Galangin Inhibits the Migration and Invasion of Cervical Cancer Hela Cells Through Hippo/YAP Pathway
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摘要:
目的 探讨高良姜素对宫颈癌Hela细胞迁移、侵袭能力的影响及其潜在机制。 方法 用不同浓度的高良姜素（0、5、10、20、40、60、80、100 µmol/L）干预宫颈癌细胞48 h，采用 CCK-8 实验检测高良姜素对细胞活力的影响及筛选高良姜素的半数致死量（IC50）；将Hela细胞分为对照组（0 μmol/L）和高良姜素组（40 μmol/L处理）。划痕愈合实验和Transwell小室法分别检测各组细胞的迁移和侵袭能力，Western blot法检测各组细胞中E-cadherin、 N-cadherin蛋白的表达；DIA定量蛋白质组学技术检测并筛选两组之间的差异表达蛋白质；利用KEGG Pathway、基因集富集分析（GSEA）方法对差异基因进行生物学功能富集分析；Western blot法验证富集的Hippo/YAP信号通路相关蛋白YAP和p-YAP表达水平。 结果 与对照组比较，高良姜素以浓度依赖性方式抑制宫颈癌Hela细胞活性（P < 0.001）；与对照组比较，高良姜素（40 μmol/L）干预后宫颈癌Hela细胞的划痕愈合能力和侵袭能力明显降低（P < 0.001）；与对照组比较，高良姜素组（40 μmol/L）E-cadherin蛋白表达升高（P < 0.05）、 N-cadherin 蛋白表达降低（P < 0.001）；KEGG和GSEA富集结果发现，高良姜素抑制宫颈癌恶性进展与Hippo/YAP信号通路显著相关，Western blot验证发现Hippo信号通路中标志性蛋白p-YAP蛋白表达水平升高（P < 0.01），YAP蛋白表达降低（P < 0.05）。 结论 高良姜素作用于Hela 细胞后，抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并表现出剂量依赖；其机制可能与Hippo/YAP信号通路激活相关。 -
关键词:
- 高良姜素 /
- 宫颈癌 /
- 迁移 /
- 侵袭 /
- Hippo/YAP信号通路
Abstract:Objective To investigate the effects of galangin on the migration and invasion abilities of cervical cancer Hela cells and its potential mechanisms. Methods Hela cells were treated with different concentrations of galangin （0, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 µmol/L） for 48 hours, and CCK-8 assay was used to assess the impact of galangin on cell viability and to determine the half-maximal lethal concentration （IC50） of galangin. Hela cells were divided into a control group （0 μmol/L） and a galangin group （40 μmol/L treatment）. Scratch wound healing assays and Transwell chamber assays were conducted to evaluate the migration and invasion abilities of the cells in each group. Western Blot was used to detect the protein expression of E-cadherin and N-cadherin. DIA quantitative proteomics technology was used to detect and screen the differentially expressed proteins between the two groups. Biological function enrichment analysis of the differential genes was performed using the KEGG Pathway and Gene Set Enrichment Analysis （GSEA） methods. Western Blot was used to verify the expression levels of Hippo/YAP signaling