Study on the Detection of MMP-2，-7，-9，and -12 Enzymatic Activity Using CEACAM1-Derived Fluorescent Peptide Substrate Site 84
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摘要:
目的 探索CEACAM1 源性多肽合成的荧光底物Site 84 对MMP-2，-7，-9，-12 酶活性的检测，并进一步探索荧光多肽底物Site 84在区分同属于MMPs明胶酶谱中MMP-2和MMP-9的应用。 方法 采用荧光酶学法观察荧光多肽底物Site 84 对MMP-2，-7，-9，-12 酶活性的检测；进一步观察底物Site 84对明胶酶谱中MMP-2和MMP-9酶活性的敏感性和特异性；获得底物Site 84与MMP-2的酶促反应的动力学参数Km、Kcat。 结果 以Site 84 为底物，获得MMP-12、-7、-2 的酶活力曲线，但未获得MMP-9的酶活力曲线；此外，以Site 84 为底物，可特异性检测明胶酶谱中MMP-2 的酶活性，其可检测低浓度（0.6 μM）MMP-2 的酶活性，然而对高浓度（6 μM）MMP-9 未见明显酶促反应；最后，MMP-2 和底物 Site 84的酶促反应动力学参数：Km = 315 μM，Kcat/Km = 2565 / MS。结论 以CEACAM1源性底物 Site 84作为新型的荧光多肽底物，可获得MMP-12、-7、-2 的酶活力曲线，且可特异性检测MMPs明胶酶谱中MMP-2的酶活性。 Abstract:Objective To explore the the detection of MMP-2, -7, -9, and -12 enzymatic activity using the CEACAM1-derived fluorescent peptide substrate Site 84, investigating the application of substrate Site 84 to distinguishing between MMP-2 and MMP-9 in the gelatinase spectrum of MMPs. Methods The fluorescent enzymatic method was employed to observe the detection of MMP-2, -7, -9, and -12 enzymatic activity using substrate Site 84; further observations were made on the sensitivity and specificity of substrate Site 84 to enzymatic activity of MMP-2 and MMP-9 within the gelatinase spectrum; the kinetic parameters （Km and Kcat） of the enzymatic reaction between substrate Site 84 and MMP-2 were obtained. Results Using Site 84 as a substrate, enzymic kinetics curves for MMP-12, -7, -2 were obtained, but no enzymatic activity curve for MMP-9 was observed. Furthermore, Site 84 specifically detected the enzymatic activity of MMP-2 within the gelatinase spectrum, capable of detecting low concentration （0.6 μM） of MMP-2 enzymatic activity, but no obvious enzymatic reaction was observed for high concentration （6 μM） of MMP-9; the kinetics parameters for the enzymatic reaction between Site 84 and MMP-2 were Km = 315 μM, Kcat/Km = 2565 /MS.Conclusion The CEACAM1-derived substrate Site 84 serves as a novel fluorescent peptide substrate, enabling the acquisition of enzymatic activity curves for MMP-12, -7 and -2, and specifically detecting the enzymatic activity of MMP-2 within the MMP gelatinase spectrum. -
Key words:
- Site 84 /
- Fluorescent polypeptide substrate /
- Enzymatic activity /
- Gelatinase /
- CEACAM1-derived.
