The Spation-temporal Expression of SOX9 during the Development of Mandibular Condylar Cartilage and Tibial Growth Plate Cartilage in SD Rats
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摘要:
目的 通过建立SD大鼠的发育模型，观察髁突软骨与胫骨生长板软骨在胚胎发育过程中的不同生长特性，探讨比较SOX9在2种不同性质软骨生长发育过程中的表达变化及其意义。 方法 30只成年SD大鼠按2雌1雄的比例合笼，观察雌鼠于合笼后是否发现阴栓作为怀孕的标志，计为妊娠0 d，隔离常规饲养。分别于孕鼠妊娠13 d、14 d、15 d、16 d、17 d、18 d、19 d、20 d、21 d剖腹取出胎鼠（embryo，E），连续切片获得E13 d～E21 d的髁突软骨和胫骨生长板软骨不同发育时间的切片标本。利用HE染色、免疫组织化学方法观察2种软骨胚胎发育中的组织学结构特点并检测SOX9在两种软骨胚胎发育中的表达变化。采用SPSS17.0软件包对数据进行单因素方差分析和两独立样本t检验。 结果 E14 d～E21 d，髁突软骨和胫骨生长板软骨的HE染色观察发现其组织学形态结构存在显著差异；免疫组化染色结果显示，E15 d、E17 d、E20 d胎鼠胫骨生长板软骨SOX9阳性表达强于髁突软骨，有统计学意义（P < 0.05）。2种软骨组织中SOX9阳性细胞的分布规律基本一致，且均多位于增殖层。 结论 髁突软骨和胫骨生长板软骨组织结构具有相似的胚胎发育，其差异主要表现为细胞分层排列的方式，而早期胚胎发育相关基因SOX9在髁突软骨、胫骨生长板软骨中均有表达，呈现一定的时空变化，提示SOX9与2种软骨细胞的分化和软骨发育密切相关。 Abstract:Objective To explore the spation-temporal expression changes of SOX9during the development of condylar cartilage and tibial growth plate cartilage in SD rats. Methods Thirty adult SD rats were caged at the female-male ratio of 2∶1. The vaginal plug appeared was designated as gestation day 0 （GD0） and the rats were isolated then and raised in the routine way. The embryos were obtained from day 13 to day 21 respectively and the condylar cartilage and tibial growth plate cartilage were harvested. Serial section was performed to obtain the slices of the two kinds of cartilages at different development stages （E13 d-E21 d）. HE staining and immunohistochemical detection were employed to compare the structure distinguish between two kinds of cartilages and examine the expressional changes of SOX9. The data were analyzed by applying single factor analysis of variance and two independent sample t test in SPSS17.0 software package. Results Some morphological differences, mainly in the forms, stratification and arrangements of cells, were observed between the condylar cartilage and the tibial growth plate cartilage during E14 d-E21 d indicated by HE staining. In tibial growth plate cartilage, the SOX9 positive expression in E15 d, E17 d and E20 d were stronger than those in condylar cartilage （P < 0.05）. The distribution of positive cells in tibial growth plate and cartilage condylar cartilage was basically identical. SOX9 was mainly positive in the proliferation layer of the two kinds of cartilage. Conclusions The main structures of condylar cartilage and tibial growth plate