Identify Key Mitochondrial Autophagy Genes in Schizophrenia through Integrated Bioinformatics Approaches
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摘要:
目的 利用3D脑类器官的单细胞及外周血转录组数据，结合机器学习，深入分析线粒体自噬基因在精神分裂症（schizophrenia，SCZ）中的作用。 方法 结合两种机器学习算法，通过外周血RNA测序数据，识别精神分裂症和健康对照组之间表达存在差异的线粒体自噬相关基因，探讨线粒体自噬基因与免疫细胞和炎症因子间的相互关系；利用单细胞综合分析，探讨基于线粒体自噬基因的信号通路和特异性转录因子。 结果 通过机器学习，鉴定了7个在精神分裂症患者中表达的关键线粒体自噬基因。基于Mitoscore分析，在单细胞层面，现高线粒体自噬活性的神经元（Mitohigh_Neuron）通过SPP1信号通路与内皮细胞形成新的相互作用。 结论 鉴定了精神分裂症患者中两种具有线粒体自噬特征的亚型及7个关键线粒体自噬基因，为理解该病的发病机制提供新的视角。 Abstract:Objective To utilize single-cell and peripheral blood transcriptomic data from 3D brain organoids, combined with machine learning, to analyze the role of mitochondrial autophagy genes in schizophrenia （SCZ）. Methods By integrating two machine learning algorithms, we identified differentially expressed mitochondrial autophagy-related genes between schizophrenia patients and healthy controls using peripheral blood RNA sequencing data. The relationship between mitophagy gene, immune cells and inflammatory factors was further explored. Comprehensive single-cell analysis was used to explore the signaling pathways and specific transcription factors based on mitophagy genes. Results Using machine learning, seven key mitophagy genes expressed in schizophrenia patients were identified. Based on Mitoscore analysis, at the single-cell level, neurons with high mitochondrial autophagy activity （Mitohigh_Neuron） formed new interactions with endothelial cells via the SPP1 signaling pathway. Conclusion This study identified two subtypes of mitophagy and seven key mitophagy genes in schizophrenia, providing new insights into the pathogenesis of the disease. -
Key words:
- Schizophrenia /
- Mitochondrial autophagy /
- Neurons /
- Single-cell sequencing /
- Machine learning