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近年来，随着法医学鉴定技术的发展，复杂亲缘关系鉴定需求日益增加，全同胞关系作为复杂亲缘关系的一种，指有相同生物学父亲和生物学母亲的多个子代个体之间的关系[1]，目前在已在司法实践的多个领域发挥着重要的作用[2]。因此，根据实际需要，司法部司法鉴定管理局于2014年发布了《生物学全同胞关系鉴定实施规范》（SF/Z JD0105002—2014，后文简称“旧规范”），规范了基于状态一致性评分（identity by state （IBS） score）的生物学全同胞关系鉴定的技术方法，但由于旧规范中过高的系统效能和对不同群体之间的群体差异考虑的欠缺，导致在实际应用过程中存在一定的误判风险。随后，司法部于2021年发布并实施了《生物学全同胞关系鉴定技术规范》（SF/T 0117—2021 ，后文简称“新规范”）以代替旧规范。新规范相较于旧规范更新了累计状态一致性评分（CIBS）的判定阈值并降低了对应检测系统的系统效能，增加了基于等位基因频率计算的全同胞指数（full sibling index，FSI）和累积全同胞指数（CFSI）的判定阈值及相应的系统效能[3]。本文基于新旧规范中相同的19个必检基因座检测系统探讨了2份规范中3种不同全同胞鉴定阈值划分方法在系统效能上的差异以及新规范中两种方法在云南人群生物学全同胞关系鉴定中的适用性。
1. 材料与方法
1.1 样本来源
在获得知情同意的前提下，收集1468对来自昆明医科大学司法鉴定中心日常案件积累的云南人群样本（口腔拭子、血样），其中全同胞有448对，无关个体有1 020对。全同胞对为已通过旧规范中IBS法认定（包括增加20个基因座后认定为全同胞的个体对）的兄弟姐妹组合，排除了同卵双生子和STR突变的家系。无关个体对为实验室随机抽取的无亲缘关系的个体两两随机组合。
1.2 STR基因座选择及分型检测
案件鉴定用Chelex-100 法提取血样 DNA，采用Promega公司PowerPlex®21 System试剂盒进行扩增，扩增产物经 ABI3130XL型基因分析仪电泳分离，应用ABI GeneMapperID- 1.5软件分析。每个样本均得到D3S1358、 D1S1656、 D6S1043、 D13S317、 Penta E、D16S539、D18S51、D2S1338、CSF1PO、PentaD、 TH01、 vWA、 D21S11、 D7S820、 D5S818、 TPOX、 D8S1179、 D12S391、 D19S433、 FGA 和 Amelogenin 共21个STR基因座的分型结果，包含全同胞鉴定规范中的19个必检基因座。
1.3 计算累计状态一致性评分
两名有争议个体在同一STR基因座上出现相同等位基因的个数就是状态一致性评分。当采用包含多个相互独立的常染色体遗传标记分型系统对两名有争议个体进行检测时，各个遗传标记上IBS之和即称为累计状态一致性评分[3]。利用全同胞鉴定规范中状态一致性评分方法，分别计算每对全同胞和无关个体之间19个必检基因座的CIBS值，并对数据进行统计整理。
1.4 计算累积全同胞指数
对于每一个STR基因座而言，两名有争议个体之间存在全同胞关系时其基因型出现的机率与两名有争议个体之间为无关个体时其基因型出现的机率之比值即为全同胞指数。当采用包含多个相互独立的常染色体遗传标记分型系统对两名有争议个体进行检测时，各个遗传标记上FSI的乘积即称为常染色体STR基因座累积全同胞关系指数[3]。根据云南汉族人群中 19个常染色体STR基因座的等位基因频率资料[4]和新规范中全同胞指数和累积全同胞关系指数的算法[5]，分别计算全同胞组和无关个体组的配对个体之间19个必检基因座的CFSI值，并对数据进行统计整理。
1.5 3种方法的阈值划分
基于新旧规范，用IBS法和FSI法分别计算1468对样本的全同胞关系，并对计算结果按照以下三种方法进行划分：方法一以旧规范中 IBS ≥ 22 倾向于认为两名被鉴定人为全同胞，IBS ≤ 13 倾向于认为两名被鉴定人为无关个体和13 < IBS < 22无法给出倾向性意见为标准进行阈值划分；方法二以新规范中IBS>22倾向于认为两名有争议个体为全同胞关系，IBS < 12倾向于认为两名有争议个体为无关个体对和12 ≤ IBS ≤ 22无法给出倾向性意见为标准进行阈值划分；方法三以新规范中FSI>1.0×104倾向于认为两名有争议个体为全同胞关系，FSI < 1.0×10-4倾向于认为两名有争议个体为无关个体对和1.0×10-4 ≤ FSI ≤ 1.0×104无法给出倾向性意见为标准进行阈值划分。
1.6 统计学处理
