In Vitro Inhibition of Coxsackievirus by Blumea Balsamifera （L.）DC Extracts
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摘要:
目的 对艾纳香提取物体外抗柯萨奇病毒（CVB5）效果进行研究。 方法 采用倍数稀释的柯萨奇病毒液并将其与RD细胞共同孵育以确定其TCID50值；将不同浓度的艾纳香提取物添加到含有RD细胞的96孔板内，以此评估其对细胞活力的影响程度；在含有RD细胞及艾纳香提取物的96孔板内进一步观察艾纳香提取物对抗柯萨奇病毒的能力。 结果 柯萨奇病毒液的TCID50值为10−7.67。艾纳香提取物对柯萨奇病毒的抑制率随浓度的上升而增大，其针对柯萨奇病毒的IC50值则达到了7.26 mg/L。提取物在50 mg/L的浓度时可导致RD细胞活力降低（P < 0.05），但在6.25～50 mg/L的浓度范围里却能使含有病毒的RD细胞活力上升（P < 0.05），并且选择指数（SI）超过了6.89。 结论 艾纳香提取物具备体外对抗柯萨奇病毒的活性。 Abstract:Objective To investigate the in vitro antiviral effects of Blumea balsamifera（L.）DC. extract against Coxsackievirus B5 （CVB5）. Methods A series of dilutions of Coxsackievirus were prepared and co-cultured with RD cells to determine the TCID50 value. Subsequently, different concentrations of the extract were added to a 96-well plate containing RD cells to evaluate their impact on cell viability. The ability of Blumea balsamifera extract to inhibit Coxsackievirus was further observed in the 96-well plate containing RD cells and the extract. Results The TCID50 value of Coxsackie virus solution was 10−7.67. The inhibition rate of Blumea balsamifera extract against Coxsackievirus increased with concentration, with an IC50 value of 7.26 mg/L. At a concentration of 50 mg/L, the extract caused a decrease in RD cell viability（P < 0.05）, but within the concentration range of 6.25 to 50 mg/L, it increased the viability of virus-infected RD cells（P < 0.05）, with a selectivity index （SI） exceeding 6.89. Conclusion Blumea balsamifera（L.）DC. extract exhibits in vitro activity against Coxsackievirus. -
Key words:
- Blumea balsamifera（L.）DC. /
- Antiviral agents /
- Coxsackie virus
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疱疹性咽峡炎和手足口病是儿童急性传染性疾病[1]，易形成聚集性疫情，且四季高发。柯萨奇病毒（coxsackie virus，CV）和肠道病毒（enterovirus，EV）感染是主要病因，可经食物、接触和呼吸道飞沫传播，目前临床上尚无针对该类病毒感染的特效药[2-3]。
菊科植物艾纳香[Blumea balsamifera（L.）DC.]在我国云南、贵州、广西、海南等地区广泛分布，被苗族、黎族、壮族等少数民族长期应用。金喉健喷雾剂（国药准字 Z20025361）是以艾纳香提取物为主要原料的制剂，常用于治疗口腔和呼吸道疾病或缓解口腔溃疡[4]、根尖周炎[5]、慢性咽炎[6]、手足口病[7]、小儿疱疹性咽峡炎[8]等疾病症状。本课题组前期研究发现，金喉健配方萃取物对H1N1流感病毒半数抑制浓度 （IC50） 为8.71 mg/L [9]，其体外抗病毒活性与奥司他韦相当。根据临床试验的观察结果，金喉健喷雾剂可以有效地应对许多病症，例如急性和慢性的咽喉炎症、扁桃腺发炎和急性支气管炎，甚至包括儿童患有的疱疹性咽峡炎等[10-11]。此外，针对由柯萨奇病毒引发的手足口病，该药物被证实能够显著改善患者的口腔状况 [12]。因此本研究主要探索金喉健喷雾剂主药艾纳香提取物的抗病毒活性。
