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HPLC-MS/MS法研究普萘洛尔对映体在不同种属肝微粒体中的代谢差异

杨璨瑜 孙孔春 王娟 普惠萍 沈报春

杨璨瑜, 孙孔春, 王娟, 普惠萍, 沈报春. HPLC-MS/MS法研究普萘洛尔对映体在不同种属肝微粒体中的代谢差异[J]. 昆明医科大学学报, 2023, 44(3): 15-21. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20230321
引用本文: 杨璨瑜, 孙孔春, 王娟, 普惠萍, 沈报春. HPLC-MS/MS法研究普萘洛尔对映体在不同种属肝微粒体中的代谢差异[J]. 昆明医科大学学报, 2023, 44(3): 15-21. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20230321
Canyu YANG, Kongchun SUN, Juan WANG, Huiping PU, Baochun SHEN. Metabolic Differences of Propranolol Enantiomers in Different Species of Liver Microsomes by HPLC-MS/MS[J]. Journal of Kunming Medical University, 2023, 44(3): 15-21. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20230321
Citation: Canyu YANG, Kongchun SUN, Juan WANG, Huiping PU, Baochun SHEN. Metabolic Differences of Propranolol Enantiomers in Different Species of Liver Microsomes by HPLC-MS/MS[J]. Journal of Kunming Medical University, 2023, 44(3): 15-21. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20230321

HPLC-MS/MS法研究普萘洛尔对映体在不同种属肝微粒体中的代谢差异

doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20230321
基金项目: 云南省科技厅科技计划项目(202101AS070048);云南省教育厅科学研究基金资助项目(2019J1190);昆明医科大学科技创新团队(CXTD202003)
详细信息
    作者简介:

    杨璨瑜 (1990~),云南施甸人,理学硕士,实验师,主要从事手性药物对映体分离分析工作

    通讯作者:

    沈报春,E-mail:shen_baochun@126.com

  • 中图分类号: R917

Metabolic Differences of Propranolol Enantiomers in Different Species of Liver Microsomes by HPLC-MS/MS

  • 摘要:   目的  采用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)建立R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔在肝微粒体孵育体系中的含量测定方法,并分别比较普萘洛尔不同对映体在大鼠、犬、猴以及人4种肝微粒体中的代谢特征。  方法  分别将R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔溶解在由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)启动孵育的不同种属的肝微粒体中,在孵育不同的时间后加入乙腈终止反应。使用电喷雾离子源(ESI),以卡维地洛为内标,在多反应监测模式(MRM)下进行正离子扫描,分别测定各孵育体系中R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔的浓度。以孵育0 min时不同构型的普萘洛尔的质量浓度为参照,分别计算R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔在不同肝微粒体样品中的药物剩余百分比和体外代谢半衰期和固有清除率。  结果  普萘洛尔的线性范围为0.05~10.00 μg/mL,定量下限为0.05 μg/mL;日内、日间精密度的RSD%均小于13%。在4个种属的肝微粒体孵育体系中,R-(+)-普萘洛尔在大鼠肝微粒体中代谢快,在猴肝微粒体中次之,在犬和人肝微粒体中代谢慢,体外消除半衰期依次为大鼠 < 猴 < 犬 < 人;而S-(-)-普萘洛尔则是在大鼠和犬肝微粒体中代谢快,在猴和人肝微粒体中代谢慢,体外消除半衰期依次为大鼠 < 犬 < 猴 < 人。在大鼠、犬和猴肝微粒体中,R构型普萘洛尔的t1/2均大于S构型,CLint小于S构型,但在人肝微粒体中却刚好相反。采用单因素方差分析,R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔在4种肝微粒体中的体外代谢半衰期t1/2和固有清除率CLint均具有显著性差异(P < 0.05)。  结论  建立的HPLC-MS/MS法具有简单、快速、准确的特点,可用于肝微粒体中普萘洛尔对映体质量浓度的测定。不同构型的普萘洛尔在大鼠、犬、猴和人4种肝微粒体中的代谢稳定性有显著差异。
  • 普萘洛尔为第一代非选择性β-肾上腺素受体阻滞剂[1],有R和S 2种光学异构体。临床上使用的药物是外消旋体,但S构型药物的β受体阻滞作用强于R构型,是治疗心绞痛的主要对映体[2-3]。Peterson RN等[3-4]报道R构型的普萘洛尔在体外具有杀精效力,但R-(+)-普萘洛尔的β受体阻滞作用仅为外消旋体的1/50,对心血管系统的效应仅为外消旋体的1/100,具有开发成单一对映体药品的潜能。研究表明,在生物体内,R和S构型的普萘洛尔主要经细胞色素P450代谢,并存在着立体选择性差异[5-6]。不同类型的β受体阻滞剂的受体选择性不同,因此会发挥不同的作用[1],加之大多数药物都含有手性中心,其代谢考量应该更为全面。