采用SPSS 25.0软件对全同胞组和无关个体组的lgCFSI 值和CIBS值的分布进行正态检验后，统计不同组别lgCFSI 值和CIBS值的算数均数和标准差，并对其进行独立样本t 检验，对计数资料采用χ2检验，均以P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 CIBS值和CFSI值的分布
根据448对全同胞和1020对无关个体的CIBS值和对CFSI值经对数转换后的lgCFSI值进行正态检验，结果表明全同胞组和无关个体组的CIBS值及lgFSI值均符合正态分布（图1，图2）。
图 1 全同胞组和无关个体组的CIBS值拟合所得正态分布曲线Figure 1. The normal distribution curve obtained by fitting the CIBS of the full sibling group and the unrelated individual group
图 2 全同胞组和无关个体组的lgCFSI值拟合所得正态分布曲线Figure 2. The normal distribution curve obtained by fitting the lgCFSI of the full sib group and the unrelated individual group2.2 无关个体组与全同胞组的差异
统计并描述全同胞组和无关个体组CIBS值和lgCFSI值的算数均数、标准差、t值（表1），结果显示无关个体组与全同胞组在CIBS值与lgCFSI值的差异均有统计学意义，P < 0.001。
表 1 全同胞组和无关个体组CIBS值和lgCFSI值的$ \bar x \pm s $ 和独立样本t检验结果（$\bar x \pm s $ ）Table 1. The$ \bar x \pm s $ and independent sample t test results of the CIBS values and lgCFSI values between the full sibling group and the unrelated individual group （$\bar x \pm s $ ）计算方法 数值 t值 P值 CIBS 全同胞 24.400 ± 2.834 78.000 < 0.001 无关个体 12.160 ± 2.739 lgCFSI 全同胞 6.388 ± 2.763 75.146 < 0.001 无关个体 −4.402 ± 1.909 2.3 3种方法的统计结果及差异
分别按照3种方法对全同胞组和无关个体组的计算结果进行统计整理和χ2 检验（表2），显示方法一有1087对样本可以得到倾向性意见，有381对样本无法得出倾向性意见，实际检出率为74.05%；方法二有750对样本可以得到倾向性意见，有718对样本无法得出倾向性意见，实际检出率为51.09%；方法三有972对样本可以得到倾向性意见，有496对样本无法得出倾向性意见，实际检出率为66.21%。3种方法在19个常染色体STR基因座检测水平上的全同胞组检测准确率和无关个体组检测准确率均为100%。3种方法的χ2检验结果显示在全同胞组和无关个体组中，3种方法的检出率不完全相同，差异有统计学意义。对2个组别中3种方法的检出率进行方法二与方法一和方法三的比较（表3），通过Bonferroni方法进行校正，结果显示在2个组别中方法二与方法一和方法三的差异均有统计学意义。
表 2 3种方法的统计结果（n）Table 2. Statistical results of the three methods （n）组别 计算方法 倾向于认定
为全同胞无法给出倾
向性意见倾向于认定为
无关个体全同胞检出率 无关个体检出率 χ2 P 全同胞 方法一 379 69 0 84.60 15.879 < 0.001 方法二 332 116 0 74.11 方法三 363 85 0 81.03 无关个体 方法一 0 312 708 69.41 173.550 < 0.001 方法二 0 602 418 40.98 方法三 0 411 609 59.71 表 3 3种方法两两比较Table 3. Pairwise comparison of three methods计算方法 全同胞 无关个体 χ2 P χ2 P 方法二 方法一 15.047 < 0.001* 166，702 < 0.001* 方法三 6.164 0.013* 75.535 < 0.001* *P < 0.017。 3. 讨论
