Comparison of the Effects of Four Methods on the Removal of Calcium Hydroxide Paste in Root Canals by Three-dimensional Reconstruction of Mimics Software
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摘要:
目的 比较4种方法对根管内氢氧化钙糊剂的清除效果。 方法 将40个45°单弯树脂根管随机分成4组，进行根管预备后用玻璃离子水门汀封闭根尖孔，在根管内填充氢氧化钙糊剂，硬蜡封闭根管口。37˚C恒温水浴放置14 d后，分别使用针头冲洗法、Er: YAG激光荡洗法、EDDY工作尖荡洗法和超声荡洗法4种方式消除根管内氢氧化钙糊剂。利用锥形束CT对氢氧化钙清除前后的树脂根管进行扫描，将扫描结果导入Mimics软件，通过Mimics软件对每个根管进行三维重建，并计算各根管内的氢氧化钙体积。氢氧化钙清除前体积为V1，清除后体积为V2，清除率 = （V1-V2）/V1×100%。使用秩和检验进行统计学分析。 结果 清除前各组氢氧化钙糊剂的初始体积差异无统计学意义（P > 0.05）。清除后Er: YAG激光组氢氧化钙糊剂剩余体积为0.1296（0.0920,0.1743） mm³，小于其他3组，差异有统计学意义（P < 0.05），氢氧化钙糊剂清除率为99.63%（99.53%，99.70%），高于其他3组，差异有统计学意义（P < 0.05）。EDDY组和超声荡洗组的清除率分别是99.08%（98.85%，99.19%）和99.04%（98.51%，99.15%），二者差异无统计学意义（P > 0.05），但均高于针头冲洗组74.99%（64.43%，88.07%），差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 Er：YAG激光荡洗、EDDY荡洗、超声荡洗对根管内氢氧化钙糊剂的清除效果均优于针头冲洗法。其中，Er：YAG激光荡洗清除效率最高，EDDY荡洗和超声荡洗的清除效果接近，但4种方法均无法完全清除弯曲根管内的氢氧化钙糊剂。 Abstract:Objective To compare the efficacy of four methods on removal of calcium hydroxide in root canals. Methods Forty simulated resin root canals with 45° curvature were randomly divided into four groups. After root canal preparation, the apical foramen were sealed with glass-ionomer cement, the root canals were filled with calcium hydroxide, and the root canal orifices were sealed with hard wax. After being placed in a constant temperature water bath at 37 ℃ for 14 days, four methods including needle irrigation, Er: YAG laser irrigation, EDDY working tip irrigation and ultrasonic irrigation were used to remove the calcium hydroxide. The resin root canals before and after calcium hydroxide removal were scanned by cone-beam CT, and the scanning results were imported into Mimics software. Three-dimensional reconstruction of each root canal was performed by Mimics software, and the volume of calcium hydroxide in each root canal was calculated. The volume of calcium hydroxide was V1 before removal and V2 after removal, and the clearance rate was （V1-V2）/V1 * 100%. Rank sum test was used for