本研究通过柯萨奇病毒B组5型（CVB5）感染RD人横纹肌肉瘤细胞（human rhabdomyosarcoma Cells，RD）作为体外模型，评价艾纳香提取物的抗病毒活性及其量-效关系，进一步挖掘民族药艾纳香在抗病毒和控制病毒传播方面的应用潜能。
1. 材料与方法
1.1 试剂
DMEM培养基：美国Gibco公司；DMSO：天津津东天正精细化工试剂厂；氟西汀盐酸盐：美国默克公司；CellTiter-Glo试剂盒：普洛麦格（北京）生物技术有限公司。
1.2 仪器
本研究所用的主要仪器设备有：QP-160型CO2恒温培养箱，山东博科生物产业有限公司；XDS-1型倒置相差显微镜，深圳市星明光学仪器有限公司；L500型低速离心机，湖南湘仪实验仪器开发有限公司；1510型全波长酶标仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。
1.3 病毒与细胞
柯萨奇病毒B5（coxsachievirus B5，CVB5）与人横纹肌肉瘤细胞（human rhabdomyosarcoma Cells，RD），来自中国医学科学院医学生物研究所。
1.4 实验方法
1.4.1 供试品制备
艾纳香提取物由贵州宏宇药业有限公司制备，提取工艺详见专利号：CN20211 0082036.9。首先以DMSO作为载体对艾纳香的提取物进行溶解形成母液，然后利用培养基将其进一步稀释至所需浓度（包括50 mg/L、25 mg/L、12.5 mg/L、6.25 mg/L、3.13 mg/L、1.56 mg/L、0.78 mg/L和0.39 mg/L），培养基中含1% DMSO。阳性药物使用相同的方法将氟西汀（Fluoxetine，Flu）配制成12.5 μM浓度的溶液。
1.4.2 病毒毒力测定
将RD细胞按3 × 104个分别加入96孔板的指定孔中进行培养，在37 ℃ ，5% CO2培养条件下待到细胞贴壁后吸弃上清液，将柯萨奇病毒原液按照10倍梯度稀释（即取病毒原液100 μL加入900 μL培养基中，混匀后作为10−1稀释液；再取10−1稀释液100 μL加入900 μL培养基中，混匀后作为10−2稀释液，以此类推，直至达到所需稀释倍数），然后将不同稀释倍数的病毒液加入细胞培养体系中，继续培养，设置空白对照，重复测试4次[12]。连续7 d在37 ℃ 、5% CO2环境下培养，第7天用显微镜观察其病理变化，并采用Reed-Muench法检测病毒半数细胞培养物感染量[13-14]。
1.4.3 细胞病变效应测定
按照每组3 × 104个RD细胞数量分配至各自的96孔板位置并开始培育，保持在37°C和5% CO2的环境下直至细胞贴壁后，移除所有上层液体。然后，将1.4.1中的艾纳香提取物的100 μL体积添加进各个孔内。艾纳香组培养基中含有不同浓度的艾纳香提取物，阳性药物组培养基中含有12.5 μmol/L的Flu，空白对照组为仅含1% DMSO的培养基。继续培养36～40 h后用酶标仪检测各孔吸光度值（CellTiter-Glo试剂盒），按试剂盒说明书计算细胞活力。通过对比各组加入100TCID50病毒液后细胞活力的变化情况，计算测试物对病毒的抑制率[15]，并运用Probit回归法推算出艾纳香提取物对病毒的50%抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）及其选择系数（selection Index，SI）[13-14]。
提取物对病毒抑制率 = 1 − （ 提取物对细胞作用检测值 − 提取物对病毒作用检测值） / （ 空白组检测值 − 病毒对照检测值）
SI = TC50 /IC50。
1.5 统计学分析
实验数据采用GraphPad Prism8.3.0软件进行统计学分析，所有数据均代表至少3个独立的实验，数据以均数加减标准差（mean ± SD）表示，多组间数据比较采用单因素方差（One-way ANOVA）分析，P < 0.05 为差异具有统计学意义。通过Probit回归分析计算提取物对病毒的半数抑制浓度（IC50）。
2. 结果
2.1 艾纳香提取物对细胞毒性的测定
0.39 mg/L、0.78 mg/L、1.56 mg/L、3.13 mg/L、6.25 mg/L、12.5 mg/L和25μg/L艾纳香提取物组细胞活力与空白组相似（P > 0.05），50 mg/L的艾纳香提取物可将细胞活力显著降低至73.39%（P < 0.05），提示50 mg/L的艾纳香提取物有一定的细胞毒性，见表1。