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癌症是危害身体健康的一类严重疾病，胶质瘤是原发性颅脑肿瘤中最常见的1种[1]，具有复发率高、侵袭性强以及容易产生耐药性的特点。据最新的脑胶质瘤诊疗指南指出，脑胶质瘤的年均患病率为5～8/10万[2]。同时最近的流行病学调查表明，5 a以内恶性胶质瘤病死率较高，并且高级别胶质瘤5 a内的生存率仅为5%，对患者的生活影响很大[3]。然而，胶质瘤的发病机制暂不明确，目前主要的治疗方案是最大程度的手术切除及术后放化疗综合治疗，但由于治疗效果欠佳，使得胶质瘤成为目前临床上最具挑战性的疾病之一[4]。因此，探索胶质瘤的发病机制，研究新的分子治疗靶点，为未来胶质瘤的治疗提供新的思路尤为重要。
三结构域蛋白（tripartitemotif，TRIM）家族是具有锌指结构域、B盒结构域和卷曲螺旋结构域3种结构域的1种家族蛋白[5]，属于E3泛素连接酶，具有调节细胞周期、细胞信号转导及转录调控等作用。TRIM蛋白家族成员中有很多亚类的作用已被发现[6−7]，例如：小鼠自身的TRIM67的缺失会造成行为缺陷，并且TRIM67在神经系统的发育及功能的维持中发挥作用[8−9]；同时TRIM17能够通过介导抗凋亡Bcl-2家族成员Mcl-1的泛素化和降解启动神经元凋亡[10]。在胶质瘤中，目前的研究证实TRIM8[11−12]、TRIM14[13−14]、TRIM24[15]等多种蛋白参与其发展，然而关于TRIM48在胶质瘤中的研究较少，于2011年TRIM48被首次报道，属人类特异性TRIM家族[16]。本课题组通过构建过表达TRIM48的多种胶质瘤细胞系，证实了过表达TRIM48通过阻断ERK1/2信号通路对胶质瘤细胞的生长具有抑制作用[17]；同时与正常脑组织相比，在胶质瘤患者脑组织中TRIM48的mRNA和蛋白表达水平明显降低。因此，笔者希望通过体内实验进一步求证TRIM48在胶质瘤动物模型中的作用以及机制，为未来TRIM48作为胶质瘤治疗的靶点提供理论依据。
本研究通过裸鼠皮下瘤模型和组织芯片，揭示了过表达TRIM48能够通过抑制细胞增殖、细胞生长起到阻滞胶质瘤的作用，同时阻断ERK1/2信号通路可能是其作用机制。
1. 材料与方法
1.1 主要试剂与材料
U87细胞购自普诺赛生物公司；雌性免疫缺陷鼠购自子源实验动物公司；人脑胶质瘤及匹配癌旁组织芯片（含脑胶质瘤及匹配癌旁脑组织芯片，包含20例脑胶质瘤及匹配癌旁脑组织）购自中科光华智能生物公司。DMEM高糖培养基购自Biosharp公司（BL304A）；胎牛血清购自Gibco公司；青霉素-链霉素溶液购自索莱宝公司；转染试剂购自Invitrogen公司；伊红染色液、BCA试剂盒购自索莱宝公司；改良Harris苏木素染色液购自雷根生物公司；Alexa Fluor488标记山羊抗兔IgG（H+L）、Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG（H+L）、Alexa Fluor 555标记驴抗兔IgG（H+L）、Alexa Fluor 555标记驴抗小鼠IgG（H+L）购自碧云天生物技术公司；Ki-67抗体购自Abcam公司（ab16667）；TRIM48抗体购自Invitrogen公司（PA5-69777），ERK1/2抗体、p-ERK1/2抗体购自CST公司；beta Actin购自Proteintech公司；羊抗兔HRP标记二抗、羊抗鼠HRP标记二抗购自中杉金桥公司；总RNA提取试剂、Water Nuclease-Free、DEPC、Hifair® Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit、Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix购自翌圣生物公司。
1.2 细胞培养、转染及处理
人胶质瘤U87细胞使用89 % DMEM高糖培养基，加入10 %的胎牛血清和1 %的青霉素-链霉素溶液，在环境为5 % CO2、37 ℃的培养箱中培养。根据我们之前研究构建慢病毒介导的过表达TRIM48胶质瘤细胞的方法，使用Lipofectamine 2000转染试剂（Invitrogen，11668027）按照说明书要求构建过表达TRIM48胶质瘤细胞和空载胶质瘤细胞，转染后48 h建立稳定的过表达TRIM48和空载胶质瘤细胞株。通过Western blot进行验证。
1.3 裸鼠皮下瘤模型
12只4～6周龄SPF级裸鼠（许可证编号：SCXK（浙）2019-0004），饲养环境温度保持在22±1 ℃，湿度保持在65～70 %，12 h明暗交替，可自由饮水。
