胰腺癌是1种高发病率和高死亡率的恶性肿瘤，其死亡率在全球恶性肿瘤中高达第4位^[1]。胰腺癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，在所有恶性肿瘤中为预后最差的恶性肿瘤之一，5 年生存率不超过1%。胰腺癌发现时大多数为晚期，手术死亡率和治愈率都较差。胰腺癌的高复发率和高转移率是其治疗的主要难点，主要原因在于胰腺癌细胞对于传统的放疗和化疗方法不敏感^[2]，且具有较强的侵润和转移能力。在胰腺癌的研究中，癌基因和抑癌基因的发现具有重要意义。锌指转录因子4（spalt like transcription factor 4，Sall4）为近些年新发现的1种原癌基因，与多种疾病的发生发展具有密不可分的关系，如白血病、多种遗传性疾病和淋巴瘤等^[3]。因此，从分子层面上研究影响胰腺癌细胞生长和侵袭性的因素，以及寻找有效的早期诊断和治疗方法，成为了胰腺癌研究的关键方向和热点。因此，寻找1种胰腺癌早期诊断和治疗靶点对提高胰腺癌患者的生存率至关重要^[1]。

研究发现，Sall4是1种锌指转录因子，在胚胎干细胞的自我更新中以及胚胎干细胞的多能性中起着重要作用。研究显示，虽然Sall4在发育过程中的表达通常会减少，在大多数成人组织中甚至不存在，但它在多种人类癌症中可能会异常表达，包括胰腺癌。这种异常表达与许多恶性肿瘤的进展有关，Sall4在药物抵抗以及调控癌细胞增殖、凋亡、转移等方面发挥重要作用^[4−5]。Sall4在癌症中的功能通过对其靶基因起到激活或抑制的双重作用来进行表观遗传调节。并调控许多下游基因的表达和激活关键信号传导途径，从而促进癌症的进展、转移、侵袭和治疗抵抗。因此，本研究拟采用细胞慢病毒抑制实验的方法以及免疫组织化学染色方法探究Sall4与胰腺癌之间的联系。为此，选取了一些恶性程度较高的胰腺癌细胞系，用于进行更深入的细胞实验。在初步实验的基础上，选出了几种Sall4高表达的细胞株，并对这些细胞株进行了慢病毒转染和扩大培养。实验的主要目的是通过体内外模型抑制Sall4基因的表达，从而分析该基因被抑制后对胰腺癌细胞的迁移能力及侵袭性的影响。现将该实验的方法、过程和结论汇报如下。

1.   材料与方法

1.1   材料

收集昆明医科大学第二附属医院2014年1月至2018年1月行手术治疗的64例胰腺癌患者的肿瘤癌组织及癌旁样本，本研究已得到了昆明医科大学第二附属医院伦理委员会的批准（伦理编号：kmmu20221318）。肿瘤组织样本的纳入和排除标准可参考文献^[1-4]，实验中使用的人胰腺癌癌细胞株PANC-1、Capan-1、SW 1990、HPAC、HPAF-II，PANC-1和SW 1990细胞株购自中科院昆明细胞库；中国科学院上海细胞库提供其余胰腺癌细胞株。慢病毒转染试剂和polybreneTrizol试剂由上海翊圣生物科技有限公司提供（上海翊圣，货号：19202ES60 ）。实验所需的GAPDH单克隆抗体（昆明洁美生物，货号：30202ES60 ）、RPMI-1640 培养基（昆明洁美生物，货号：41402ES76）、胎牛血清和细胞培养基DMEM由昆明洁美生物公司供应（昆明洁美生物，货号：40131ES76，41401ES76）。吉凯基因科技有限公司提供实验所需的实时荧光定量PCR引物以及慢病毒载体的设计、合成及验证（吉凯基因，货号：10137ES03）。实验所需的逆转录试剂盒和RNA提取试剂盒由大连宝生物工程有限公司生产（大连宝生物，货号：11297ES09）。雅酶生物技术有限公司供应胰酶消化液、细胞裂解液（RIPA）和BCA蛋白定量试剂盒（雅酶生物，货号：CB011；ZJ103 ）。ECL成像系统（Tanon Chemi Dog 5200T）和Transwell小室则分别由上海天能科技有限公司和美国Corning公司提供（Corning，货号：3422）。兔抗单克隆抗体从美国Abcam公司和北京Bioss生物购买（美国Abcam，货号：ab226756；北京bioss bs-12204R）。