表 1 提取物对RD细胞活力的影响（$\bar x \pm s $）Table 1. Impact of extract on the viability of RD cells （$\bar x \pm s $）分组 干预剂量 细胞活力（%） P 艾纳香组 50 mg/L 73.39 ± 0.26* 0.0195 25 mg/L 104.49 ± 0.46 P > 0.05 12.5 mg/L 108.28 ± 0.43 P > 0.05 6.25 mg/L 111.12 ± 0.40 P > 0.05 3.13 mg/L 121.40 ± 0.37* P < 0.05 1.56 mg/L 99.20 ± 0.04 P > 0.05 0.78 mg/L 115.27 ± 0.35 P > 0.05 0.39 mg/L 115.17 ± 0.45 P > 0.05 阳性药物组（Flu） 12.5 μM 101.68 ± 0.40 P > 0.05 空白对照组 仅含1%DMSO培养基 100 ± 0.43 与空白对照组比较，* P < 0.05；F（9，19） = 3.241，P = 0.0148 。2.2 病毒毒力与艾纳香提取物体外抗柯萨奇病毒作用的测定
病毒液的浓度是通过10倍梯度稀释后接种细胞，观察细胞病变效应（CPE），并根据 Reed-Muench 法计算其TCID50。抗病毒试验中使用的病毒液浓度为100 TCID50/mL，该病毒液的TCID50值为10−7.67。如表2中的数据显示，当加入病毒时的各组细胞活力与空白对照组进行比较，在艾纳香提取物浓度小于等于3.13 mg/L时，艾纳香组的细胞活力与空白对照组相当（P > 0.05）。证明艾纳香提取物在这些情况下在体外对病毒的破坏不具备对抗作用；当艾纳香提取物在超过6.25 mg/L条件下，细胞活力高于加入病毒的空白对照组（P < 0.05）。表明艾纳香提取物在此条件下对病毒的破坏具有一定的对抗作用。
表 2 提取物对病毒的抑制作用（$\bar x \pm s $）Table 2. Inhibitory effect of extract on virus （$\bar x \pm s $）组别 干预剂量 细胞活力（%） 显著性（P） 显著性（P） 病毒抑制率（%） 艾纳香组 50 mg/L 54.12 ± 0.04**## < 0.0001 < 0.0001 78.69 ± 7.90 25 mg/L 86.43 ± 0.10** < 0.0001 0.4707 80.03 ± 9.74 12.5 mg/L 88.04 ± 0.01** < 0.0001 0.6942 77.63 ± 9.20 6.25 mg/L 39.12 ± 0.05**## < 0.0001 < 0.0001 20.41 ± 8.98 3.13 mg/L 8.44 ± 0.01## 0.9997 < 0.0001 0 1.56 mg/L 7.14 ± 0.01## 0.9970 < 0.0001 0 0.78 mg/L 7.98 ± 0.02## 0.9995 < 0.0001 0 0.39 mg/L 8.78 ± 0.01## 0.9998 < 0.0001 0 阳性药物组（Flu） 12.5 μmol/L 94.30 ± 0.07** < 0.0001 91.85 ± 5.81 空白对照组 仅含1%DMSO培养基 9.53 ± 0.02## -- 不加病毒 100 ± 0.43** -- 与加入病毒的空白对照组比较，F（9，20） = 132，*P < 0.05，**P < 0.01；与阳性药物组比较，F（8，18） = 1，#P < 0.05，##P < 0.01。 经25 mg/L和12.5 mg/L剂量的艾纳香提取物干预，细胞活力与阳性药物组相比，差异无统计学意义（P > 0.05），证明这两个浓度下的提取物对保护细胞免受病毒的破坏作用与Flu相当，细胞形态见图1。50 mg/L的提取物有一定保护细胞免受病毒破坏的作用，但效果不如Flu。
图 1 各组细胞形态对比（标尺：50 μm）A：未感染病毒的正常RD细胞形态；B：病毒感染的RD细胞形态；C：测试物组，经12.5 mg/L艾纳香提取物干预病毒感染的RD细胞形态正常；D：阳性药物组，经12.5 μmol/L Flu干预病毒感染的RD细胞形态正常。Figure 1. Cell morphology of each group （scale bar:50 μm）2.3 测试物对病毒的半数抑制浓度
根据图2呈现的数据，得出测试物对病毒的半数抑制浓度（IC50）为7.26 mg/L。根据2.1中结果可知提取物在50 mg/L还未达到半数细胞毒性浓度，因此提取物SI大于6.89。
3. 讨论