将12只裸鼠随机均分为过表达TRIM48组（oeTRIM48组）和空载组（Vector组），将过表达TRIM48和空载细胞，以每只裸鼠5×106个细胞的密度分别植入裸鼠右前腋皮下。监测裸鼠肿瘤生长情况，每3 d测定肿瘤体积。接种4周后过量麻醉法处死裸鼠，取出肿瘤组织，记录相关数据，以反映体内胶质瘤细胞的体内成瘤情况。所有动物实验均经昆明医科大学动物实验伦理委员会批准（批准号：kmmu20220805）。
1.4 肿瘤组织HE染色
对实验动物处死以后，迅速用剪刀剪取小块肿瘤组织，切成2～3 mm厚；用生理盐水冲洗后，在固定液中固定30 min；流水冲洗过夜；将组织按70 %、80 %、90 %乙醇脱水30 min，再用95 %、100 %乙醇各脱水2次每次20 min；使用二甲苯与乙醇透明至光线可以透过，去除组织中的乙醇；在58 ℃恒温箱中，使用二甲苯和石蜡去除组织中的透明剂，使石蜡渗透在组织内部；包埋、切片、展片贴片；再使用从高到底的乙醇溶液脱蜡复水；放入苏木精中染色20 min；流水冲洗15 min；切片放入盐酸乙醇液中5 s至变为红色；放入流水中变为蓝色；经脱水、伊红复染、脱水、透明、中性树胶封存；光学显微镜观察。
1.5 组织芯片免疫组化
将玻片置于60 ℃恒温烘箱中烤片30 min后，依次置于100 %、95 %、90 %、80 %、70 %乙醇中5 min，蒸馏水中3 min，PBS冲洗3次每次3 min；封闭通透液浸润30 min，PBS冲洗3次每次3 min；采用柠檬酸钠缓冲溶液进行抗原修复，暴露抗原决定簇；PBS冲洗3次每次3 min，组化笔圈出所需组织并加入羊血清，室温20 min；清除血清，加入稀释好的一抗，湿盒孵育1 h，4 ℃过夜；于37 ℃复温40 min，去除一抗，PBS冲洗5次每次5 min，加入二抗37 ℃孵育40 min，PBS冲洗5次每次5 min；加入SP后37 ℃ 40 min，PBS冲洗5次每次5 min；加入DAB显色；苏木素复染、脱水、透明、封片；显微镜观察。
1.6 免疫组织荧光
将固定液中肿瘤组织取出，脱水透明浸蜡包埋切石蜡切片。将玻片置于60 ℃恒温烘箱中30 min，脱蜡水化。使用柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复，PBS洗4次每次3 min。加入稀释好的Ki-67，4 ℃过夜，PBS洗4次每次3 min，加入稀释后的AF-488标记的山羊抗兔二抗（1∶200），常温避光孵育1 h；PBS洗4次每次3 min，加入含DAPI的抗荧光猝灭封片剂（1∶500）稀释封片。正置显微镜拍照。
1.7 Western blot
于冰上将肿瘤组织彻底剪碎，加入裂解液充分裂解研磨，裂解后4 ℃条件下12000 rpm/min离心10 min取出上清，BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度，具体方法参照试剂盒说明书；根据测定的样品浓度进行调整，使用上样缓冲液稀释5倍后水浴锅煮蛋白10 min。以10 % SDS-PAGE凝胶进行电泳，每孔上样量25 μg蛋白，电转至PVDF膜，将膜裁剪后，放入含有封闭液的小盒中，室温下摇床封闭30 min；稀释好的ERK1/2、p-ERK1/2、TRIM48和β-actin抗体4℃过夜孵育，用TBST洗膜5次每次5 min，室温在摇床上孵育二抗1h，TBST洗膜5次每次5 min，ECL发光显色，Image J对条带进行灰度相对定量分析。
1.8 qRT-PCR
取-70 ℃冻存动物肿瘤组织在液氮中充分研磨，加入2 mL Trizol试剂进行组织裂解，常温下放置5 min；加入0.4 mL氯仿用手震荡10 s，常温放置3 min后，4 ℃条件下12000 rpm离心15 min；取上清加入1 mL异丙醇，4 ℃条件下12000 rpm离心10 min；弃上清，加入2 mL 75 %乙醇涡旋，4 ℃条件下7500 rpm离心5 min，弃上清；干燥后，加入无核酸酶水溶解。根据产品说明书要求，合成第1链cDNA，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测各组织TRIM48 mRNA的表达，所用引物序列见表1。采用两步法qRT-PCR，反应条件：95 ℃ 5 min使模板变性，然后40个循环：95 ℃变性10 s；60 ℃退火20 s；72 ℃延伸25 s。最后72 ℃保持5 min后，降温至10 ℃终止反应。以β-actin为内参基因。目的基因的相对表达量用2-ΔΔCT法计算。