    体外代谢研究可以减少体内因素的干扰,直接观察药物与酶的相互作用过程,具有操作简单便捷、经济和高效等特点[7-8],肝微粒体中含有大量细胞色素P450酶,是研究体外代谢最直接和有效的手段[9-10]。药物在肝微粒体中代谢,通过测定体外代谢的酶动力学参数,可以比较不同种属之间的代谢差异[11]

    本研究旨在建立高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定不同种属肝微粒体中普萘洛尔对映体浓度的方法,分别计算并比较普萘洛尔对映体在大鼠、犬、猴和人肝微粒体中的体外代谢半衰期和体外清除率,比较普萘洛尔不同对映体在不同种属肝微粒体中的代谢差异,为单一对映体药品以及相关药物的后续研究提供参考。

    岛津LCMS-8040三重四极杆液质联用仪(日本Shimadzu);十万分之一电子天平(Sartorius);高速离心机(湘仪H1650);涡旋混合仪(Scilogex);纯水仪(Milli-Q);移液枪(Eppendorf Research plus)。

    S-(-)-盐酸普萘洛尔和R-(+)-盐酸普萘洛尔(纯度≥98%,购于乐研)、盐酸普萘洛尔外消旋体(纯度≥98%,购于Adamas)、卡维地洛对照品(纯度≥99%,购于Adamas);甲醇、乙腈(色谱纯,购于Adamas);超纯水;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)(包括A液和B液),其中A液(批号:NRS(A)-21G001)的组成为:烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADP+)、6-磷酸葡萄糖,氯化镁;B液(批号:NRS(B)-20L001)的组成为:6-磷酸葡萄糖脱氢酶、柠檬酸钠;大鼠肝微粒体(批号:20I001),人肝微粒体(批号:MIC259939),猴肝微粒体(批号:21C001),犬肝微粒体(批号:21C001)均购自汇智泰康公司,质量浓度均为20 mg/mL;甲酸为分析纯。

    1.3.1   普萘洛尔对映体储备液及系列工作液的配制

    分别取R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔适量,精密称定,用甲醇溶解并定容,分别制得质量浓度为1 mg/mL的R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔储备液,将配制好的储备液密封后置于4 ℃冰箱中保存。R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔系列工作液可在使用前用甲醇逐级稀释储备液配制得到,同法配制得到普萘洛尔外消旋体溶液。

    1.3.2   内标储备液及内标溶液

    称取卡维地洛适量,精密称定,用乙腈溶解后定容,混匀后得浓度为1 mg/mL 的内标储备液,将配制好的储备液密封后置于4 ℃冰箱中保存。内标溶液则在使用前用乙腈稀释至1 μg/mL。

    1.4.1   色谱条件

    色谱柱:GL Sciences Inc. C18 (150 mm×4.6 mm,5 μm);保护柱:大连日普利C18 (10 mm×4.6 mm,5 μm );柱温:30℃;流动相:0.2%甲酸水溶液-甲醇,梯度洗脱(0~4 min:甲醇53%;4.01~5 min:甲醇46%;5.01~9 min:甲醇53%);流速:0.4 mL/min;采集时间:9 min;进样量:2 μL。

    1.4.2   质谱条件

    电离源:电喷雾离子源(ESI);在多反应监测模式(MRM)下进行正离子扫描;雾化器流量:3.0 L/min;干燥器流量:15 L/min;接口电压:3.5 kV;接口电流:0.3 μA;DL温度:250 ℃;加热块温度:400 ℃;转换打拿极电压:6.0 kV;检测器电压:1.88 kV;CID气:230 kPa;驻留时间:0.10 s。目标普萘洛尔的定量离子对为m/z 259.90→116.15 (碰撞能量:-18 eV),内标卡维地洛的定量离子对为m/z 406.90→100.00 (碰撞能量:-30 eV)。