cartilage during the development process are similar. The minority distinguished part is the layered form, which indicates different growth characteristics during embryonic development. During embryonic development, SOX9 is expressed in the two kinds of cartilages above and mainly distributes in the proliferative zone, which shows SOX9 is involved in the cell proliferation and differentiation associated with the differentiation of cartilage cell and development of cartilage. -
Key words:
- Condylar cartilage /
- Tibial growth plate cartilage /
- Embryonic development /
- SOX9
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膜内成骨与软骨内成骨是软骨发育的2种主要形式，这两种发育形式均在一系列生长因子和细胞因子的精密调控下有序进行。髁突软骨和胫骨生长板软骨的成骨方式均为软骨内成骨，在正常发育过程中，系列细胞内分子转导信号的精密调控发挥着重要作用。转录因子SOX9基因，在软骨发育过程中发挥了非常关键的调控作用[1-4]，也扮演了软骨分化“分子开关”的角色[5-8]。SOX9作为转录激活因子，通过直接或间接作用、及与其他的信号通路联动共同起到调节软骨细胞增殖与分化的作用。目前，有关SOX9在软骨生长发育中的研究集中在转基因鼠和嵌体鼠的软骨发育，而探讨处于软骨成骨发育中SOX9的时空表达研究较少，尤其是在同一个体不同部位的2种软骨中的比较研究国内外尚未见报道。
本研究通过建立SD大鼠胚胎髁突软骨和胫骨生长板软骨发育的动物模型，应用组织学、免疫组织化学等方法对比观察SD大鼠胚胎发育过程中髁状突软骨与胫骨生长板软骨的组织细胞结构和SOX9表达的时空变化，研究髁突软骨的发生、发育过程及特点，探讨比较SOX9在两种不同性质软骨发育分化过程中的表达变化及其意义，为临床提供了有力的软骨损伤基因治疗的实验证据。
1. 材料与方法
1.1 实验动物准备及标本制备
自昆明医科大学实验动物学部购入纯系3月龄SD大鼠30只，雌鼠20只、雄鼠10只。SD大鼠于晚上8时按2雌1雄的比例合笼，第2天清晨观察雌鼠阴栓是否出现作为判断怀孕的标志，计为妊娠0 d，分笼后常规饲养。分别于妊娠13 d、14 d、15 d、16 d、17 d、18 d、19 d、20 d、21 d（标记为E13 d～E21 d），每日上午10时乙醚麻醉孕鼠，剖腹取出胎鼠（embryo，E），每个时间点胎鼠4～6只，剪下其头部与后肢，鼠头从矢状位由正中剖为对称的两半。
取出的组织置于4%多聚甲醛后固定24～48 h，浸入20%甲酸脱钙24 h，流水冲洗6～8 h、脱水，之后将半个鼠头沿矢状方向进行包埋，胎鼠后肢沿长轴包埋，蜡块备用。
1.2 切片制备
取不同发育阶段胎鼠颞下颌关节和后肢标本蜡块从浅入深沿矢状面连续切片，厚度为4 µm，切近关节时选取关节层次清楚的切片，常规进行脱蜡、水化，使用多聚赖氨酸处理载玻片，将切片逐个进行HE染色或免疫组化染色，烘烤2 h，备用。
1.3 组织学苏木素-伊红（Hematoxylin-Eosin，HE）染色
进行HE常规染色，脱水、透明、封片，显微镜下进行观察、拍照。
1.4 二步法通用型免疫组化染色
羊抗鼠SOX9抗体（北京中杉金桥），临用前用0.5%羊血清配成1∶500工作液；使用鼠/兔KIT-5004即用型快捷免疫组化MaxVision免疫组化染色试剂盒进行染色，按照说明书指示进行操作。将烘干备用的切片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ（各15 min）透明；浸入梯度乙醇及蒸馏水（各3 min）逐步水化；置于柠檬酸缓冲液中用煮沸（约92～95 ℃）修复90 s，自然冷却至室温，PBS漂洗，3% H2O2封闭10 min，PBS漂洗；滴加50～100 μL SOX9抗体工作液，4℃过夜；用PBS冲洗玻片后滴加50～100 μL羊抗鼠/兔IgG聚合物标记的二抗于组织上，室温孵育15 min，PBS漂洗；50～100 μL显色剂（DAB）染色，光镜下控制显色；显色完全后，用双蒸水冲洗终止反应，苏木素复染2 min，流水冲洗片刻，盐酸酒精分化30 s，流水冲洗30 min、蓝化；常规脱水、透明、干燥、封片。
免疫组化染色以细胞内棕黄色着色为阳性染色。所有染色玻片均在同一放大倍数及光源强度下，同一时间点随机选取3个视野、拍照，HPIAS-1000高清晰度彩色图文分析系统分析处理，对每个视野的阳性着色平均灰度值进行检测，计算每例标本的均值。平均灰度值一般介于0～255之间，平均灰度值越大，阳性表达越弱。
1.5 统计学处理
用SPSS17.0软件对结果进行统计学分析，计量资料符合正态性检验后，结果以均数±标准差表示，采用重复测量方差分析，P < 0.05时有统计学意义。
2. 结果
2.1 髁突软骨与胫骨生长板软骨胚胎发育期结构及组织形态