1.2   免疫组织化学染色研究

在本研究中，收集了64例胰腺癌手术后的肿瘤组织及癌旁样本。首先使用4%的多聚甲醛溶液将样本固定，然后将固定后的样本进行石蜡包埋，制成蜡块以供后续实验使用。免疫组化染色过程：石蜡切片经脱蜡以及水化处理后，进行抗原修复，接着涂覆封闭剂。之后加入Sall4一抗工作液，在4 ℃环境中过夜。随后用PBS溶液冲洗3次，再滴加二抗，并再次用PBS冲洗3次。之后进行DAB显色处理，随后苏木素复染，最后使用中性树胶封固。每次实验均配备阳性和阴性对照，并配有HE染色切片作为对照。免疫组化结果评估标准：双盲法观察切片，Sall4免疫组化阳性细胞表现为黄色或褐色着色。评分标准基于细胞染色强度和着色细胞所占比例，细胞着色比例的评分标准为0至4分，而细胞染色强度的评分为0至3分，每个病例的总评分范围为0至7分。根据得分，将Sall4表达水平划分为低表达组（≤ 3分）和高表达组（> 3分）^[6]。

1.3   胰腺癌细胞培养、筛选、细胞荧光与基因沉默实验

在本研究中，对5种胰腺癌细胞株（PANC-1、Capan-1、SW 1990、HPAC、HPAF-II）进行了培养、筛选与基因沉默实验。实验中，HPAC、PANC-1和SW 1990细胞株使用DMEM高糖培养基培养，而Capan-1和HPAF-II细胞株则通过RPMI-1640培养基培养。在适宜的生长条件下将所有细胞株培养至6孔板中融合率达到70% ～ 80%，随后提取蛋白，通过WB法检测Sall4的表达水平。同时进行细胞荧光实验，确定Sall4的表达定位。随机将实验中的细胞分为3组：shRNA-1抑制组、shRNA-2抑制组以及对照组。根据GenBank中的Sall4基因（NM-020436）数据，设计了2种短发夹RNA（shRNA）序列，分别为shRNA-1（5'-GCCTTGAAACAAGCCAAGCTA-3'）和shRNA-2（5'-GCCTTGAAGCAAGCCACGCTA-3'），对照组的shRNA序列为5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。用相应的RNA抑制序列分别转染shRNA-1组和shRNA-2组，而对照组不添加抑制序列，只添加转染试剂。转染操作步骤如下：将细胞培养至1×10⁵/孔密度，随后将细胞培养在24孔板中，直至细胞密度达到2×10⁵/孔；用含有polybrene（6 μg/mL）的转染液替换原培养基，并加入含有目标基因的病毒悬液接着培养；转染6 h后，将1.5 mL新鲜培养基添加到培养板中。持续培养1 天后使用新鲜培养基进行细胞培养；转染至第2天后进行荧光观察，并在转染效果最佳时收集各组细胞，进行后续的细胞功能实验。

1.4   WB法检测Sall4表达及细胞抑制筛选

在本实验中，首先从之前分组的细胞中提取蛋白，并进行蛋白质定量。之后，混合均匀上样缓冲液和蛋白样品，然后将上述混合液在沸水中加热以致蛋白质变性。接下来进行蛋白质电泳，准备好WB胶并进行上样，每个样孔大约添加30 μg蛋白，使用110 V的恒压电泳和220 mA的恒流转膜。转膜完成后，在TBS-T溶液中将PVDF膜快速漂洗10 s，并使用脱脂牛奶进行1 h封闭。随后，在内参抗体和目的抗体中孵育膜被，并在4 ℃环境过夜。第2天，通过TBS溶液洗膜3次，TBS-T溶液洗膜1次，加入二抗溶液，室温下孵育1 h。再次洗膜后曝光，分析结果条带。根据WB法的结果，首先对实验中的5个细胞株进行上述实验，筛选出Sall4高表达细胞株，同时对该细胞株进行Sall4转染抑制其表达，检测上述实验结果（部分操作和1.3相同）。