pathway-related proteins YAP and p-YAP. Results Compared to the control group, galangin （40 μmol/L） significantly inhibited the viability of Hela cells in a concentration-dependent manner （P < 0.001）. Compared with the control group, the scratch healing ability and invasion ability of cervical cancer Hela cells treated with galangin（40 μmol/L） were significantly reduced （P < 0.001）. The expression of E-cadherin protein was increased （P < 0.05） and the expression of N-cadherin protein was decreased （P < 0.001） in the galangin group （40 μmol/L） compared to the control group. KEGG and GSEA enrichment results indicated that the inhibition of malignant progression in cervical cancer by galangin was significantly associated with the Hippo/YAP signaling pathway. Western Blot confirmed that the expression level of the hallmark protein p-YAP in the Hippo signaling pathway was increased （P < 0.01）, while the expression level of YAP protein was decreased （P < 0.05）. Conclusion Galangin inhibits the proliferation, migration and invasion abilities of Hela cells in a dose-dependent manner. The underlying mechanism might be associated with the activation of the Hippo/YAP signaling pathway. -
Key words:
- Galangin /
- Cervical cancer /
- Migration /
- Invasion /
- Hippo/YAP signaling pathway
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重症监护室（intensive care unit，ICU）内收治的主要为心脏骤停、重症创伤、急性呼吸衰竭、急性循环衰竭等危急重疾病患者，ICU患者因免疫力、机体状态相对其他科室患者较差且临床治疗多采用免疫抑制剂、抗生素等，因此感染风险更大，其中以呼吸道感染为主，对患者预后影响极大[1]。目前临床主要肺活检微生物培养对其进行检验，但时效性较差，易造成病情延误，使得疾病进一步发展，增加了治疗的难度[2]。因此，快速、准确的ICU呼吸感染诊断方式成为业界所需，早降钙素原（procalcitonin，PCT）在受炎症反应刺激后水平会快速上升，对感染性疾病的诊断价值较高[3]。白细胞计数（white blood cell count，WBC）是临床上用来判断患者是否存在感染性疾病的辅助诊断指标之一[4]。C反应蛋白（C reactive protein，CRP）是一种不受贫血、激素、抗炎药物影响的急性蛋白，在机体损伤、感染后会急速上升[5]。临床肺部感染（clinical pulmonary infection，CPIS）评分可在一定程度上对ICU患者预后进行预测。基于此，本研究首次联合检测PCT、WBC、CRP在ICU呼吸感染中的水平及与CPIS评分的相关性，旨在为ICU呼吸感染的早期诊断提供可靠依据。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
选取2019年3月至2024年6月涿州市医院重症医学科收治的呼吸感染患者110例，纳入标准：所有患者均为社区获得性肺炎，诊断标准参考中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南（2016年版）[6]，研究过程和内容经患者及其家属同意并签署知情同意书。排除标准：肺挫伤者；合并支气管扩张、慢性心肺功能不全者；合并自身免疫系统疾病者；两周内发生大咯血者。最终入组105例，作为观察组。另外，选取于ICU未发生呼吸感染117例患者为对照组。该研究经涿州市医院伦理委员会批准通过（20190122）。