    1.5.1   样品的孵育

    配制总体积为200 μL的孵育体系,包含0.1M磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH7.4) 181 μL,NADPH 12 μL(含A液10 μL和B液2 μL),现用现配,于冰浴上混合后,分别加入500 μg/mL的R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔工作液2 μL(甲醇的质量分数应低于1%),将以上体系放置在37 ℃的恒温水浴中5 min后加入5 μL肝微粒体即可启动反应[9-10]

    1.5.2   样品处理

    取“1.5.1”项下在不同时间点孵育完成的200 μL样品,加入“1.3.2”项下配制的含有1 μg/mL的卡维地洛的冰乙腈溶液终止反应,涡旋混匀1 min后,采用16 000 r/min 离心10 min,取上层清液过滤后注入HPLC-MS/MS进行分析。

    1.6.1   专属性

    将大鼠肝微粒体高温灭活后备用,按“1.5.1”项下分别制备以下样品:(1)不含普萘洛尔(待测物)和卡维地洛(内标)的空白对照孵育样品;(2)含普萘洛尔(待测物,使用外消旋体)和卡维地洛(内标)的样品;(3)大鼠肝微粒体孵育样品(孵育5 min)。以上样品经“1.5.2”项下处理后,按“1.4”项下分析。

    1.6.2   标准曲线与线性范围

    按“1.3.1”项下方法分别配制R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔系列工作液,分别量取2 μL上述系列工作液加入大鼠肝微粒体孵育体系中(大鼠肝微粒体使用高温灭活),按“1.5.1”项下方法配制,混匀后分别制得R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔质量浓度分别为0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、2.5、5、10 μg/mL的系列标准样品,按照“1.5.2”项下处理后按“1.4”项下的分析条件注入HPLC-MS/MS分析,记录峰面积。

    1.6.3   精密度与准确度

    按“1.6.2”项下方法分别配制R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔定量下限浓度(0.05 μg/mL)、低浓度(0.1 μg/mL)、中浓度(2 μg/mL)和高浓度(8 μg/mL)质控样品,每个浓度水平各5份,以上样品按照“1.5.2”项下处理后按“1.4”项下的分析条件注入HPLC-MS/MS分析。通过对每一分析批的每个浓度水平的质控样品(n = 5)进行分析,评价日内精密度;通过对3个分析批的每个浓度水平的质控样品(n = 15)连续测定3 d,评价日间精密度。将实际测量的浓度与理论浓度比较,考察准确度。

    1.6.4   提取回收率与基质效应

    (1)按“1.6.2”项下方法分别配制R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔低浓度(0.1 μg/mL)、中浓度(2 μg/mL)和高浓度(8 μg/mL)的质控样品,每个浓度水平各5份,以上样品按照“1.5.2”项下处理后按“1.4”项下的分析条件注入HPLC-MS/MS分析,将峰面积记录为A;(2)取高温灭活的大鼠肝微粒体中,按“1.5.1”项下配制样品,按“1.5.2”项下处理,随后分别加入R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔工作液,使体系最终的浓度与该项下(1)中的质控样品的浓度对应,按“1.4”项下的分析条件注入HPLC-MS/MS分析,将峰面积记录为B;(3)另用溶剂配制与该项下(1)中质控样品浓度对应的对照品溶液,按“1.4”项下的分析条件注入HPLC-MS/MS分析,将峰面积记录为C。以上样品的每个浓度水平均平行操作测定5次。提取回收率 = (A/B)×100%,基质效应 = (B/C)×100%。

    1.6.5   稳定性

    按“1.6.2”项下方法分别配制R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔低浓度(0.1 μg/mL)、中浓度(2 μg/mL)和高浓度(8 μg/mL)的质控样品,每个浓度水平各5份,按照“1.5.2”项下处理后按“1.4”项下的分析条件注入HPLC-MS/MS分析,考察质控样品放置在自动进样器内24 h和室温放置12 h的稳定性。

