Study on the Detection of MMP-2，-7，-9，and -12 Enzymatic Activity Using CEACAM1-Derived Fluorescent Peptide Substrate Site 84
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摘要:
目的 探索CEACAM1 源性多肽合成的荧光底物Site 84 对MMP-2，-7，-9，-12 酶活性的检测，并进一步探索荧光多肽底物Site 84在区分同属于MMPs明胶酶谱中MMP-2和MMP-9的应用。 方法 采用荧光酶学法观察荧光多肽底物Site 84 对MMP-2，-7，-9，-12 酶活性的检测；进一步观察底物Site 84对明胶酶谱中MMP-2和MMP-9酶活性的敏感性和特异性；获得底物Site 84与MMP-2的酶促反应的动力学参数Km、Kcat。 结果 以Site 84 为底物，获得MMP-12、-7、-2 的酶活力曲线，但未获得MMP-9的酶活力曲线；此外，以Site 84 为底物，可特异性检测明胶酶谱中MMP-2 的酶活性，其可检测低浓度（0.6 μM）MMP-2 的酶活性，然而对高浓度（6 μM）MMP-9 未见明显酶促反应；最后，MMP-2 和底物 Site 84的酶促反应动力学参数：Km = 315 μM，Kcat/Km = 2565 / MS。结论 以CEACAM1源性底物 Site 84作为新型的荧光多肽底物，可获得MMP-12、-7、-2 的酶活力曲线，且可特异性检测MMPs明胶酶谱中MMP-2的酶活性。 Abstract:Objective To explore the the detection of MMP-2, -7, -9, and -12 enzymatic activity using the CEACAM1-derived fluorescent peptide substrate Site 84, investigating the application of substrate Site 84 to distinguishing between MMP-2 and MMP-9 in the gelatinase spectrum of MMPs. Methods The fluorescent enzymatic method was employed to observe the detection of MMP-2, -7, -9, and -12 enzymatic activity using substrate Site 84; further observations were made on the sensitivity and specificity of substrate Site 84 to enzymatic activity of MMP-2 and MMP-9 within the gelatinase spectrum; the kinetic parameters （Km and Kcat） of the enzymatic reaction between substrate Site 84 and MMP-2 were obtained. Results Using Site 84 as a substrate, enzymic kinetics curves for MMP-12, -7, -2 were obtained, but no enzymatic activity curve for MMP-9 was observed. Furthermore, Site 84 specifically detected the enzymatic activity of MMP-2 within the gelatinase spectrum, capable of detecting low concentration （0.6 μM） of MMP-2 enzymatic activity, but no obvious enzymatic reaction was observed for high concentration （6 μM） of MMP-9; the kinetics parameters for the enzymatic reaction between Site 84 and MMP-2 were Km = 315 μM, Kcat/Km = 2565 /MS.Conclusion The CEACAM1-derived substrate Site 84 serves as a novel fluorescent peptide substrate, enabling the acquisition of enzymatic activity curves for MMP-12, -7 and -2, and specifically detecting the enzymatic activity of MMP-2 within the MMP gelatinase spectrum. -
Key words:
- Site 84 /
- Fluorescent polypeptide substrate /
- Enzymatic activity /
- Gelatinase /
- CEACAM1-derived.