表 1 PCR引物Table 1. PCR primers引物名称 目的基因 序列（5'→3'） 产物大小（bp） Forward primer 1 TRIM48 AGCACCGGTATCACAGACAC 162 Reverse primer 1 TRIM48 TGTCTCCAAAAGCCTTCCAGTG 162 Forward primer 2 β-actin AGGATTCCTATGTGGGCGAC 273 Reverse primer 2 β-actin ATAGCACAGCCTGGATAGCAA 273 1.9 统计学处理
用GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析，结果用均数±标准差（$\bar x \pm s $）表示。先进行方差齐性检验，2组比较采用t 检验，多组比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 过表达TRIM48组与空载组相比，胶质瘤体积、重量显著减少，并发生明显病理改变
使用过表达TRIM48的胶质瘤细胞系构建裸鼠皮下瘤模型，分为oeTRIM48组和Vector组，检测成瘤后2组胶质瘤组织重量、体积以及HE染色情况来确定过表达TRIM48对胶质瘤生长的作用；oeTRIM48组小鼠肿瘤重量、体积与Vector组小鼠相比明显降低且具有统计学意义（P < 0.0001），见图1A、1B；HE染色提示Vector组细胞密集，细胞形态多以梭形为主，核异型性大、细胞多形性、核分裂活性高，呈弥漫生长模式；oeTRIM48组细胞核明显减小，核分裂象减少，细胞形态以圆形为主，见图1C。
图 1 过表达TRIM48对胶质瘤生长的影响A：肿瘤组织重量；B：肿瘤组织体积；C：肿瘤组织HE染色（×200）；n=6； ****P < 0.0001。Figure 1. Effect of TRIM48 overexpression on glioma growth2.2 增殖标记物Ki-67在过表达TRIM48组中显著降低
基于以上结果，探究过表达TRIM48对胶质瘤组织增殖活性方面的影响。免疫荧光显示，oeTRIM48组Ki-67阳性区域的面积百分比与Vector组相比明显降低（P < 0.0001），见图2；表明与oeTRIM48组相比，Vector组处于生长期的肿瘤细胞比例更高，oeTRIM48组肿瘤增殖活性、侵袭性相对较低。
图 2 过表达TRIM48影响胶质瘤组织增殖活性n=5，****P < 0.0001。Figure 2. Overexpression of TRIM48 affects the proliferation activity of glioma tissues2.3 成功构建过表达TRIM48模型，过表达TRIM48抑制ERK1/2信号通路的激活
通过上调TRIM48表达，设置oeTRIM48组和Vector组进行对照，以研究TRIM48对胶质瘤的作用和机制。通过qRT-PCR、Western blot检测oeTRIM48组TRIM48蛋白（P < 0.0001）与mRNA （P < 0.05）表达明显升高，说明过表达模型构建成功，见图3A；Western blot显示肿瘤组织中oeTRIM48组ERK1/2无明显变化，p-ERK1/2显著降低（P < 0.01），见图3B。结果显示过表达TRIM48能够显著抑制磷酸化ERK1/2的表达，然而对ERK1/2没有影响。
图 3 过表达TRIM48对ERK1/2通路的调控A：qRT-PCR和Western blot检测转染结果；B：Western blot检测过表达TRIM48对ERK1/2信号通路激活情况。n=6； ns：差异无统计学意义；*P < 0.05；**P < 0.01；****P < 0.0001。Figure 3. Regulation of ERK1/2 pathway by overexpression of TRIM482.4 TRIM48和p-ERK1/2在胶质瘤组织中分别呈低表达和高表达，而在癌旁组织中相反
通过免疫组化评估胶质瘤患者对应的组织芯片中p-ERK1/2、TRIM48的表达。与相匹配的癌旁组织相比，p-ERK1/2在肿瘤细胞中阳性表达上升；TRIM48在肿瘤细胞中阳性表达下降。TRIM48和p-ERK1/2在胶质瘤组织和癌旁组织中表达差异具有统计学意义（P < 0.0001），见图4。