1.5   细胞侵袭与迁移能力的测定

本实验通过Transwell细胞侵袭试验以及细胞划痕试验评估细胞的迁移能及侵袭能力。Transwell细胞侵袭试验：准备阶段：在已预备好的Matrigel基质胶的24孔板中加入Transwell小室，并将其在培养箱中过夜；实验操作：在Transwell小室的下室加入10%FBS的DMEM高糖培养基500 μL。使用无血清的DMEM高糖培养液将各组细胞重悬，并加入100 μL细胞悬液（大约含有1×10⁵个细胞）于Transwell的上室；结果分析：48 h后，移除下室中的培养液，在4%的多聚甲醛中将小室固定15 min，将小室内侧膜上的细胞擦除。使用0.1%的结晶紫溶液染色15 min，随后用PBS缓冲液漂洗。在显微镜下观察并拍照，每孔随机选取5个视野进行统计分析。细胞划痕试验：准备阶段：将上述细胞在6孔板中培养，然后在无血清条件下持续饥饿24 h。实验操作：使用移液枪头对细胞层进行划伤，随后用PBS洗涤。结果分析：使用相差显微镜在0 h、24 h、48 h后拍照记录。通过手动计数方法测定细胞迁移抑制率，并以百分比形式表示。本研究的所有实验均进行了3次重复，以确保结果的可靠性和重复性。

1.6   统计学处理

本研究中的数据分析是通过SPSS19.0软件进行的。统计结果以均数±标准差 （$ \bar x \pm s $）表示，采用独立样本 t 检验比较 2 组变量， 应用单因素方差分析比较多组间变量，两两比较运用 LSD-t检验。在本研究中，当P < 0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   Sall4在胰腺癌组织中的表达及其与临床病理特征的相关性

在本研究的64例胰腺癌组织样本中，有28例Sall4（43.8%）呈阳性，蛋白表达阳性率高于癌旁组织5例（7.8%），同时，强阳性有16例，中等至弱阳性12例样本中。有11例胰腺癌患者发生了复发，且复发肿瘤的Sall4染色强度明显高于未复发肿瘤组织。根据表1所示结果，肿瘤的发生大小（P = 0.015）、发生位置（P = 0.049）、分化程度（P = 0.024）、AJCC分期（P = 0.004）及淋巴结转移（P = 0.038）与Sall4的表达之间存在显著相关性，见图1。

表  1  Sall4蛋白表达与临床病理特征的关系[n（%）]

Table  1.  Relationship between Sall4 protein expression and clinicopathological features[n（%）]

类别		n	SALL4阳性	χ2值	P值
性别	男	48	17	1.29	0.256
	女	16	11
年龄（岁）	≤ 60	29	18	2.10	0.148
	> 60	35	10
肿瘤直径（cm）	≤ 4	42	10	5.93	0.015**
	> 4	22	18
肿瘤位置	胰头	46	26	3.883	0.049**
	胰体尾	18	2
肿瘤分化程度	高中分化	45	12	5.119	0.024**
	低分化	19	16
肿瘤 AJCC 分期	Ⅰ	30	23	8.529	0.004***
	Ⅱ～Ⅲ	34	5
淋巴结转移	有	31	21	4.564	0.038**
	无	33	7
** P < 0.05； *** P < 0.005。

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图  1  胰腺癌患者Sall4免疫组化表达及对应组织HE染色情况（×200）

A：胰腺癌组织HE染色； B：胰腺癌组织Sall4染色； C：胰腺癌癌旁组织HE染色染色； D：胰腺癌癌旁组织Sall4染色； 注：A～D组均为肿瘤未复发组；E：胰腺癌组织HE染色； F：胰腺癌组织Sall4染色； G：胰腺癌癌旁组织HE染色染色；H：胰腺癌癌旁组织Sall4染色； E-H组均为肿瘤复发组。