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世界卫生组织数据显示，从2020年至2030年，全球60岁以上人口将从10亿人增加到14亿人，到2030年，全世界六分之一的人将达60岁及以上[1]。截至2020年11月1日，我国60岁及以上人口为2.64亿，占全国总人口的18.70%[2]，其中云南省60岁及以上人口占云南总人口的14.91%。随着人口老龄化，老年人口成为慢性病患病的主要人群，数据显示2018年我国老年人口慢性病患病率为59.1%[3]，因慢性病导致的死亡占全人群总死亡的比例也较高[4]，老年慢性病已成为我国乃至全球的一个严重的公共卫生问题，防控工作面临巨大的挑战。
因此，需要继续探讨老年人慢性病患病的影响因素来进行老年慢性病的防控，研究表明生活行为方式与慢性病存在关联性[5]，生活方式在慢性病的预防上起着重要作用，但在体力劳动强度和老年慢性病患病的相关性方面研究相对较少。本文选取云南省玉龙县和富民县两县农村老年人群进行问卷调查，采用二分类多因素Logistic回归分析探究老年慢性病与体力劳动强度的关系，为农村老年慢性病的防治提供有针对性的防控策略。
1. 对象与方法
1.1 研究对象
本研究采用多阶段分层随机抽样方法在云南省玉龙县和富民县两县农村地区进行横断面调查。其中，主要在玉龙县和富民县按照经济水平和按比例概率抽样法随机抽取2县60岁及以上常住农村老年居民作为研究对象进行问卷调查和体格检查。调查对象纳入标准：（1）60岁及以上玉龙县和富民县农村常住老年人群；（2）能够顺利进行沟通交流，可以配合调查；（3）自愿参加本研究，并签署知情同意书。最终将符合研究纳入标准并完成有效问卷调查和体格检查的2299名60岁及以上老年人作为研究对象纳入本文进行研究分析。本研究项目经昆明医科大学医学伦理委员会批准。
1.2 调查内容
问卷调查：由经过专业培训且合格的调查员对研究对象进行现场询问并填写经项目课题组自行设计的调查问卷，调查问卷信效度可靠被多次使用[6-7]。调查问卷的内容为：人口学特征指标包括性别、年龄、民族、文化程度、职业、参加医保、独居；生活特征指标包括吸烟情况、饮酒情况、体育活动频率、体力劳动强度（高强度劳动，如手工收割、挖地、耕地等需要付出较大体力，或引起呼吸、心跳明显加快；中等强度劳动，如洗衣、打扫卫生、挑水等需要付出中等体力，或引起呼吸、心跳轻度加快；低强度劳动，如工作时有75%的时间坐或站立，25%时间站着劳动）；体格检查指标包括身高、体重、腰围、臀围、血压、血糖等；慢性病患病情况包括糖尿病、高血压、冠心病、脑卒中、COPD、哮喘、高血脂、慢性肾病、消化道溃疡、白内障10种慢性病的患病情况。本文慢性病患病指调查人群患以上调查10种慢性病的任意一种。
1.3 统计学处理
资料收集整理后，利用Epidata3.1软件建立数据库进行数据录入，运用SPSS21.0软件进行统计分析。采用描述性分析对云南省玉龙县和富民县两县农村老年人群的人口学特征进行分析，其中计数资料采用频数和百分比表示；运用χ2检验、多因素Logistic回归分析分析影响老年人慢性病患病的因素，检验水准α = 0.05，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 云南省两县调查人群的基本情况
经现场调查符合研究标准并完成有效问卷调查和体格检查的60岁及以上老年人共计2299名，调查人群的基本人口学特征见表1。
表 1 云南省两县调查人群基本人口学特征[n（%）]Table 1. Demographic characteristics among study population in two counties of Yunnan Province [n（%）]人口学特征 年龄 调查人数（n = 2299） χ2 P 60～64岁
（n = 688）65～69岁
（n = 622）70～74岁
（n = 470）≥75岁
（n = 519）性别 男性 306（44.5） 315（50.6） 229（48.7） 250（48.2） 1100（47.8） 5.247 0.155 女性 382（55.5） 307（49.4） 241（51.3） 269（51.8） 1199（52.2） 民族 汉族 329（47.8） 373（60.0） 267（56.8） 290（55.9） 1259（54.8） 21.244 < 0.001* 纳西族 359（52.2） 249（40.0） 203（43.2） 229（44.1） 1040（45.2） 读过书 是 525（76.3） 435（69.9） 365（77.7） 277（53.4） 1602（69.7） 93.829 < 0.001* 否 163（23.7） 187（30.1） 105（22.3） 242（46.6） 697（30.3） 独居 是 162（23.5） 198（31.8） 151（32.1） 170（32.8） 681（29.6） 