图 4 胶质瘤患者组织芯片中TRIM48与ERK1/2信号通路之间的关系（×200）A：通过免疫组化检测组织芯片中胶质瘤患者肿瘤组织及匹配癌旁组织TRIM48与p-ERK1/2表达情况；B：p-ERK1/2在肿瘤组织与癌旁组织中的阳性区域；C：TRIM48在肿瘤组织和癌旁组织中的阳性区域；n=6；****P < 0.0001。Figure 4. Direct relationship between TRIM48 and ERK1/2 signaling pathway in glioma tissue microarray （×200）3. 讨论
Ki-67是1类主要在细胞周期G1、S、G2及M期中表达的核蛋白，它的定位和表达与细胞周期密切相关，常作为一种稳定的标志物被广泛应用于检测包括恶性胶质母细胞瘤在内的多种人类肿瘤的增殖活性[18−19]。一方面，Ki-67被称为增殖标志蛋白，但是目前的研究在探索上调或者下调其表达时并未阐述对细胞增殖的影响[20−21]；另一方面，在肿瘤中的作用及机制依然是人们认可和研究的重点。有研究指出Ki-67在多种肿瘤的发生、进展、转移以及耐药性过程中起到关键作用[22]。在胶质瘤中，Ki-67与该病的组织病理学分级相关[23]。尤其在GBM中，较高的Ki-67意味着肿瘤进展加快和生存率降低，这些结果都证明了Ki-67在肿瘤检测中的意义，其异常表达往往意味着肿瘤增殖能力发生了变化。因此在本研究中，笔者检测了在过表达TRIM48时Ki-67的变化情况，试图发现TRIM48对胶质瘤增殖方面的影响；发现oeTRIM48组Ki-67的降低表明过表达TRIM48能够抑制Ki-67在细胞周期中的表达，但其具体的作用机制以及在细胞周期哪一阶段发挥作用尚需进一步研究。
RAS-RAF-MEK-ERK （MAPK）信号通路是将胞外的细胞因子、激素、细胞应激等信号传导入胞内的重要途径，在信号通路中p-ERK1/2是通路激活的标志。在信号通路中，ERK作为上游信号的效应激酶处于信号传导的关键位置-上游信号经级联反应从RAS-RAF-MEK-ERK依次传递，激活后的ERK从细胞质转移至细胞核，从而激活多种与细胞增殖、分化、迁移和血管生成相关的底物。RAS、RAF、MEK异常激活普遍存在于人类癌症中，这些上游突变均可导致ERK的过度激活，并持续激活ERK下游底物，导致肿瘤细胞向恶性程度更高的方向转变。目前，有多种靶向RAS等突变的药物被批准用于癌症治疗或者处于研发阶段，但长期治疗产生获得性耐药降低了这些药物的疗效。ERK1/2具有典型的蛋白激酶特征结构双叶型折叠，通过磷酸化底物对细胞生命活动进行调控。其N端结构结合ATP以定位其β和γ磷酸基团，而C端结构则催化ATP的磷酸基团转移到ERK1/2的底物上。在这个信号通路中，ERK1/2是MEK的唯一底物，却可以磷酸化数百种下游细胞质和细胞核底物。因此，p-ERK1/2表达的高低是影响信号通路作用的关键。
ERK1/2信号通路在胶质瘤中呈现异常激活状态，并参与胶质瘤发生发展。大量的研究证实了其在胶质瘤中的作用[24−25]，黏蛋白MUC15的表达高低能够通过影响ERK信号通路的激活调控胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[26]。肿瘤微血管生成是胶质瘤的突出特点，在对ERK信号通路的靶向治疗中体现了部分抗血管生成作用[25]。基于ERK信号通路在胶质瘤中的重要作用，探究了TRIM48与ERK信号通路之间的关系。本课题组经过前期的研究发现，胶质瘤细胞中TRIM48高表达与ERK1/2信号通路呈负相关，同时经过体内实验的研究进一步证实，TRIM48与p-ERK1/2的表达在胶质瘤组织中呈负相关。因此推测，TRIM48过表达能够通过抑制ERK1/2信号通路的激活，从而抑制人脑胶质母细胞瘤的生长。在TRIM48抑制ERK1/2信号通路激活的基础上，是否影响了胶质瘤中血管生成、胶质瘤治疗耐药性是后续值得探讨的关键问题。
TRIM48编码1种E3泛素连接酶的蛋白质，通过调节多种信号通路发挥调控功能，如介导细胞周期相关因子的磷酸化作用，影响凋亡及坏死过程等。本课题组的研究表明，过表达TRIM48能够抑制多种胶质瘤细胞系以及裸鼠胶质瘤模型中胶质瘤的生长和增殖，而且TRIM48的作用机制很有可能是通过抑制ERK1/2信号通路实现的。另外，有研究发现TRIM48能够泛素化降解凋亡信号调节激酶1（apoptosissignal-regulatingkinase1，ASK1）抑制物精氨酸甲基转移酶1（protein arginine n-methyltransferase 1，PRMT1），从而激活ASK1和诱导细胞死亡[17，27−29]。在肝细胞癌中，胸苷激酶1能够通过与PRMT1相结合，抑制了TRIM48的作用促进了肝细胞癌的恶性进展[27]。因此推测，过表达TRIM48激活ASK1能够抑制肿瘤细胞生长，说明TRIM48对肿瘤发生、发展起着重要作用。然而，TRIM48在胶质瘤中对ERK1/2信号通路的抑制是否与ASK1有关有待进一步确定。虽然TRIM48在胶质瘤中的作用机制尚未完全阐明，但是TRIM48在胶质瘤中的作用给未来靶向治疗胶质瘤提供了新的选择。