1.2 研究方法
1.2.1 PCT水平检测
采集观察组和对照组入院时空腹静脉血6 mL，以离心半径10 cm、转速
2000 r/min离心处理5 min，分离上层血清，-80 ℃保存待检。通过优迈科200型免疫定量分析仪（万泰生物）对两组患者的PCT水平进行检测。1.2.2 WBC水平检测
观察组、对照组患者入院时各抽取空腹静脉血6 mL，以离心半径10 cm、转速
2000 r/min离心处理5 min，分离上层血清，-80 ℃保存待检。通过Sysmex XN2800型白细胞分析仪（日本Sysmex公司）对两组患者的WBC水平进行检测。1.2.3 CRP水平检测
观察组、对照组患者入院时各抽取空腹静脉血6 mL，以离心半径10 cm、转速
2000 r/min离心处理5 min，分离上层血清，-80 ℃保存待检。通过免疫比浊法对两组的CRP水平进行检测。1.2.4 CPIS评分[7]
根据氧和情况、气道吸入物培养结果、体温、X线胸片、白细胞计数、24 h吸出气道分泌物对两组肺部感染严重程度进行评估，氧和情况 > 240 mmHg记0分；≦240 mmHg记2分；气道吸入物、分泌物培养 < 14个/mL记0分；非脓性，≧14个/mL记1分；脓性且≧14个/mL记2分；体温36 ℃～38 ℃记0分；38 ℃～39 ℃记1分； > 39 ℃记2分；X线胸片无浸润影记0分；有斑片状浸润影记1分；有融合片状浸润影记2分；白细胞计数4～11×109/L记0分；11～17×109/L记1分； > 17×109/L或 < 4×109/L记2分；CPIS评分 < 6分为轻度；6～9分为中度；10～12分为重度。
1.3 统计学分析
采用SPSS26.0统计软件进行分析。应用Kolmogorov-Smirnov检验数据是否符合正态分布，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（$ \bar x \pm s $）描述，多组间比较采用ANOVA分析，两组间比较采用LSD-t检验；PCT、WBC、CRP与CPIS评分之间相关性采用Pearson相关性分析。采用多因素Logistic回归分析影响ICU呼吸感染发生的因素。ROC曲线分析PCT、WBC、CRP及三项联合对ICU呼吸感染的诊断价值。P < 0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 两组患者的一般资料比较
两组患者的性别、年龄、原发病类型、病原菌及体重比较，差异无统计学意义（P > 0.05），两组在一般资料中均衡可比。观察组入住ICU时间（ > 15 d）和机械通气时间（ > 7 d）的占比显著高于对照组，差异具有统计学意义（P < 0.05），见表1。
表 1 两组患者的一般资料比较[（$ \bar x \pm s $）/n（%）]Table 1. Comparison of general data between the two groups[（$ \bar x \pm s $）/n（%）]一般资料 对照组（n = 117） 观察组（n = 105） χ2/t P 性别 男 61（52.14） 53（50.48） 0.061 0.805 女 56（47.86） 52（49.52） 年龄（岁） 50.87 ± 8.50 50.91 ± 8.62 0.035 0.972 病原菌 革兰阴性菌 − 56（53.33） − − 革兰阳性菌 − 49（46.67） 原发病 心肌梗死 46（39.32） 40（38.10） 0.035 0.852 脑出血 25（21.37） 24（22.86） 0.071 0.789 脑梗死 20（17.09） 16（15.24） 0.140 0.708 其他 26（22.22） 25（23.81） 0.079 0.779 体重（kg） 58.13 ± 7.50 58.06 ± 7.38 −0.070 0.944 入住ICU时间（d） > 15 20（17.09） 76（72.38） 68.918 < 0.001* ≤ 15 97（82.91） 29（27.62） 机械通气时间（d） > 7 3（2.56） 10（9.52） 4.862 0.027* ≤ 7 114（97.46） 95（90.48） *P < 0.05。 2.2 两组PCT、WBC、CRP、CPIS评分比较
与对照组比较，观察组PCT、WBC、CRP水平、CPIS评分上升，差异具有统计学意义（P < 0.05），见表2。