17.499 0.001* 否 526（76.5） 424（68.2） 319（67.9） 349（67.2） 1618（70.4） 农民 是 648（94.2） 589（94.7） 426（90.6） 459（88.4） 2122（92.3） 21.175 < 0.001* 否 40（5.8） 33（5.3） 44（9.4） 60（11.6） 177（7.7） 医保 有 685（99.6） 619（99.5） 466（99.1） 512（98.7） 2282（99.3） 4.128 0.248 无 3（0.4） 3（0.5） 4（0.9） 7（1.3） 17（0.7） 吸烟 是 243（35.3） 259（41.6） 187（39.8） 207（39.9） 896（39.0） 6.033 0.110 否 445（64.7） 363（58.4） 283（60.2） 312（60.1） 1403（61.0） 饮酒 是 106（15.4） 102（16.4） 71（15.1） 67（12.9） 346（15.1） 2.815 0.421 否 582（84.6） 520（83.6） 399（84.9） 452（87.1） 1953（84.9） 体力劳动强度 高强度 341（49.6） 289（46.5） 127（27.0） 71（13.6） 828（36.0） 315.821 < 0.001* 中强度 274（39.8） 248（39.9） 232（49.4） 223（43.0） 977（42.5） 轻强度 73（10.6） 85（13.6） 111（23.6） 225（43.4） 494（21.5） 体育活动频率/周 小于1次 311（45.2） 301（48.4） 193（41.1） 232（44.7） 1037（45.1） 10.533 0.309 1～3次 132（19.2） 128（20.6） 103（21.9） 113（21.8） 476（20.7） 4～6次 130（18.9） 111（17.8） 103（21.9） 104（20.0） 448（19.5） 7次及以上 115（16.7） 82（13.2） 71（15.1） 70（13.5） 338（14.7） 肥胖 正常 382（55.5） 405（65.1） 320（68.2） 389（75.0） 1496（65.1） 53.872 < 0.001* 超重 225（32.7） 165（26.5） 112（23.9） 104（20.0） 606（26.4） 肥胖 81（11.8） 52（8.4） 37（7.9） 26（5.0） 196（8.5） *P < 0.05。 本次调查男性1100人（占47.8%），女性1199人（占52.2%）。研究分为4个年龄组，其中，60～64岁组688人，占29.9%；65～69岁组622人，占27.1%；70～74岁组470人，占20.4%；≥75岁组519人，占22.6%。调查人群中，不同民族、是否读过书、是否独居、是否农民、体力劳动强度、是否肥胖差异有统计学意义（经χ2检验，P < 0.05）。
在体力劳动强度方面，调查地区老年人群随着年龄的增加，高强度的体力劳动占比呈下降趋势，轻强度的体力劳动占比呈上升趋势，且差异具有统计学意义（经χ2检验，P < 0.05）。
2.2 云南省两县调查人群的慢性病情况
本次调查老年人群慢性病患病率为83.3%，其中，男性慢性病患病率为83.8%（922/1100）；女性慢性病患病率为82.8%（993/1199）。汉族慢性病患病率为83.1%（1046/1259）；纳西族慢性病患病率为83.6%（869/1040）。调查人群中，不同年龄组、体力劳动强度、是否肥胖和是否中心性肥胖差异有统计学意义（经χ2检验，P < 0.05）。调查人群患慢性病情况，见表2。
表 2 云南省两县调查人群的慢性病患病情况[n（%）]Table 2. Prevalence of chronic diseases among study population in two counties of Yunnan Province [n（%）]特征 慢性病 调查人数
（n = 2299）χ2 P 患慢性病（n = 1 915） 未患慢性病（n = 384） 性别 男性 922（83.8） 178（16.2） 1100（83.3） 0.412 0.521 女性 993（82.8） 206（17.2） 1199（17.7） 年龄（岁） 60～ 558（81.1） 130（18.9） 688（29.9） 9.429 0.024* 65～ 511（82.2） 111（17.8） 622（27.1） 70～ 412（87.7） 58（12.3） 470（20.4） ≥75 434（83.6） 85（16.4） 519（22.6） 民族 汉族 1046（83.1） 213（16.9） 1259（54.8） 0.093 0.761 纳西族 869（83.6） 171（16.4） 