statistical analysis. Results There was no significant difference in the initial volume of calcium hydroxide paste among the groups before removal （P > 0.05）. After removal, the residual volume of calcium hydroxide paste in Er: YAG laser group was 0.1296 （0.0920, 0.1743） mm3, which was less than the other three groups, and the difference was statistically significant （P < 0.05）. The reduction rate of calcium hydroxide paste was 99.63 % （99.53%, 99.70%） in Er: YAG laser group, which was higher than the other three groups, and the difference was statistically significant （P < 0.05）. The reduction rates of EDDY group and ultrasonic group were 99.08% （98.85%, 99.19%） and 99.04% （98.51%, 99.15%）, respectively. There was no significant difference between the two groups （P > 0.05）, but they were higher than needle group 74.99% （64.43%, 88.07%） （P < 0.05）, and the difference was statistically significant. Conclusions In this study, Er: YAG laser-activated irrigation, EDDY irrigation and ultrasonic irrigation have better removal effects on calcium hydroxide paste in root canals than traditional needle irrigation. Compared with other four methods, Er: YAG laser-activated irrigation has the highest removal efficiency, EDDY irrigation and ultrasonic irrigation have similar removal efficiency, but none of the four methods could completely remove calcium hydroxide paste from the curved root canals. -
诺氟沙星为第三代喹诺酮类药物，通过影响细菌DNA合成从而导致细菌死亡呈现杀菌作用，具有抗菌谱广抗菌作用强的特性，对革兰阳性和阴性菌、铜绿假单胞菌均有良好抗菌活性[1-5]。临床主要用于敏感菌所致的呼吸道感染，尿路感染、淋病、前列腺炎、肠道感染和伤寒及其他沙门菌感染[6-8]。诺氟沙星葡萄糖注射液为复方制剂，由诺氟沙星和葡萄糖两种成分组成，其中诺氟沙星作为治疗有效成分，葡萄糖则作为渗透压调节剂。除了上述两种成分，在注射剂中常加入乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA-2Na），作为有效的抗氧化增效剂和稳定剂[9]，其原理为EDTA-2Na与输液中微量的金属离子形成螯合物后，阻止了金属离子对药物自身氧化的催化作用显著改善了输液的配伍稳定性。EDTA-2Na被列为GRAS安全物质，收载于FDA《非活性组分指南》[10]，用于非注射剂和注射给药剂型，但过量的EDTA-2Na会与血液及骨骼中的钙形成水溶性的螯合物，引起低血钙症和骨钙流失，所以药物制剂中EDTA-2Na作为螯合剂的浓度建议在0.005%～0.1%[11]。
目前国家标准中测定EDTA-2Na的含量方法为《中国药典》2010版二部收载的化学滴定法[12]，化学滴定法通常用于测定高中含量的组分，对于注射液中微量的EDTA-2Na测定，且受注射液中主药和辅料的干扰，进行定量分析的重现性和准确度较低。EDTA-2Na在注射液中检测方法研究较少[13-14]，未见报道测定诺氟沙星葡萄糖注射液中EDTA-2Na的含量。本法采用三氯化铁与EDTA-2Na反应后形成稳定螯合物在254 nm处有显著吸收的特点，利用C18柱将其与其他组分分离，用RP-HPLC法进行含量测定，并采用该法对2018年国家药品评价性抽验品种诺氟沙星葡萄糖注射液的1家企业的15批样品进行测定。