Figure  1.  Immunohistochemical expression of Sall4 in pancreatic cancer patients and corresponding HE staining of tissues （×200）

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2.2   胰腺癌细胞株中Sall4表达量的筛选

在对各胰腺癌细胞株进行的Sall4表达量筛选中，分析显示，在所研究的胰腺癌细胞株中，PANC-1细胞株中Sall4相对表达量较高。同时实验研究发现Sall4在PANC-1细胞株中，主要表达定位为细胞核中，见图2。

图  2  不同胰腺癌细胞中的Sall4表达情况（$\bar x \pm s $，n = 3）

A: 不同胰腺癌细胞中的Sall4表达（WB）；B: PANC-1胰腺癌细胞中的Sall4表达（细胞荧光）。　　　　　　

Figure  2.  Expression of Sall4 in Different Pancreatic Cancer Cells（$\bar x \pm s $，n = 3）

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2.3   慢病毒载体在PANC-1细胞中对Sall4表达的抑制效果

在PANC-1细胞中，使用慢病毒载体对Sall4的表达进行抑制。Western Blot实验结果表明，对照组的Sall4相对表达量为（6.44±1.28），而shRNA-1组和shRNA-2组的表达量分别为（2.58±0.47）和（0.66±0.13）。与此同时，实时荧光定量PCR的结果也显示了相似的趋势，对照组的表达量为（8.66±1.27），shRNA-1组和shRNA-2组分别为（3.71±0.78）和（1.24±0.12）。在2个shRNA组中，Sall4表达均得到了抑制，其中shRNA-1组的抑制效果更为显著（P < 0.05），见图3。

图  3  胰腺癌细胞Sall4抑制（$\bar x \pm s $，n = 3）

A：shRNA抑制胰腺癌细胞PANC-1中的Sall4表达；B：shRNA抑制胰腺癌细胞PANC-1中的Sall4表达统计结果；^***P < 0.001。

Figure  3.  Sall4 inhibition of pancreatic cancer cells （$\bar x \pm s $，n = 3）

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2.4   慢病毒载体通过抑制Sall4表达对PANC-1细胞侵袭能力及迁移能力的影响

本研究中，使用慢病毒载体抑制PANC-1细胞中Sall4的表达，并观察抑制Sall4的表达后对细胞迁移和侵袭能力的影响。在PANC-1细胞中，对照组的细胞数量为（312.00±13.00），而shRNA-1组为（79.00±6.00）。shRNA-1组在PANC-1细胞中显著抑制了细胞的侵袭能力（P < 0.01）。相关的实验结果展示在图4中；在迁移实验中，通过慢病毒载体抑制Sall4表达，观察其对PANC-1细胞迁移能力的影响。实验结果显示，PANC-1对照组的细胞迁移率为（82.00%±13.00%），而经shRNA-1处理后显著降低至（40.00%±5.00%）。shRNA-1组在SW480细胞中有效抑制了细胞的迁移能力（P < 0.05）。见图4。

图  4  胰腺癌PANC-1抑制后侵袭结果和迁移结果

A: 胰腺癌PANC-1细胞在两组中的侵袭情况；B: 胰腺癌PANC-1细胞在2组中的侵袭情况结果统计; C: 胰腺癌PANC-1细胞在2组中的迁移情况; D: 胰腺癌PANC-1细胞在2组中的迁移情况统计；^*P < 0.05。

Figure  4.  Invasion and migration results of pancreatic cancer cells after PANC-1 inhibition