1040（45.2） 农民 是 1760（82.9）（（82.9） 362（17.1） 2122（92.3） 2.517 0.113 否 155（87.6） 22（12.4） 177（7.7） 医保 有 1899（83.2） 383（16.8） 2282（99.3） 1.441 0.230 无 16（94.1） 1（5.9） 17（0.7） 读书 是 1340（83.6） 262（16.4） 1602（69.7） 0.461 0.497 否 575（82.5） 122（17.5） 697（30.3） 吸烟 是 762（85.0） 134（15.0） 896（39.0） 3.223 0.073 否 1153（82.2） 250（17.8） 1403（61.0） 饮酒 是 290（83.8） 56（16.2） 346（15.1） 0.079 0.779 否 1625（83.2） 328（16.8） 1953（84.9） 肥胖 正常 1212（81.0） 284（19.0） 1496（65.1） 18.608 < 0.001* 超重 523（86.3） 83（13.7） 606（26.4） 肥胖 179（91.3） 17（8.7） 196（8.5） 中心性肥胖 是 1115（87.8） 155（12.2） 1270（55.2） 41.265 < 0.001* 否 800（77.7） 229（22.3） 1029（44.8） 体力劳动强度 高体力劳动强度 656（79.2） 172（20.8） 828（36.0） 16.248 < 0.001* 中体力劳动强度 830（85.0） 147（15.0） 977（42.5） 轻体力劳动强度 429（86.8） 65（13.2） 494（21.5） 参加体育活动 是 1054（83.5） 208（16.5） 1262（54.9） 0.098 0.754 否 861（83.0） 176（17.0） 1037（45.1） *P < 0.05。 2.2.1 云南省两县不同性别、年龄组、民族调查人群慢性病患病情况
调查地区除75岁及以上年龄组的老年人以外，老年人群的慢性病患病率随着年龄的增加呈上升趋势，其中60～64岁年龄组老年人慢性病患病率最低，为81.1%；70～74岁年龄组老年人慢性病患病率最高，为87.7%，差异具有统计学意义（P < 0.05），见表2；不同性别、民族的老年人慢性病患病差异无统计学意义（P > 0.05），见表2。
2.3 云南省两县老年慢性病患病影响因素多因素Logistic回归分析
分别以所调查地区老年人是否患有慢性病作为因变量（未患病 = 0，患病 = 1），以性别（0 = 男，1 = 女）、民族（0 = 汉族，1 = 纳西族）、读过书（0 = 否，1 = 是）、中心性肥胖（0 = 否，1 = 是）、吸烟（0 = 否，1 = 是）、饮酒（0 = 否，1 = 是）、肥胖（0 = 否，1 = 是）、参加体育活动（0 = 否，1 = 是）、体力劳动强度（0 = 低强度，1 = 中强度，2 = 高强度）9个因素作为自变量进行二分类多因素Logistic回归分析。
由上述云南省玉龙县和富民县不同年龄组老年人慢性病患病情况可以看出，年龄是所调查地区老年人慢性病患病的一个重要影响因素。因此，通过多因素Logistic回归模型调整年龄的混杂因素进行云南省老年人慢性病患病影响因素多因素Logistic回归分析。
结果显示：经调整模型后，中心性肥胖、体力劳动强度与老年人群患慢性病具有显著关联性（P < 0.05），见表3，有中心性肥胖的老年人患慢性病的风险是没有中心性肥胖的1.895倍，中强度体力劳动老年人群患慢性病的风险是低强度体力劳动老年人群患慢性病的0.643倍。中心性肥胖和体力劳动强度是云南省玉龙县和富民县两县农村老年人慢性病患病的影响因素。
表 3 云南省两县调查人群慢性病患病影响因素多因素Logistic回归分析Table 3. Multivariate logistic regression analysis of influencing factors of chronic diseases among study population in two counties of Yunnan Province特征 参照组 B Wald χ2 Exp（B） 95%CI P 性别 男性 0.025 0.019 1.025 0.720-1.459 0.891 民族 汉族 0.020 0.029 1.020 0.813-1.280 0.864 读过书 否 −0.008 0.003 0.992 0.766-1.286 0.954 吸烟 否 0.335 3.658 1.398 0.992-1.972 0.056 饮酒 否 0.106 0.366 1.112 0.788-1.570 0.545 中心性肥胖 否 0.639 21.759 1.895 1.449-2.479 < 0.001* 中体力劳动强度 轻体力劳动强度 −0.441 6.438 0.643 0.457-0.904 0.011* 高体力劳动强度 −0.123 0.549 0.884 0.639-1.224 0.459 超重 正常 −0.519 3.423 0.595 0.344-1.031 0.064 肥胖 −0.415 2.154 0.660 0.380-1.149 0.142 参加体育活动 否 −0.064 0.295 0.938 0.745-1.181 0.587 *P < 0.05。 3. 讨论