显微镜下观察可见，从E13 d～E21 d髁突软骨与胫骨生长板软骨胚胎发育期都呈现软骨的基本形态，组织结构大体相似。随着发育的成熟，髁突软骨和胫骨生长板软骨的形态和组织结构有一定差异。
E14 d～E21 d，髁突软骨与胫骨生长板软骨（图1）的HE染色观察发现其组织学形态结构存在显著差异；主要表现在软骨细胞形态、分层、排列等方面：髁突软骨胚胎发育起始为间充质细胞凝聚成细胞团，之后细胞逐渐分化，E16 d呈现髁状突的形态和明显的细胞分层排列，E19 d出现关节间隙；胫骨生长板软骨细胞分化起始晚于髁突软骨，无细胞凝聚区出现，软骨细胞扁平，顺长骨长轴平行排列成柱状，并一直可见特异形态的细胞柱。
图 1 SD大鼠胚胎发育期髁突软骨与胫骨生长板软骨的组织形态（HE染色）E：胚胎。Figure 1. The histomorphology of mandibular condylar cartilage and tibial growth plate cartilage during the embryonic development in SD rats （HE staining）2.2 SOX9在髁突软骨、生长板软骨胚胎发育中的表达
E15 d、E17 d、E20 d胎鼠胫骨生长板软骨SOX9阳性表达强于髁突软骨（表1，图2），有统计学意义（P < 0.05）。E13 d，髁突软骨中SOX9表达最强（138±6.1）E20 d，髁突软骨中的SOX9的表达最弱（200.8±6），两者比较有统计学意义（P < 0.05）。E17 d，胫骨生长板软骨中SOX9的表达最强（156.3±7.2），E21 d，SOX9的表达最弱（204±0.7），两者比较有统计学意义（P < 0.05，表1）。SOX9阳性细胞在胫骨生长板软骨与髁突软骨的分布规律高度一致，两种软骨中SOX9的阳性表达多位于增殖层（区）。
表 1 SOX9在SD大鼠不同阶段胚胎发育期髁突软骨与胫骨生长板软骨的免疫染色光密度值检测结果（$\bar x \pm s $ ）Table 1. The gray value of the immunohistochemical staining of SOX9 in the mandibular condylar cartilage and tibial growth plate cartilage during embryonic development of SD rats （$\bar x \pm s $ ）胚胎时期 髁突软骨 胫骨生长板软骨 E13d 138 ± 6.1 151 ± 1.9 E14d 173 ± 2.4 159 ± 2.6 E15d 167.3 ± 2.5* 161.3 ± 2 E16d 168.7 ± 4.6 173 ± 5.6 E17d 177.5 ± 8.1* 156.3 ± 15 E18d 169.6 ± 6 167 ± 7.2 E19d 181 ± 6.8 189 ± 2.5 E20d 200.8 ± 6* 183.7 ± 6.7 E21d 194 ± 6.1 204 ± 0.7 与胫骨生长板软骨比较，*P < 0.05。 
图 2 SOX9在SD大鼠不同阶段胚胎发育期髁突软骨A1～A4与胫骨生长板软骨B1～B4的免疫染色情况Figure 2. The immunohistochemical staining of SOX9 in the mandibular condylar cartilage A1~A4 and tibial growth plate cartilage B1~B4 during embryonic development of SD rats2.3 SOX9在2种软骨胚胎发育中表达的比较
SOX9阳性细胞在胫骨生长板软骨的分布与时空变化趋势与髁突软骨相似在胚胎发育的早期阶段，E13d SOX9在髁突软骨的表达最强（138±6.1），随后趋于平稳，E20 d表达最低（200.8±6），见图3A，表1；胫骨生长板软骨在E17 d表达，随后开始减弱，E21 d表达最低（204±0.7）见图3B，表1。
图 3 SOX9在SD大鼠不同阶段胚胎发育期髁突软骨与胫骨生长板软骨的表达变化Figure 3. The expressional changes of SOX9 in the mandibular condylar cartilage and tibial growth plate cartilage during embryonic development of SD rats从E15 d～E21 d，两种软骨细胞均观察到SOX9阳性着色，胫骨生长板软骨阳性表达强于髁突软骨细胞，结果显示髁突软骨和胫骨生长板软骨在E15 d、E17 d、E20 d时SOX9的灰度值表达有统计学差异，经统计分析P < 0.05（图3C，表1）。
A1～A4，SOX9在SD大鼠不同阶段胚胎发育期髁突软骨组织切片的免疫染色情况；B1～B4，SOX9在SD大鼠不同阶段胚胎发育期胫骨生长板软骨组织切片的免疫染色情况；箭头标示的为典型的SOX9免疫染色阳性细胞（图2）。
3. 讨论
骨骼系统正常的生长发育对机体具有重要的意义，通常涉及膜内成骨和软骨内成骨两种独立的模式，而后者是骨形成和骨生长的重要过程。髁突软骨作为继发性软骨，其表面狭窄的软骨带直到出生后20～25 a仍长期存在，是颞下颌关节具有适应性生长和改建能力的组织学基础。因此，比较研究两种软骨的成骨过程、发生发育及其潜在的分子生物学机制，对于深入了解软骨生长及软骨细胞的分化调控具有重要意义，也能为临床软骨损伤的治疗修复提供实验室参考。