    1.7.1   代谢稳定性研究

    按“1.3.1”项下方法分别配制500 μg/mL的R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔工作液,取上述工作液2 μL,选择大鼠、犬、猴和人4种不同的肝微粒体,按“1.5.1”项下孵育。分别于孵育0、2、5、10、15、20、30、45、60、90、120 min,孵育完成后各加入400 μL“1.3.2”项下配制的含有1 μg/mL的卡维地洛的冰乙腈溶液终止反应,涡旋1 min,采用16 000 r/min 离心10 min,取上层清液过滤后注入HPLC-MS/MS,按“1.4”项下分析,计算目标物浓度。各种属的肝微粒体孵育体系均平行操作3次。

    1.7.2   体外半衰期(t1/2)和固有清除率(CLint)的计算

    以孵育时间作为横坐标,取各不同时间点的药物剩余百分比的自然对数作为纵坐标,作线性回归,得到回归方程。根据求得的线性回归方程的斜率k,分别依据公式t1/2 = 0.693/-k和CLint = 0.693×孵育液体积(mL)/[t1/2×肝微粒体质量(mg)]计算得CLint[12-13]计算t1/2和CLint

    1.7.3   统计学处理

    使用SPSS软件对R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔在不同种属肝微粒体中的t1/2和CLint的数据进行统计分析,组间比较采用单因素方差分析,P < 0.05为差异有统计学意义。

    2.1.1   专属性

    按照“1.6.1”项下操作,由色谱图可知,普萘洛尔(待测物)和卡维地洛(内标)的保留时间分别为4.75、5.76 min,目标和内标的色谱峰分离度良好,均不受空白基质的干扰,专属性较好,见图1

    图  1  典型MRM图
    A. 空白孵育样品;B:普萘洛尔 + 内标样品;C:肝微粒体孵育样品。
    Figure  1.  Typical MRM chromatograms
    2.1.2   标准曲线与线性范围

    按照“1.6.2”项下操作,分别以R-(+)-普萘洛尔/S-(-)-普萘洛尔的浓度为横坐标、R-(+)-普萘洛尔/S-(-)-普萘洛尔与卡维地洛峰面积之比为纵坐标,采用1/c加权法进行线性回归,得到的标准曲线分别如下:R-(+)-普萘洛尔 (y = 0.3955x + 0.0077,R2 = 0.9994),S-(-)-普萘洛尔 (y = 0.1988x + 0.0074,R2 = 0.9997)。R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔浓度的线性范围为0.05~10.00 μg/mL,定量下限为0.05 μg/mL。

    2.1.3   精密度与准确度

    按照“1.6.3”项下操作,结果见表1,定量下限浓度、低、中和高浓度质控样品的日内和日间RSD均小于13%,符合要求[14]

    表  1  精密度与准确度结果($\bar x \pm s $/%)
    Table  1.  Precision and accuracy results ($\bar x \pm s $/%)
    理论浓度(μg/mL)目标物日内精密度(n = 5)日间精密度(n = 15)准确度(n = 5)
    实测浓度RSD实测浓度RSD
    0.05 R-(+)-普萘洛尔 0.055 ± 0.003 5.88 0.055 ± 0.003 5.90 108.85 ± 6.41
    S-(-)-普萘洛尔 0.043 ± 0.002 3.80 0.047 ± 0.006 12.09 86.59 ± 2.95
    0.1 R-(+)-普萘洛尔 0.106 ± 0.005 4.87 0.099 ± 0.009 8.72 106.20 ± 5.21
    S-(-)-普萘洛尔 0.095 ± 0.005 5.80 0.097 ± 0.008 7.76 94.94 ± 0.12
    2 R-(+)-普萘洛尔 1.987 ± 0.140 7.06 1.833 ± 0.140 7.75 99.34 ± 7.02
    S-(-)-普萘洛尔 1.842 ± 0.060 3.10 1.889 ± 0.130 6.72 92.08 ± 2.87
    8 R-(+)-普萘洛尔 7.600 ± 0.310 4.14 7.179 ± 0.360 5.07 94.99 ± 3.93
    S-(-)-普萘洛尔 7.913 ± 0.270 3.36 7.700 ± 0.270 3.53 98.91 ± 3.33
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    2.1.4   提取回收率与基质效应