1. 材料与方法
1.1 仪器
BP-211D电子天平（赛多利斯）。岛津LC-20AD高效液相色谱仪（日本岛津公司）。
1.2 试剂与试药
乙腈（德国默克公司,色谱纯）；醋酸铵（西陇化工股份有限公司）；三氯化铁（西陇化工股份有限公司）
诺氟沙星葡萄糖注射液（湖南科伦制药有限公司，规格100 mL/瓶，诺氟沙星0.2 g与葡萄糖5 g，2018年国家评价性抽验样品）；乙二胺四乙酸二钠对照品（成都华邑药用辅料制造公司）。
1.3 方法
采用反相高效液相色谱法测定诺氟沙星葡萄糖注射液中乙二胺四乙酸二钠的含量。
1.3.1 色谱条件
色谱柱（SHIEIDO C18-MGⅡ，5 µm，4.6×250 mm），流动相为乙腈：0.05 mol/L醋酸铵：水（70∶15∶15），检测波长254 nm，柱温35 ℃，流速1.0 mL/min，进样体积20 μL。
1.3.2 溶液的制备
（1）乙二胺四乙酸二钠对照品溶液的配制 取乙二胺四乙酸二钠对照品适量，精密称定，加水溶解并稀释制成1 mg/mL的溶液，测定前，精密量取5 mL置50 mL量瓶中，加水10 mL，再加0.1 mL/L的三氯化铁溶液2 mL，摇匀，超声溶解，加水至刻度摇匀，以0.45 μm微孔滤膜滤过，备用。
（2）供试品溶液的配制 精密量取诺氟沙星葡萄糖注射液5 mL置50 mL量瓶中，加水10 mL，再加0.1 mol/L的三氯化铁溶液2 mL，摇匀，超声溶解，加水至刻度摇匀，以0.45 μm微孔滤膜滤过，备用。
（3）空白溶液的配制 取注射液的处方量，不加EDTA-2Na，按1.3.2.2供试品溶液项下配制方法，配制空白辅料溶液。
1.4 方法学的考察
1.4.1 专属性实验
取（1）、（2）、（3）项下的对照品溶液、供试品溶液、空白溶液按1.3.1项下的色谱条件进行测定，记录色谱图。
1.4.2 线性关系
分别精密量取1 mg/mL EDTA-2Na溶液0.2，0.4，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 mL置100 mL量瓶中，加水20 mL，再加0.1 mol/L的三氯化铁溶液2 mL，摇匀，超声溶解，加水至刻度摇匀。按照1.3.1项下的色谱条件进样以溶液浓度为横坐标（X），色谱峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程。
1.4.3 精密度
取（1）项下的对照品溶液按1.3.1项下的色谱条件连续进样6次，记录色谱图，以峰面积计算精密度，精密度用相对标准偏差（RSD）表示，要求RSD≤2.0%；RSD越小，精密度越高。
1.4.4 重复性
取批号为K18022001的样品按照（2）项下配制样品溶液6份，按1.3.1项下的色谱条件进样分析，记录色谱图，以峰面积计算重复性，重复性用相对标准偏差（RSD）表示，要求RSD≤2.0%；RSD越小，重复性越好。
1.4.5 回收率
精密量取诺氟沙星葡萄糖注射液2 mL，置100 mL量瓶中，共量取9份，每3个量瓶为1组。在低、中、高3组每组分别精密加入1.0 mg/mL的EDTA-2Na溶液0.8、1.0、1.2 mL，加水20 mL，再加0.1 mol/L的三氯化铁溶液2 mL，摇匀，超声溶解，加水至刻度摇匀，所得浓度分别为8.0057 µg/mL，10.004 µg/mL，12.0241 µg/mL。照按1.3.1项下的色谱条件项下色谱条件进样，按外标法计算EDTA-2Na的平均回收率和RSD。
1.4.6 检测限和定量限
精确配制EDTA-2Na系列浓度溶液，系列浓度为0.09285，0.1857，0.2476，0.3714 μg/mL，与空白溶液依次按照按1.3.1项下的色谱条件项下色谱条件分别进样，测定S/N = 3时的浓度。精确配制EDTA-2Na系列浓度溶液，系列浓度为0.1238，0.4952，0.6190，0.9904 μg/mL，与空白溶液依次按照按1.3.1项下的色谱条件项下色谱条件分别进样，测定S/N = 10时的浓度。
1.5 稳定性考察
照（2）项下配制供试品溶液，在室温下放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h后测定其峰面积的变化。
2. 结果
2.1 方法学考察结果
2.1.1 专属性实验结果
用本法测定，乙二胺四乙酸二钠峰不受其他组分干扰，分离度良好，见图1。
2.1.2 线性关系结果