表 2 两组PCT、WBC、CRP、CPIS评分对比（$ \bar x \pm s $）Table 2. Comparison of PCT，WBC，CRP and CPIS scores between the two groups（$ \bar x \pm s $）组别 n PCT（ng/mL） WBC（×109/L） CRP（mg/L） CPIS评分（分） 对照组 117 0.39 ± 0.06 12.69 ± 2.53 36.41 ± 3.26 3.22 ± 0.52 观察组 105 1.09 ± 0.17 19.13 ± 3.02 94.01 ± 9.53 9.03 ± 0.76 t 41.745 17.280 61.503 67.041 P < 0.001* < 0.001* < 0.001* < 0.001* *P < 0.05。 2.3 PCT、WBC、CRP与CPIS评分相关性分析
PCT、WBC、CRP与CPIS评分之间Pearson相关性分析显示，PCT、CPIS评分之间正相关（r = 0.925，P = 0.001）；WBC、CPIS评分之间正相关（r = 0.739，P = 0.001）；CRP、CPIS评分之间正相关（r = 0.948，P = 0.001），见图1。
图 1 PCT、WBC、CRP与CPIS评分相关性分析A：PCT与CPIS评分的相关性；B：WBC与CPIS评分的相关性；C：CRP与CPIS评分的相关性。Figure 1. Correlation analysis between PCT，WBC，CRP and CPIS scores2.4 ICU呼吸感染的多因素回归分析
以是否感染为因变量（感染 = 1，未感染 = 0），以表1和表2中P < 0.05的数据（除CPIS评分外）为自变量进行回归分析，赋值表见表3。结果发现，入住ICU时间 > 15 d、PCT、WBC和CRP为影响ICU呼吸感染发生的危险因素，见表4。
表 3 赋值表Table 3. Assignment table因素 变量 赋值 是否感染 Y 感染 = 1，未感染 = 0 入住ICU时间（d） X1 > 15 = 1，≤15 = 0 机械通气时间（d） X2 > 7 = 1，≤7 = 0 PCT X3 实际值录入 WBC X4 实际值录入 CRP X5 实际值录入 表 4 多因素Logistic回归分析影响ICU呼吸感染发生的因素Table 4. Multivariate logistic regression analysis of factors influencing the occurrence of respiratory infection in ICU影响因素 B S.E. Wald P OR 95%CI 入住ICU时间（ > 15 d） 1.316 0.406 7.054 0.003* 4.087 1.654～8.116 机械通气时间（ > 7 d） 0.573 0.679 2.057 0.069 1.352 0.879～4.124 PCT 1.359 0.426 6.471 0.001* 6.543 2.651～12.270 WBC 1.281 0.375 4.059 0.012* 2.652 1.579～7.652 CRP 1.724 0.677 3.512 <0.001* 8.964 3.694～29.176 *P < 0.05。 2.5 ROC曲线分析PCT、WBC、CRP对ICU呼吸感染的诊断价值
ROC曲线显示，三项联合对ICU呼吸感染的诊断价值高于PCT、WBC、CRP单项诊断（P = 0.004）。以正确诊断指数最大对应的PCT、WBC、CRP值作为最佳诊断分界点，见表5、图2。
表 5 ROC曲线分析PCT、WBC、CRP对ICU呼吸感染的诊断价值Table 5. ROC curve analysis of the diagnostic value of PCT，WBC，and CRP for respiratory infections in ICU patients指标 曲线下面积（95%CI） 敏感度（%） 特异度（%） 准确性（%） P 截断值 PCT（ng/mL） 0.733（0.539～0.926） 77.14（81/105） 88.89（104/117） 83.33（185/222） 0.033* 0.67 WBC（×109/L） 0.738（0.542～0.939） 80.95（85/105） 86.32（101/117） 83.78（186/222） 0.028* 13.52 CRP（mg/L） 0.702（0.506～0.886） 83.81（88/105） 83.76（98/117） 83.78（186/222） 0.069 67.38 三项联合 0.812（0.618～0.975） 87.62（92/105） 82.91（97/117） 85.14（189/222） 0.002* − *P < 0.05。 
图 2 PCT、WBC、CRP诊断ICU呼吸感染的ROC曲线Figure 2. ROC curves of PCT，WBC，and CRP in the diagnosis of ICU respiratory infection3. 讨论
3.1 呼吸道感染现状及防控意义
研究[8]显示，呼吸道感染主要是由支原体、病毒、军团菌、细菌、衣原体感染所引起，其中以病毒、细菌为主，呼吸道感染的发生与维生素缺乏、营养状态、环境污染等存在联系。ICU患者通常需要进行气管插管，由于患者本身机体免疫水平较低、营养状况较差且气管插管会对患者呼吸道造成损伤，最终导致ICU患者呼吸道感染，使得患者病情进一步恶化，因此加强ICU患者感染的防控与诊治至关重要[9−10]。