    按照“1.6.4”项下操作,结果见表2,R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔低、中、高质量浓度质控样品的提取回收率和基质效应均符合要求[14]

    表  2  提取回收率与基质效应结果(%)
    Table  2.  Extraction recovery and matrix effect results(%)
    理论浓度(μg/mL)目标物提取回收率 (n = 5)基质效应 (n = 5)
    $ (\overline{x}\pm s) $RSD$ (\overline{x}\pm s) $RSD
    0.1 R-(+)-普萘洛尔 104.45 ± 7.01 6.71 102.66 ± 3.70 3.60
    S-(-)-普萘洛尔 105.60 ± 4.45 4.22 106.02 ± 3.75 3.54
    2 R-(+)-普萘洛尔 100.91 ± 5.62 5.57 107.92 ± 3.86 3.57
    S-(-)-普萘洛尔 98.31 ± 4.79 4.87 106.52 ± 4.12 3.87
    8 R-(+)-普萘洛尔 92.18 ± 5.32 5.77 112.51 ± 1.74 1.54
    S-(-)-普萘洛尔 102.92 ± 2.14 2.08 100.30 ± 2.50 2.49
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    2.1.5   稳定性

    按照“1.6.5”项下操作,结果见表3,各质控样品实测浓度的RSD均小于10%,符合要求[14],稳定性良好。

    表  3  稳定性试验结果($\bar x \pm s $/%)
    Table  3.  Stability test results ($ \bar x \pm s $/%)
    理论浓度(μg/mL)目标物进样器放置24 h室温放置12 h
    实测质量浓度(n = 5)RSD实测质量浓度 (n = 5)RSD
    0.1 R-(+)-普萘洛尔 0.110 ± 0.003 3.18 0.111 ± 0.003 3.08
    S-(-)-普萘洛尔 0.111 ± 0.002 1.63 0.113 ± 0.002 1.72
    2 R-(+)-普萘洛尔 2.071 ± 0.160 7.76 1.890 ± 0.150 8.04
    S-(-)-普萘洛尔 2.271 ± 0.010 0.58 2.250 ± 0.037 1.63
    8 R-(+)-普萘洛尔 7.882 ± 0.200 2.49 7.436 ± 0.282 3.80
    S-(-)-普萘洛尔 8.846 ± 0.120 1.31 8.907 ± 0.210 2.33
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    2.2.1   代谢稳定性研究

    根据“1.7.1”项下方法,以孵育0 min时R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔的浓度为参照,其他时间点浓度与0 min时浓度的比值(药物剩余百分比)作为纵坐标,时间为横坐标。用Origin软件绘制R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔在4种肝微粒体孵育体系中的孵育曲线,见图2

    图  2  普萘洛尔不同对映体在不同种属肝微粒体中的孵育曲线
    A:大鼠肝微粒体;B:犬肝微粒体;C:猴肝微粒体;D:人肝微粒体。
    Figure  2.  Incubation curves of different enantiomers of propranolol in liver microsomes of different species

    图2可见,在大鼠、犬、猴和人不同种属的肝微粒体中,底物消除的速度不一样。在大鼠和犬肝微粒体中,S构型的普萘洛尔降解速率快于R构型;在猴肝微粒体中,两对映体降解速率相差不大;在人肝微粒体中,则是R构型快于S构型。

    2.2.2   体外半衰期(t1/2)和固有清除率(CLint)的计算

    根据“1.7.2和1.7.3”项下方法,分别计算t1/2和CLint,相应的计算结果见表4。结果显示,在大鼠、犬和猴肝微粒体中,R构型的t1/2均大于S构型,CLint小于S构型,但在人肝微粒体中却刚好相反。R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔在大鼠、犬和猴肝微粒体中的t1/2均显著短于犬和人肝微粒体,CLint均显著高于犬和人肝微粒体。R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔在4种肝微粒体中的体外代谢半衰期t1/2和固有清除率CLint均具有显著性差异(P < 0.05),见表4