以溶液浓度为横坐标（X），色谱峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程为y = 32 189x-12477（R2 = 0.9997），实验表明乙二胺四乙酸二钠在2.0326～200.3260 μg/mL浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.1.3 精密度
对照品溶液连续进样6次，EDTA-2Na峰面积RSD为0.6%（n = 6）；表明本法精密度良好。
2.1.4 重复性
测定6份相同浓度的供试品溶液，EDTA-2Na峰面积RSD为1.2%（n = 6）；表明本法重复性良好。
2.1.5 回收率
按外标法计算乙二胺四乙酸二钠的平均回收率、RSD结果，可知低、中、高3个浓度的回收率（n = 3）分别为98.56%、98.26%、97.50%，总回收率为98.11%（n = 9），见表1。表明本法准确性良好。
表 1 回收率（n = 9）Table 1. Recovery rate （n = 9）序号 EDTA-2Na加入量
（mL）实际测得量
（μg/mL）样品含量
（μg/mL）加标量
（μg/mL）回收率
（%）平均回收率
（%）RSD
（%）1 0.8 17.7539 9.8869 8.0057 98.59 98.56 0.03 2 17.7477 98.53 3 17.7506 98.56 4 1.0 19.4621 10.0040 98.36 98.26 0.17 5 19.7295 98.35 6 19.7018 98.07 7 1.2 21.6524 12.0241 96.32 97.50 1.06 8 21.7121 97.99 9 21.7340 98.20 $$\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\! \begin{split}&{\text{回收率}} (\%)=\\& \frac{{\text{实际测得量}}({\rm{{\text{µ}} g/mL}})-{\text{样品含量}}({\rm{{\text{µ}} g/mL}})}{{\text{加标量}}({\rm{{\text{µ}} g/mL}})}\times 100\% \end{split} $$ 2.1.6 检测限和定量限
S/N = 3时，EDTA-2Na检测限为0.1857 μg/mL；S/N = 10时，EDTA-2Na定量限为0.9904 μg/mL。
2.2 稳定性考察
供试品溶液在36 h内EDTA-2Na峰面积RSD为1.2%（n = 7）；表明稳定性良好。
2.3 样品的测定
15批样品EDTA-2Na的含量在96.3 ～101.1 μg/mL之间，平均值为97.9 μg/mL，与企业提供的处方工艺中EDTA-2Na量为100 μg/mL的结果一致，可见该企业严格按照处方工艺投料生产。样品色谱图见图2，测定结果，见表2。
表 2 15批样品EDTA-2Na的测定结果（μg/mL）Table 2. Results of EDTA-2Na determination for 15 batches of samples （μg/mL）序号 批号 处方
加入量实际
测得量平均值 RSD
（%）1 K18022001 100 97.1 97.9 1.46 2 K17100903 96.6 3 K18022002 98.1 4 K17080202 97.0 5 k17080201 96.3 6 k17110501 96.7 7 K17010802 97.3 8 K17100902 98.1 9 K18022001 99.2 10 K18022002 100.2 11 K18022004 98.3 12 K18032601 97.2 13 K18032602 99.1 14 k18010802 101.1 15 k17100901 96.6 3. 讨论
3.1 流动相的选择
前人研究的注射液中测定EDTA-2Na的方法[15-19]，不适用于本品，EDTA-2Na峰受诺氟沙星葡萄糖注射液中主药和辅料的影响，分离效果不好。大多文献方法选择了四丁基溴化铵、四丁基氢氧化铵等离子对试剂作为流动相，因为离子对试剂易增加EDTA络合物在反相色谱柱的保留，与其他成分能较好的分离。笔者在研究前期发现，选择离子对试剂作为流动相时，批量测定时EDTA-2Na峰保留时间的RSD较大，随着测定次数增加保留时间逐渐提前。原因是离子对试剂容易吸附在色谱柱填料的活性位点，难以被冲洗下来，导致柱子的死体积增加，会出现保留时间提前，理论塔板数降低。且这个吸附过程是不可逆的，使色谱柱使用寿命变短。本文选用醋酸铵作为流动相，具有改善峰型，减少次级保留，避免柱效恶化，连续的批量测定后EDTA-2Na峰保留时间和峰面积RSD较小。同时优化了流动相中乙腈比例，使EDTA-2Na峰不受主药和辅料干扰，注射液中其他组分不残留于色谱柱中。