对于同样的19个常染色体STR基因座检测系统，以上不同全同胞鉴定阈值划分方法的系统效能在两份规范中分别为0.7500，0.5565和0.6625；在云南人群中的系统效能分别为0.7405，0.5109和0.6621。比较新旧规范中IBS法的应用，因CIBS阈值划分标准不同，两种方法的系统效能相差约0.1935，在云南人群中2种方法的系统效能相差约0.2269。在新规范中减少的这部分系统效能是由于更新的规范中将个体对的得分为“CIBS = 12”、“CIBS = 13”、“CIBS = 22”时判定为“无法给出倾向性意见”，同时靠近阈值附近的个体对数也明显较多，从而导致两种方法的系统效能相差较大。新规范降低了IBS法判定全同胞关系的系统效能，降低了误判率，使得全同胞鉴定时给出肯定意见的准确性有所提高[6]。
FSI法对于全同胞关系指数的计算由ITO法提供[7]，用以判定两名有争议个体是否为全同胞关系的方法。该方法的计算过程较IBS法稍显复杂，但FSI法考虑到了人群群体遗传学差异，基于不同人群等位基因频率在某一检测系统下进行计算，因此能有效避免全同胞关系鉴定中的误判，增加结果的可信度[8]。本研究基于新规范以及文献报道的云南人群的等位基因频率，在19个常染色体STR基因座检测系统下，通过FSI法计算的系统效能均高于IBS法。同时，比较全同胞组和无关个体组的正态分布曲线，lgCFSI值的重叠范围和比例明显小于CIBS值的重叠范围和比例，也说明FSI法能对全同胞和无关个体进行更有效的区分。
本研究考虑到实际鉴定中，不同人群同一基因座上等位基因频率分布的差异会使得同一基因座的个体识别能力有所不同[9]，从而导致同一检测系统在不同人群中的系统效能有一定差异的情况。应用新规范中IBS法和FSI法在19个常染色体STR检测系统上对1468对云南人群样本进行了全同胞关系鉴定，计算所得在云南人群中两种方法的系统效能分别为0.5109和0.6621与新规范中同一检测系统下对应方法的系统效能0.5565和0.6625相近，说明新规范在云南人群中有很高的应用价值。对于云南地区少数民族聚集，不同的少数民族间或有部分等位基因频率存在较大差异的情况[10]，新规范规定，当某个基因座的个体识别能力与规范中存在较大差异时，可以在准确性不低于99.99%的前提下重新计算并制定全同胞关系鉴定的CIBS阈值，这也能有效解决新规范在各地区人群中实际应用的局限。
对于无法给出倾向性意见可补充检测基因座，以增加能给出倾向性意见的可能性[11]。新规范中也给出了基于19个常染色体STR基因座依次补充36个与其不存在连锁不平衡的常染色体基因座后相应的检测系统效能，对于IBS法和FSI法其最高系统效能分别可达0.9986和0.9965[3]，能有效区分全同胞和无关个体。对于特殊的鉴定案件，还可补充检验X染色体、Y染色体或线粒体DNA遗传标记的情况[12]，但应该根据其遗传规律采用文字描述的方式进行分析说明。
本研究发现，基于19个常染色体STR基因座检测系统，新规范在云南人群全同胞关系鉴定中具有较高的法医学应用价值；相较于旧规范，新规范中的IBS法和FSI法能有效降低全同胞关系鉴定的错判风险。由于IBS法和FSI法在计算原理上的差异 ，本文建议实际应用中将IBS法和FSI法相结合，对结果进行更为科学和准确的判断。需要注意的是，无论新规范还是旧规范均只适用于同父同母的全同胞关系鉴定，对于半同胞关系的判别并不适用。实际案件中如遇到不确定为全同胞的情况，可通过ITO法对全同胞和半同胞关系进行判别[13-14]，从而得出相应结论。
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图 1 Site84的高效液相色谱（HPLC）分析图和质谱分析图
A：HPLC纯化图，波峰即为Site 84；B：图A中波峰的二次质谱图。
Figure 1. HPLC analysis and mass spectrometry analysis of Site 84
图 2 rhMMPs酶活性位点滴定
A：MMP-12的酶活性浓度；B：MMP-7的酶活性浓度；C：MMP-2的酶活性浓度；D：MMP-9的酶活性浓度。
Figure 2. Titration of enzymatic activity sites of rhMMPs
图 3 MMP-2/-7/-9/-12 与荧光多肽底物Site 84的酶促反应
Figure 3. Enzymatic reactions of MMP-2/-7/-9/-12 with fluorescent peptide substrate Site 84
图 4 明胶酶（MMP-2 及 MMP-9）与荧光多肽底物 Site 84的酶促反应
Figure 4. Enzymatic reactions of gelatinases （MMP-2 and MMP-9） with fluorescent peptide substrate Site 84
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