以笔者现有的研究结果，TRIM48通过抑制ERK磷酸化，可以直接阻断肿瘤细胞增殖的关键信号，减缓或停止胶质瘤的生长。这是因为ERK磷酸化是推动细胞周期进程、促进细胞分裂和增殖的重要机制。ERK信号通路在调节细胞迁移和侵袭中也发挥作用，抑制ERK磷酸化能够减少胶质瘤细胞的迁移能力和侵袭性，从而限制肿瘤的局部扩散和远处转移。ERK通路的抑制可以恢复肿瘤细胞对凋亡信号的敏感性，促进异常细胞的程序性死亡，有助于减少肿瘤负担；从而增强胶质瘤对放化疗的耐受性，胶质瘤对化疗和放疗的耐药性是治疗失败的重要原因之一。抑制ERK磷酸化可能改变肿瘤细胞的生存环境，增强其对现有治疗手段的敏感性，从而提高治疗效果。TRIM48不仅是可能的治疗靶点，还可能作为预测治疗反应或疾病预后的生物标志物。在治疗前后测定其表达或活性水平，可能帮助评估治疗效果和监测疾病进展。基于TRIM48对ERK磷酸化的抑制作用，提供了1种新的治疗策略，有可能与现有治疗方法（如手术、放疗、化疗和免疫疗法）结合，以实现更加个性化和有效的综合治疗方案。
基于对TRIM48在胶质瘤中的研究，依然存在以下几点问题值得后续深入探讨：（1）在HE染色的过程中，笔者发现虽然胶质瘤组织发生了一定程度的病理改变，但是在部分切片中血管生成方面没有发现明显抑制作用；如果排除实验操作的问题，这是否是后续TRIM48靶向药物与抗血管生成药物联合治疗的前提？（2）由于体内实验的局限性，TRIM48在不同等级、不同类型胶质瘤中是否具有相同的作用及机制？从这2点问题出发，这需要在后续研究中探讨抗血管生成与TRIM48作用之间的联系；并从临床上不同等级、不同类型胶质瘤患者组织中发现TRIM48的表达与预后、治疗效果等方面的问题。
尽管TRIM48的具体作用机制在肿瘤领域尚需进一步研究和验证，但它作为E3泛素连接酶的功能、参与信号通路的调节和影响基因表达的能力，为其在肿瘤发展及治疗抵抗性中的潜在作用提供了理论基础。未来的研究有望揭示TRIM48在特定类型的肿瘤中的角色，为开发新的治疗策略提供依据。由于胶质瘤本身的特性，在治疗手段上应该从多方面同时入手，未来可以尝试采用多靶点联合用药的方式。然而，多靶点联合用药的弊端也是不容忽视的，需要注意不同药物之间的相互作用以及毒副作用。因此，克服血脑屏障的障碍，抵消或者减轻药物副作用，是未来胶质瘤治疗研究的重点问题。
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图 1 在SCZ中表达的24个线粒体自噬基因分析
A：SCZ组与CT组24个线粒体自噬基因热图；B：SCZ组与CT组差异表达基因集与线粒体自噬基因集交集火山图；C：SCZ组与CT组24个线粒体自噬基因的条形图。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001。
Figure 1. Analysis of 24 mitochondrial autophagy genes expressed in SCZ
图 2 线粒体自噬基因相互作用关系图
A：24个显著差异线粒体自噬基因的热图；B：6个显著差异表达线粒体自噬基因的热图；C：CSNK2B与TOOM40的相关性；D：CSNK2B与TOOM20的相关性；E：CSNK2B与MAP1LC3A的相关性；F：CSNK2B与MAP1LC3B的相关性；G：CSNK2B与MFN1的相关性。
Figure 2. Diagram of mitophagy gene interactions
图 3 基于机器学习获得的7个关键线粒体自噬基因建立的诊断模型和OR值
A：由7个关键线粒体自噬基因建立的诊断模型的ROC曲线；B：由7个关键线粒体自噬基因建立的诊断模型OR值的森林图。
Figure 3. Diagnostic model established based on seven key mitochondrial autophagy genes obtained through machine learning and their OR values
图 4 分析线粒体自噬基因与免疫细胞浸润的关系