由柯萨奇病毒感染引起的手足口病和疱疹性咽峡炎是一种广泛存在的全球常见病，对学龄前儿童感染性较强[13-16]。近年我国此病发病率为26.37～64.97/10万，临床表现主要为发热、咽痛、手足出现皮疹或咽峡部位出现疱疹等症状[17-18]。但因此病病程短，且预后良好，往往不被人们所重视，易于延误或错误治疗导致肺炎、心肌炎神经源性肺水肿及循环衰竭等重症，近年报道该病死亡率为6.46～51.00/10万[2-3] 。目前对于手足口病暂无具体的临床管理和治疗方法，尽管肠道病毒71型疫苗已在中国获批用于治疗手足口病，但疫苗在现实情况下的有效性仍未被完全证明[19−21]。
鉴于含艾纳香的制剂能改善手足口病类似症状，本课题组选用不同浓度艾纳香提取物溶液，进行了艾纳香提取物体外抗柯萨奇病毒的研究：（1）本研究发现艾纳香提取物在浓度低于25 mg/L时对细胞无毒性，且在6.25～25 mg/L浓度范围内对柯萨奇病毒具有抑制作用。（2）艾纳香提取物浓度为25 mg/L和12.5 mg/L时对病毒的抑制作用与阳性药Flu效果相当（P > 0.05）。
研究证明艾纳香提取物在安全剂量范围内能有效的抑制柯萨奇病毒，预示着艾纳香中含有抗病毒的高活性、高安全性的先导化合物。艾纳香在抗病毒和控制病毒传播方面具有应用潜能，然而艾纳香在抗病毒方面良好活性背后的物质基础及作用机制研究却相对滞后，这方面还有待继续深入研究。
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图 1 各组细胞形态对比（标尺：50 μm）
A：未感染病毒的正常RD细胞形态；B：病毒感染的RD细胞形态；C：测试物组，经12.5 mg/L艾纳香提取物干预病毒感染的RD细胞形态正常；D：阳性药物组，经12.5 μmol/L Flu干预病毒感染的RD细胞形态正常。
Figure 1. Cell morphology of each group （scale bar:50 μm）
表 1 提取物对RD细胞活力的影响（$\bar x \pm s $）
Table 1. Impact of extract on the viability of RD cells （$\bar x \pm s $）
分组 干预剂量 细胞活力（%） P 艾纳香组 50 mg/L 73.39 ± 0.26* 0.0195 25 mg/L 104.49 ± 0.46 P > 0.05 12.5 mg/L 108.28 ± 0.43 P > 0.05 6.25 mg/L 111.12 ± 0.40 P > 0.05 3.13 mg/L 121.40 ± 0.37* P < 0.05 1.56 mg/L 99.20 ± 0.04 P > 0.05 0.78 mg/L 115.27 ± 0.35 P > 0.05 0.39 mg/L 115.17 ± 0.45 P > 0.05 阳性药物组（Flu） 12.5 μM 101.68 ± 0.40 P > 0.05 空白对照组 仅含1%DMSO培养基 100 ± 0.43 与空白对照组比较，* P < 0.05；F（9，19） = 3.241，P = 0.0148 。
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表 2 提取物对病毒的抑制作用（$\bar x \pm s $）
Table 2. Inhibitory effect of extract on virus （$\bar x \pm s $）
组别 干预剂量 细胞活力（%） 显著性（P） 显著性（P） 病毒抑制率（%） 艾纳香组 50 mg/L 54.12 ± 0.04**## < 0.0001 < 0.0001 78.69 ± 7.90 25 mg/L 86.43 ± 0.10** < 0.0001 0.4707 80.03 ± 9.74 12.5 mg/L 88.04 ± 0.01** < 0.0001 0.6942 77.63 ± 9.20 6.25 mg/L 39.12 ± 0.05**## < 0.0001 < 0.0001 20.41 ± 8.98 3.13 mg/L 8.44 ± 0.01## 0.9997 < 0.0001 0 1.56 mg/L 7.14 ± 0.01## 0.9970 < 0.0001 0 0.78 mg/L 7.98 ± 0.02## 0.9995 < 0.0001 0 0.39 mg/L 8.78 ± 0.01## 0.9998 < 0.0001 0 阳性药物组（Flu） 12.5 μmol/L 94.30 ± 0.07** < 0.0001 91.85 ± 5.81 空白对照组 仅含1%DMSO培养基 9.53 ± 0.02## -- 不加病毒 100 ± 0.43** -- 与加入病毒的空白对照组比较，F（9，20） = 132，*P < 0.05，**P < 0.01；与阳性药物组比较，F（8，18） = 1，#P < 0.05，##P < 0.01。
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