫功能[18]。实验结果显示不同剂量组小鼠的足趾肿胀水平存在显著差异，说明该复合益生菌粉能提高机体对外来抗原的识别及清除能力。在ConA诱导小鼠淋巴细胞转化研究中，复合益生菌各组均能使小鼠脾淋巴细胞增殖水平光密度差异扩大，这两个实验说明复合益生菌粉不仅能有效改善小鼠足肿胀症状，还有助于增加其辨认和消灭外界病毒的能力，从而增强小鼠的细胞免疫功能。在对复合益生菌粉对体液免疫的实验中发现，复合益生菌粉的中、高剂量组的半数溶血值升高，抗体细胞生成数增加，这提示复合益生菌粉通过参与体液免疫影响小鼠的免疫功能。碳廓清实验和吞噬鸡红细胞的实验结果表明复合益生菌粉可以增强小鼠单核—巨噬细胞吞噬功能，从而提高小鼠的免疫力。此外，NK细胞也被证实为一种是常见的重要的免疫淋巴细胞，具有非特异性抗肿瘤、抗病毒作用[19−21]。本实验结果表明，该复合益生菌粉的中高剂量组可以通过增强小鼠NK细胞的活性而增强免疫。
综上所述，由鼠李糖乳杆菌R9639、干酪乳杆菌Zhang、植物乳杆菌P9按照40%：20%：40%比例复配而成的复合益生菌粉可通过增强体液免疫、细胞免疫、单核-巨噬细胞功能和NK细胞代谢水平以提升小鼠的免疫功能。该实验为复合益生菌粉的应用提供实验支撑，以促进复合益生菌粉更好的开发应用。
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表 1 复合益生菌粉对小鼠体重的影响（$\bar x \pm s $，n = 10）
Table 1. Effect of compound probiotic powder on body weight of mice（$\bar x \pm s $，n = 10）
组别 初体重（g） 终重（g） 体重差值（g） 空白对照组 23.40 ± 1.01 31.06 ± 1.45 7.67 ± 1.71 低剂量组 19.74 ± 0.36 27.49 ± 1.74 7.75 ± 1.92 中剂量组 20.11 ± 0.53 26.49 ± 3.54 6.38 ± 3.41 高剂量组 20.23 ± 0.53 26.54 ± 2.59 6.31 ± 2.41 F = 0.885，P > 0.05。P为与阴性对照组比较。 
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表 2 复合益生菌粉对小鼠脏器/体重比值的影响（$\bar x \pm s $，n = 10）
Table 2. Effect of Compound Probiotic Powder on Organ/Body Weight Ratio in Mice（$\bar x \pm s $，n = 10）
组别 脾脏/体重（mg/g） 胸腺/体重（mg/g） 空白对照组 4.00 ± 0.29 2.65 ± 0.47 低剂量组 4.05 ± 0.22 2.40 ± 0.39 中剂量组 4.07 ± 0.51 2.43 ± 0.38 高剂量组 4.25 ± 0.26 2.48 ± 0.67 F = 0.844，P > 0.05；F = 0.732，P > 0.05。
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表 3 复方益生菌粉对小鼠迟发型变态反应的影响（$\bar x \pm s $，n = 10）
Table 3. Effect of Compound Probiotic Powder on Delayed Allergy in Mice（$\bar x \pm s $，n = 10）
组别 足肿胀程度差值（mm） 空白对照组 0.105 ± 0.086 低剂量组 0.117 ± 0.071* 中剂量组 0.170 ± 0.095* 高剂量组 0.215 ± 0.097* F = 3.252，*P < 0.05。
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表 4 复合益生菌粉对小鼠淋巴细胞增殖能力的影响（$\bar x \pm s $，n = 10）
Table 4. Effect of Compound Probiotic Powder on Lymphocyte Proliferation in Mice（$\bar x \pm s $，n = 10）
组别 淋巴细胞增殖能力 空白对照组 0.069 ± 0.018 低剂量组 0.095 ± 0.018* 中剂量组 0.112 ± 0.023* 高剂量组 0.174 ± 0.021* F = 48.786，*P < 0.05。
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表 5 复合益生菌粉对小鼠半数溶血值的影响（$\bar x \pm s $，n = 10）
Table 5. Effect of Compound Probiotic Powder on Half Hemolytic Value of Mice（$\bar x \pm s $，n = 10）
组别 半数溶血值（HC50） 空白对照组 68.86 ± 1.97 低剂量组 66.09 ± 2.46 中剂量组 72.74 ± 2.76* 高剂量组 77.24 ± 2.06* F = 30.544，*P < 0.05。
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表 6 复合益生菌粉对小鼠抗体细胞生成数的影响（$\bar x \pm s $，n = 10）
Table 6. Effect of compound probiotic powder on the number of antibody cells in mice（$\bar x \pm s $，n = 10）
组别 溶血空斑数（个/全脾细胞） 空白对照组 104.50 ± 18.54 低剂量组 131.38 ± 27.58** 中剂量组 165.29 ± 30.78** 高剂量组 241.67 ± 57.66** F = 22.095，P < 0.05。
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表 7 复合益生菌粉对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清能力的作用（$\bar x \pm s $，n = 10）