3.2 PCT与ICU呼吸感染的关系
研究[11]显示，ICU呼吸感染作为感染疾病，机体炎性应激状态会随感染的加重而加剧。PCT是1种与机体感染、炎性应激反应存在密切联系的多肽激素，炎性反应对其分泌具有促进作用[12]。作为钙素原的前期体现，PCT几乎不受非感染因素的影响，在健康人体内PCT水平极低，主要在甲状腺C细胞中存在，当ICU患者发生呼吸感染后，机体会出现炎症反应，在炎性细胞因子、细菌刺激后，甲状腺以外各种细菌内毒素、细胞因子会促进神经内分泌细胞产生大量PCT，进而导致ICU呼吸感染患者血液中PCT水平增高，因此PCT对ICU呼吸感染具有较高的诊断价值[13−15]。本研究显示，PCT在ICU呼吸感染患者体内呈高表达，其结果与上述研究结果一致，随着入住ICU时间及机械通气时间的增加，患者与病原菌接触时间增加，呼吸感染、炎症反应进一步加重，因此PCT水平升高加剧。
3.3 WBC与ICU呼吸感染的关系
WBC作为机体防御系统重要组成成分，是临床常用的炎症标志物，可用于诊断ICU患者是否存在感染性疾病，在ICU机体发生细菌感染性呼吸感染时WBC水平会显著上升，在机体发生病毒感染呼吸感染时时WBC水平变化并不明显，且该指标受温度、情绪、年龄、机体免疫力、应激、运动等因素的影响，因此特异度不高，需结合其他实验室指标对ICU患者是否存在呼吸感染进行综合判断[16−18]。本研究显示，随着年龄的上升WBC水平随之上升，其原因可能为年龄大于60岁的患者因自身生理功能退化、体质较差等原因导致病原菌抵抗能力下降，因此病原菌感染更为严重，WBC水平随之上升。
3.4 CRP与ICU呼吸感染的关系
CRP是一种对组织损伤、感染、炎性反应诊断价值较高的急性蛋白，在IL-6、肿瘤坏死因子的刺激下由肝脏合成，对一氧化碳的生成具有抑制作用，进而对内皮细胞功能造成了损伤[19−20]。CRP与呼吸感染严重程度呈正相关，且该指标不受贫血、激素、抗炎药物、性别、体温等因素的影响，在ICU患者发生呼吸感染后会迅速升高，在呼吸感染得到控制后又会迅速降低[21−22]。本研究显示，CRP在ICU呼吸感染患者体内表达升高，且在重度肺部感染患者中表达最高，其原因为ICU患者呼吸感染会伴随炎症出现，且随着肺部感染严重程度的增加炎症反应随之加重，CRP水平随之上升。
另外，在多因素Logistic回归分析结果中，入住ICU时间（ > 15 d）是影响ICU呼吸感染发生的危险因素之一，这个可能是由于长期接触ICU中的病原菌，导致出现呼吸感染。虽然本文证实了PCT、WBC、CRP和ICU呼吸感染及CPIS评分的关系，但因样本量较少，具有一定的局限性，因此还需后续研究大样本、高质量、多中心的分析PCT、WBC、CRP的具体作用机制，造福于更多的患者。
综上所述，在ICU呼吸感染中PCT、WBC、CRP高表达，随着疾病的发展，PCT、WBC、CRP表达升高加剧，且PCT、WBC、CRP与CPIS评分之间存在相关性，提示PCT、WBC、CRP与ICU呼吸感染的发生、发展相关，临床可通过上述指标对ICU呼吸感染进行早期的诊断治疗。
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图 1 高良姜素对宫颈癌Hela细胞增殖的影响
注：CCK-8法测定不同浓度高良姜素处理Hela细胞对细胞增殖的影响。与对照组比较，*P < 0.05；***P < 0.001。
Figure 1. Effect of galangin on proliferation of cervical cancer Hela cells
图 2 高良姜素对宫颈癌Hela细胞迁移和侵袭的影响
A：细胞划痕实验结果（标尺为100 μm）；B：Transwell实验结果（标尺为100 μm）；与对照组比较，***P < 0.001。
Figure 2. Effect of galangin on migration and invasion of cervical cancer Hela cells
图 3 高良姜素对EMT相关蛋白表达的影响
A：Western blot实验检测Hela细胞EMT相关N-cadherin、E-cadherin蛋白表达情况；B：N-cadherin蛋白相对表达量量化图；C：E-cadherin蛋白相对表达量量化图。与对照组比较，*P < 0.05；***P < 0.001。
Figure 3. Effect of galangin on expression of EMT-related protein
图 4 KEGG与GSEA-GO ES富集图
A：KEGG通路的气泡图；B：GSEA-GO ES富集图。
Figure 4. Enrichment diagram of KEGG and GSEA-GO ES
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