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3.   讨论

3.1   Sall4在胰腺癌中的作用及与DNA甲基化的关联

Sall4作为1种锌指转录因子，在胰腺癌中有表达，并与多种癌症的进展相关。Sall4在调节癌细胞增殖、凋亡、转移和耐药性方面发挥重要作用。胰腺癌迁移能力和侵袭性与肿瘤微环境密切相关。近期的研究表明，胰腺癌的表观遗传调控机制中，在基因表达调控中，DNA甲基化发挥着重要作用。Sall4通过表观遗传修饰调节与干细胞自我更新和分化有关的基因的表达。Sall4还通过表观遗传修饰调节其靶基因的表达，包括DNA甲基化、组蛋白调节等。相比于正常上皮细胞，肿瘤细胞表现出更强的DNA甲基化与RNA表达量的正相关关系，特别是在基因本体的DNA甲基化和基因启动子区域的DNA甲基化与RNA表达量的关系中更为显著。这说明DNA甲基化在肿瘤发生过程中对基因表达的调控作用得到了增强。

3.2   Sall4在肿瘤研究中的现状及作用

有研究提示胃癌中的Sall4是1种新发现的致癌基因，通过调节各种下游基因，参与肿瘤形成、肿瘤生长、肿瘤转移和药物抵抗^[4−7]。它与β-连环蛋白相互作用，激活Wnt/β-连环蛋白信号通路，导致Wnt/β-连环蛋白途径的靶基因（如cyclin D1和c-Myc）的上调。Sall4还可能通过与β-连环蛋白的相互作用或通过招募组蛋白甲基转移酶复合物到特定启动子区域，介导H3-K4三甲基化和转录激活，从而激活CD44的表达。CD44是1种细胞表面粘附分子，在细胞增殖、分化、粘附、迁移和侵袭中起着关键作用，并且对上皮-间质转换（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）和癌症发展至关重要。CD44也被认为是癌症干细胞标记。CD44在胃癌中的表达增加，并且与肿瘤分期和肿瘤转移呈正相关，是胃癌的独立预后因子^[7−9]。研究观察到，敲低Sall4导致胃癌细胞中CD44的下调，而在Sall4敲低细胞中过表达CD44增加了体外的癌细胞增殖、迁移和侵袭，以及小鼠模型中的肿瘤生长。在胃癌患者样本中，Sall4和CD44的表达呈正相关，它们的表达增加与不良预后相关^[10−11]。ChIP研究表明，内源性Sall4蛋白能够直接结合到胃癌细胞中CD44的启动子区域，表明CD44是Sall4的直接靶标。这项研究提供了关于Sall4在癌症中的致癌功能的新见解，并表明，针对Sall4-CD44通路的靶向耗竭可能是1种新的抗癌治疗方法^[12−14]。

3.3   Sall4在胰腺癌中的表达及对细胞侵袭和迁移的影响

研究表明Sall4的高表达与胰腺癌的不良预后相关，并且Sall4基因的表达及其转录标记主要与间质通路相关联，这表明Sall4通过产生和维持胶原蛋白网络在基质支持中起重要作用。尽管这项研究集中在胃癌上，但Sall4和CD44及其在细胞增殖、迁移和侵袭中的作用的分子机制，可能也与胰腺癌相关，鉴于这些因素在癌症进展中更广泛的参与。需要进一步的研究来确认这些机制和治疗策略在胰腺癌背景下的具体情况。然而，胰腺癌的发生和发展涉及多种基因和信号通路的异常，是一个复杂的多步骤过程。Sall4的作用可能不仅限于单一的信号通路或靶基因，它可能与多种信号通路和效应器相互作用，共同推动肿瘤的进展^[14−16]。同时，Sall4还可能通过招募组蛋白甲基转移酶复合物到特定启动子区域，介导染色质的改造，从而影响多个基因的表达^[15−17]。在致力于揭示Sall4在胰腺癌中的作用机制的同时，还需注意到肿瘤微环境在肿瘤发展中的重要作用。肿瘤微环境的各种成分，如基质细胞、免疫细胞以及细胞外基质，都可能影响Sall4的表达和功能，进而影响胰腺癌细胞的侵袭和迁移能力。

在本研究中，笔者发现高表达的Sall4在胰腺癌患者中更易复发，且与肿瘤的淋巴转移，分级级预后相关。研究揭示，通过抑制Sall4的表达，可以减弱PANC-1胰腺癌细胞的迁移能力和侵袭能力。因此，Sall4有望成为治疗胰腺癌的潜在靶点以及胰腺癌药物研发的新方向。