A：24个线粒体自噬基因与19个免疫细胞的CIBERSORT相关性分析热图；B：7个关键线粒体自噬基因与19个免疫细胞的CIBERSORT相关性热图；C～I：7个关键线粒体自噬基因：MFN1，TOMM40，MAP1LC3B，CSNK2A2，PGAM5，CSNK2B，ATG12和Neutrophils_MCPcounter丰度的相关性分析。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001。
Figure 4. Analysis of the relationship between mitophagy genes and immune cell infiltration
图 5 7个关键线粒体自噬基因与28个炎症因子的相关性热图分析
*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001。
Figure 5. Heat map analysis of correlation between 7 top mitophagy genes and 28 inflammatory factors
图 6 基于线粒体自噬基因表达和免疫谱的不同亚型SCZ患者分析
A：两种亚型中24个线粒体自噬基因的相关热图；B：两种亚型的年龄相关性分析；C：两种亚型的性别相关分析；D：两种亚型核心基因构建的临床诊断预测模型的相关性分析；E：两种亚型中24个线粒体自噬基因差异表达分析柱状图；F：两种亚型免疫细胞浸润评分的差异分析；G：炎症因子在两种亚型中的差异表达分析。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001。
Figure 6. Analysis of different subgroups of SCZ patients based on Characteristics of mitophagy gene expression and immunologic profile
图 7 WGCNA和fGSEA分析结果
A：经过一致性评分，将SCZ样本分为两种稳定类型：Cluster1和Cluster2；B：WGCNA分析的尺度独立性（左图）和平均连通性（右图）；C：基因聚类图；D：12个模块与两类SCZ样本之间的特征关联图；E：red模块中关键基因的GO分析条形图；F：两类SCZ样品生物过程富集分析聚类图。
Figure 7. Results of WGCNA and fGSEA analysis
图 8 SCZ与CT供体来源的3D脑类器官的单细胞特征比较
A：CT和SCZ的单细胞簇结果鉴定出19个细胞簇的UMAP图；B：每个亚簇中显著标记基因表达谱的气泡图；C：单细胞主成分分析主要集中在6个成分：星形胶质细胞、神经元、增殖细胞、内皮细胞、少突胶质细胞和髓系细胞；D：神经元线粒体自噬评分的两个UMAP图；E：SCZ组和CT组神经元亚群线粒体自噬评分差异有统计学意义（P < 0.0001）；F：神经元单细胞降维注释得到的12个神经元细胞亚群；G：12个神经细胞亚群线粒体自噬谱小提琴图；H：对线粒体自噬评分的神经元亚群进行逆向时序分析，线粒体自噬评分高的第9组主要位于发育轨迹的末端。
Figure 8. Single-cell profiles of SCZ versus CT donor-derived 3D brain organoids
图 9 特异性转录因子亚细胞簇的差异分布
A：高线粒体自噬评分的第9簇和低线粒体自噬评分的第11簇；B：7个特定转录因子在亚细胞簇9和11中的分布差异。
Figure 9. Differential distribution of subcellular clusters of specific transcription factors
图 10 细胞通讯结果
A：细胞群之间相互作用数量的统计分析。向外的箭头表示表达配体的细胞，指向配体的箭头表示表达受体的细胞；B：交互作用的概率/强度值（强度是概率值的总和）；C：在气泡图中显示多个配体-受体介导的细胞关系之间的相互作用；D：细胞信号传导模式，横轴为细胞类型，纵轴为通路；E：配体-受体信号通路CALCR、VISFATIN、SPP1介导的细胞间相互作用热图；F：细胞亚组中显著差异转录因子的曲线下面积（AUC）值热图；G：两个细胞亚群中显著差异转录因子的平均调控活性；H：两个细胞亚群特异性转录因子评分指标散点图。
Figure 10. Cell communication results
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