髁突软骨和胫骨生长板软骨的异常发育均会引起下颌骨发育异常、长骨生长及发育障碍[9]。本研究观察到2种软骨细胞的分层（区）不同，从E18 d起，两种组织的软骨细胞都清晰地分化出了4层（区）。从表面细胞层来看，髁突软骨表面的纤维层细胞为梭形，排列大致与髁突关节表面平行；生长板软骨的则为圆形，胞核占比大，提示该层软骨细胞很少发生分化。另外，2种软骨细胞形态不同：与髁突软骨中的肥大层细胞相比，位于胫骨生长板软骨增殖层中细胞形态更为扁平。E19 d可见生长板软骨细胞叠堆成柱，是生长板软骨发育中的显著特征，而且在胫骨生长板软骨中，增殖层和肥大层的细胞均可观察到明显的细胞柱；髁突软骨细胞则无细胞柱，这也是区别于生长板软骨的特点之一。本研究还观察到两种软骨肥大细胞的出现时间及软骨内成骨发生观察到的时间均不相同：E18 d髁突软骨分层已较明显，可观察到大量的肥大软骨细胞，软骨内成骨已发生；而生长板软骨于E18 d只见少数肥大细胞，E20 d可见初级骨化中心，推测软骨内成骨始于E19～20 d。本研究结果提示髁突软骨与生长板软骨的形成机制不同，其生长速率高于胫骨且软骨内成骨的时间早于胫骨[10]。
另外，从SOX9阳性细胞的时间分布来看，E13 d～E21 d髁突软骨与胫骨生长板软骨均可见SOX9阳性反应，髁突软骨在E13 d表达最强，虽未观察到E13 d、E14 d的胫骨生长板软骨，但从SOX9在两种软骨中表达的趋势来看，推测在胫骨生长板软骨发育的早期也表达最强。而且从E14 d开始 SOX9在髁突软骨的表达趋于平稳，E20 d表达最低；胫骨生长板软骨在E14 d～E20 d表达变化不大，E21 d表达最低。同时，本研究还发现SOX9在两种软骨的增殖层表达均呈现高于其它细胞层，这与前人报道的研究结果相符[11-13]。另外，髁突软骨在E20 d表达最低，早于胫骨生长板软骨的E21 d，推测髁突软骨内成骨时间早于胫骨生长板软骨，与Lee S K等[10]的研究认为髁突软骨与生长板软骨的形成机制不同，其生长速率快于肢体软骨的结论一致，提示SOX9对胫骨生长板软骨的影响可能大于髁突软骨。由于SOX9是通过与蛋白聚糖的增强子原件以及软骨细胞特征Ⅱ型胶原结合而激活其表达，所以结合本研究结果，笔者推测SOX9对以Ⅱ型胶原为主的胫骨生长板软骨的影响也大于髁突软骨。
本研究结果提示，发育早期，髁突软骨和胫骨生长板软骨有着相似的组织细胞结构，但也存在一定差异，表现在软骨细胞亚细胞的形态表现、组织排布及软骨内成骨等方面，本研究发现两种软骨存在不同的生长特点，而髁突软骨生长速度快于胫骨生长板软骨。SOX9阳性表达强于髁突软骨，且两种软骨中的SOX9表达均呈现一定的时间变化，提示SOX9可能通过对大鼠胚胎时期成软骨细胞的调控作用，参与了两种软骨细胞的增殖和分化，软骨的发育。
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图 1 SD大鼠胚胎发育期髁突软骨与胫骨生长板软骨的组织形态（HE染色）
E：胚胎。
Figure 1. The histomorphology of mandibular condylar cartilage and tibial growth plate cartilage during the embryonic development in SD rats （HE staining）
图 2 SOX9在SD大鼠不同阶段胚胎发育期髁突软骨A1～A4与胫骨生长板软骨B1～B4的免疫染色情况
Figure 2. The immunohistochemical staining of SOX9 in the mandibular condylar cartilage A1~A4 and tibial growth plate cartilage B1~B4 during embryonic development of SD rats
图 3 SOX9在SD大鼠不同阶段胚胎发育期髁突软骨与胫骨生长板软骨的表达变化
Figure 3. The expressional changes of SOX9 in the mandibular condylar cartilage and tibial growth plate cartilage during embryonic development of SD rats
表 1 SOX9在SD大鼠不同阶段胚胎发育期髁突软骨与胫骨生长板软骨的免疫染色光密度值检测结果（
$\bar x \pm s $ ）Table 1. The gray value of the immunohistochemical staining of SOX9 in the mandibular condylar cartilage and tibial growth plate cartilage during embryonic development of SD rats （
$\bar x \pm s $ ）胚胎时期 髁突软骨 胫骨生长板软骨 E13d 138 ± 6.1 151 ± 1.9 E14d 173 ± 2.4 159 ± 2.6 E15d 167.3 ± 2.5* 161.3 ± 2 E16d 168.7 ± 4.6 173 ± 5.6 E17d 177.5 ± 8.1* 156.3 ± 15 E18d 169.6 ± 6 167 ± 7.2 E19d 181 ± 6.8 189 ± 2.5 E20d 200.8 ± 6* 183.7 ± 6.7 E21d 194 ± 6.1 204 ± 0.7 与胫骨生长板软骨比较，*P < 0.05。 
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