本次调查结果显示云南省玉龙县和富民县两县农村老年人群慢性病患病率为83.3%，高于2018年全国59.1%[3]和云南省52.36%，原因可能是调查地区为老年慢性病高发地区以及研究纳入慢性病种类较多，提示需要加强对调查地区老年人群慢性病的防治工作。随着年龄的增加，调查地区老年人群的慢性病患病率呈升高趋势，这与其他文献研究结果一致[8]，主要与老年人的生理机能随着年龄的增长逐渐改变有关，提示老年人群是患慢性疾病的主要人群，在基本公共卫生服务工作过程中应重点关注老年人群基础代谢疾病和慢性病的诊断、治疗和日常保健以及加大农村地区基本公共卫生服务的力度，以减少老年慢性病的发生。经调查发现不同性别、民族的老年人患慢性病的差异无统计学意义，这可能与调查地区的老年人群的生活模式有关，未来可以进一步探讨当地老年人群的生活模式。
既往研究显示生活行为习惯与慢性病之间存在相关性，是老年慢性病的重要影响因素[9]，在慢性病的防治上起着重要作用。在本次调查中，调查地区老年人慢性病患病影响因素多因素Logistic回归分析结果显示有中心性肥胖的老年人患慢性病的风险是没有中心性肥胖的1.895倍，说明中心性肥胖是调查地区老年人群患慢性病的危险因素，中心性肥胖是老年人慢性病患病的影响因素，这可能与当地老年人群饮食、运动和遗传等有关，提示应加强对农村老年人群的健康教育和健康促进干预，尤其是对老年人群进行运动干预，倡导养成健康的生活方式。本次研究显示，吸烟对调查人群慢性病患病的影响不具有统计学意义（P > 0.05），与既往的研究结果不一致[10-11]，原因如下：（1）调查人群在调查之前有戒烟控烟行为，说明老年人的自我健康管理对于慢性病的应用效果佳，提示应继续提高老年人群自我的健康管理水平；（2）本次调查为调查人群慢性病情况的自报告，调查结果存在一定的偏倚。既往研究表明缺乏体力活动与慢性病的发生有密切关系[12]，体力活动不足是内分泌和心脑血管疾病等慢性病的危险因素[13]。本研究Logistic回归分析结果显示调查地区中强度体力劳动老年人群患慢性病的风险是低强度体力劳动老年人群患慢性病的0.643倍，说明中强度体力劳动是云南省老年人群患慢性病的保护因素；随着年龄的增加，高强度的体力劳动占比呈下降趋势，低强度的体力劳动占比呈上升趋势，与其他研究结果一致[14]。这些可能与调查地区老年人的生理机能随着年龄的增长逐渐改变以及老年慢性病人群的体力劳动强度随着慢性病的严重程度或数量改变[14]有关。因此，研究认为老年慢性病和体力劳动强度之间存在互相影响的关系，在日常生活中，调整体力劳动强度的高低是减少和控制慢性病的有效途径[15]，老年人群应当适度地进行低、中强度体力劳动，在预防老年慢性病发生和减小慢性病患病风险的同时，促进身心愉悦、提升生活幸福感和价值感。
综上所述，应加强对农村老年人群的健康教育和基本公共卫生服务的力度，促进老年人群在日常生活中形成健康的生活方式，保持适度的体力劳动强度，从而有效降低慢性病患病风险。
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图 1 Site84的高效液相色谱（HPLC）分析图和质谱分析图
A：HPLC纯化图，波峰即为Site 84；B：图A中波峰的二次质谱图。
Figure 1. HPLC analysis and mass spectrometry analysis of Site 84
图 2 rhMMPs酶活性位点滴定
A：MMP-12的酶活性浓度；B：MMP-7的酶活性浓度；C：MMP-2的酶活性浓度；D：MMP-9的酶活性浓度。
Figure 2. Titration of enzymatic activity sites of rhMMPs
图 3 MMP-2/-7/-9/-12 与荧光多肽底物Site 84的酶促反应
Figure 3. Enzymatic reactions of MMP-2/-7/-9/-12 with fluorescent peptide substrate Site 84
图 4 明胶酶（MMP-2 及 MMP-9）与荧光多肽底物 Site 84的酶促反应
Figure 4. Enzymatic reactions of gelatinases （MMP-2 and MMP-9） with fluorescent peptide substrate Site 84
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