3.2 配位化合物的选择
利用金属离子易与EDTA-2Na螯合的特点，考察选用硫酸铜、三氯化铁、硫酸锌离子和EDTA-2Na进行螯合。前人研究过采用硫酸铜和EDTA-2Na发生反应后进行检测[15-19]，由于诺氟沙星葡萄糖注射液中含有葡萄糖，葡萄糖和铜离子会发生反应生成配位化合物[20]，对本品中的EDTA-2Na结果测定产生干扰。而硫酸锌和EDTA-2Na形成的螯合物在200～400 nm没有紫外吸收，不易用RP-HPLC法测定。选择三氯化铁和EDTA与反应，形成螯合物在254 nm处有较强的紫外吸收，且螯合反应迅速，操作方便，形成的螯合物稳定，故选择三氯化铁作为配位化合物。
3.3 铁离子配位程度的确定
考察铁离子与EDTA-2Na是否螯合完全，加入0.1 mol/L的三氯化铁的量分别为0.5、1、2、3、4、5 mL。加入0.5 mL和1 mL进行反应后，EDTA-2Na峰面积RSD较大，说明铁离子和样品中的EDTA配位反应不完全；加入2 mL～5 mL反应后，峰面积变化的RSD较小，说明配位反应完全，加入2 mL反应后，过滤后的溶液无色，但加入3 mL、4 mL、5 mL反应后，过滤后的溶液为淡黄色，说明铁离子过量。过多的铁离子进入到色谱柱后，较难洗脱。故选用2 mL的0.1 mol/L的三氯化铁溶液和EDTA-2Na进行螯合。
本文为诺氟沙星葡萄糖注射液中EDTA-2Na的检测提供安全有效的检测方法，其方法快速、简便、灵敏、准确，具有成分稳定、分离度好，重现性好，准确度高和检测限低的优点，可作为诺氟沙星葡萄糖注射质量控制项目之一，并实际应用于2018年国家药品评价性抽验工作，获得良好评价，为国家药品安全以及临床上安全合理用药提供科学依据，可为进一步提升药品质量水平、加强药品监管提供技术支持。
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图 1 4种方法清除弯曲根管内氢氧化钙的三维重建图
注：a～d：氢氧化钙清除前图像；e～h：氢氧化钙清除后图像; a、e：针头冲洗组（A组）；b、f：Er：YAG激光荡洗组（B组）；c、g：EDDY荡洗组（C组）；d、h：超声荡洗组（D组）
Figure 1. Three-dimensional reconstruction of calcium hydroxide removal in curved root canals by four methods
图 2 4种方法对氢氧化钙糊剂的清除情况
*P < 0.05。
Figure 2. Removal of of calcium hydroxide by four methods
表 1 4组清除前后体积对比（mm3） [n = 10，M（P25，P75）]
Table 1. Volume comparison of four groups before and after removal （mm3） [n = 10，M（P25，P75）]
体积 A组 B组 C组 D组 H P V1 37.8930（35.0619，39.8430） 35.6483（30.3059，38.4624） 35.7387（31.7397，37.5094） 35.4451（31.7987，36.8102） 5.283 0.152 V2 9.1759（4.3191，12.6670） 0.1296（0.0920，0.1743） 0.3216（0.2644，0.4176） 0.3392（0.2939，0.4784）
32.830
< 0.001*Z −3.780 −3.780 −3.780 −3.780 P < 0.001* < 0.001* < 0.001* < 0.001* *P < 0.05。 
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表 2 4种方法对氢氧化钙糊剂的清除情况[n = 10，M（P25，P75）]
Table 2. Removal of calcium hydroxide by four methods [n = 10，M（P25，P75）]
分组 剩余氢氧化钙体积（mm） 氢氧化钙清除率（%） A组 9.1759（4.3191，12.6670） 74.99（64.43，88.07） B组 0.1296（0.0920，0.1743） 99.63（99.53，99.70） C组 0.3216（0.2644，0.4176） 99.08（98.85，99.19） D组 0.3392（0.2939，0.4784） 99.04（98.51，99.15） H 32.830 33.045 P < 0.001* < 0.001* *P < 0.05。
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