Table 7. Effect of compound probiotic powder on carbon clearance of monocyte-macrophage in mice（$\bar x \pm s $，n = 10）
组别 廓清指数 吞噬指数 空白对照组 0.0049 ±0.0015 4.3025 ±0.2626 低剂量组 0.0105 ±0.0015 *5.0439 ±0.1829 *中剂量组 0.0208 ±0.0027 *6.1996 ±0.1770 *高剂量组 0.0445 ±0.0049 *7.0339 ±0.2683 *F = 338.79，*P < 0.05。
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表 8 复合益生菌粉对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响（$\bar x \pm s $，n = 10）
Table 8. Effect of compound probiotic powder on phagocytosis of chicken red blood cells by mouse macrophages（$\bar x \pm s $，n = 10）
组别 吞噬率（%） 吞噬指数 空白对照组 0.812 ± 0.136 0.0080 ±0.0012 低剂量组 1.187 ± 0.270* 0.0118 ±0.0028 *中剂量组 1.998 ± 0.179* 0.0200 ±0.0018 *高剂量组 2.892 ± 0.402* 0.0289 ±0.0039 *F = 113.625，P = 0.000 < 0.05；F = 120.271，P = 0.000 < 0.05。
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表 9 复合益生菌粉对小鼠NK细胞活性的影响（$\bar x \pm s $，n = 10）
Table 9. Effect of compound probiotic powder on NK cell activity in mice（$\bar x \pm s $，n = 10）
组别 NK细胞活性（%） 空白对照组 28.36 ± 7.62 低剂量组 34.94 ± 4.28 中剂量组 75.92 ± 4.57* 高剂量组 114.06 ± 6.23* F = 466.491，*P < 0.05。
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<thead>
<tr>
<td class="table_top_border table_bottom_border2" align="left" valign="middle">组别</td>
<td class="table_top_border table_bottom_border2" align="center" valign="middle">初体重（g）</td>
<td class="table_top_border table_bottom_border2" align="center" valign="middle">终重（g）</td>
<td class="table_top_border table_bottom_border2" align="center" valign="middle">体重差值（g）</td>
</tr>
</thead>
<tbody>
<tr>
<td align="left" valign="middle">空白对照组</td>
<td align="left" valign="middle">23.40 ± 1.01</td>
<td align="left" valign="middle">31.06 ± 1.45</td>
<td align="left" valign="middle">7.67 ± 1.71</td>
</tr>
<tr>
<td align="left" valign="middle">低剂量组</td>
<td align="left" valign="middle">19.74 ± 0.36</td>
<td align="left" valign="middle">27.49 ± 1.74</td>
<td align="left" valign="middle">7.75 ± 1.92</td>
</tr>
<tr>
<td align="left" valign="middle">中剂量组</td>
<td align="left" valign="middle">20.11 ± 0.53</td>
<td align="left" valign="middle">26.49 ± 3.54</td>
<td align="left" valign="middle">6.38 ± 3.41</td>
</tr>
<tr>
<td class="table_bottom_border" align="left" valign="middle">高剂量组</td>
<td class="table_bottom_border" align="left" valign="middle">20.23 ± 0.53</td>
<td class="table_bottom_border" align="left" valign="middle">26.54 ± 2.59</td>
<td class="table_bottom_border" align="left" valign="middle">6.31 ± 2.41</td>
</tr>
</tbody>
<tfoot>
<tr>
<td colspan="4" align="left" valign="middle"> <i>F</i> = 0.885，<i>P</i> > 0.05。<i>P</i>为与阴性对照组比较。</td>
</tr>
</tfoot>
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