    表  4  R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔在不同肝微粒体中的回归方程、t1/2和CLint
    Table  4.  Regression equation,t1/2 and CLint of R-(+)- propranolol and S-(-)- propranolol in different liver microsomes
    肝微粒体目标物回归方程R2t1/2/minCLint/mL·min−1·mg−1
    大鼠 R-(+)-普萘洛尔 y = −0.0117x−0.08 0.9777 59.23* 0.023*
    S-(-)-普萘洛尔 y = −0.0153x−0.0006 0.9359 45.00# 0.031#
    R-(+)-普萘洛尔 y = −0.0063x−0.141 0.8946 111.77* 0.012*
    S-(-)-普萘洛尔 y = −0.014x +0.0021 0.9885 49.50# 0.028#
    R-(+)-普萘洛尔 y = −0.0086x−0.0537 0.9559 80.58* 0.017*
    S-(-)-普萘洛尔 y = −0.0089x + 0.0066 0.9648 77.87# 0.018#
    R-(+)-普萘洛尔 y = −0.0037x−0.076 0.9117 187.30 0.007
    S-(-)-普萘洛尔 y = −0.0026x−0.0677 0.9072 266.54 0.005
      注:R-(+)-普萘洛尔:与人肝微粒体比较,*P < 0.05;S-(-)-普萘洛尔:与人肝微粒体比较,#P < 0.05。
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    在4个种属的肝微粒体孵育体系中,R-(+)-普萘洛尔在大鼠肝微粒体中代谢快,在猴肝微粒体中次之,t1/2分别为59.23 min和80.58 min,在犬和人肝微粒体中代谢慢,t1/2分别为111.77 min和187.30 min,体外消除半衰期依次为大鼠 < 猴 < 犬 < 人;而S-(-)-普萘洛尔则是在大鼠和犬肝微粒体中代谢快,t1/2分别为45 min和49.5 min,在猴和人肝微粒体中代谢慢,t1/2分别为77.87 min和266.54 min,体外消除半衰期依次为大鼠 < 犬 < 猴 < 人。

    在大鼠、犬和猴肝微粒体中,R构型普萘洛尔的t1/2均大于S构型,CLint小于S构型,但在人肝微粒体中却刚好相反。采用单因素方差分析,R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔在4种肝微粒体中的体外代谢半衰期t1/2和固有清除率CLint均具有显著性差异(P < 0.05),说明普萘洛尔不同对映体在大鼠、犬、猴和人之间的代谢存在种属差异。不同对映体药物应充分考虑种属代谢差异,该研究为单一构型对映体药品以及相关药物的后续研究提供参考。

  • 图  1  典型MRM图

    A. 空白孵育样品;B:普萘洛尔 + 内标样品;C:肝微粒体孵育样品。

    Figure  1.  Typical MRM chromatograms

    图  2  普萘洛尔不同对映体在不同种属肝微粒体中的孵育曲线

    A:大鼠肝微粒体;B:犬肝微粒体;C:猴肝微粒体;D:人肝微粒体。

    Figure  2.  Incubation curves of different enantiomers of propranolol in liver microsomes of different species

    表  1  精密度与准确度结果($\bar x \pm s $/%)

    Table  1.   Precision and accuracy results ($\bar x \pm s $/%)

    理论浓度(μg/mL)目标物日内精密度(n = 5)日间精密度(n = 15)准确度(n = 5)
    实测浓度RSD实测浓度RSD
    0.05 R-(+)-普萘洛尔 0.055 ± 0.003 5.88 0.055 ± 0.003 5.90 108.85 ± 6.41
    S-(-)-普萘洛尔 0.043 ± 0.002 3.80 0.047 ± 0.006 12.09 86.59 ± 2.95
    0.1 R-(+)-普萘洛尔 0.106 ± 0.005 4.87 0.099 ± 0.009 8.72 106.20 ± 5.21
    S-(-)-普萘洛尔 0.095 ± 0.005 5.80 0.097 ± 0.008 7.76 94.94 ± 0.12
    2 R-(+)-普萘洛尔 1.987 ± 0.140 7.06 1.833 ± 0.140 7.75 99.34 ± 7.02
    S-(-)-普萘洛尔 1.842 ± 0.060 3.10 1.889 ± 0.130 6.72 92.08 ± 2.87
    8 R-(+)-普萘洛尔 7.600 ± 0.310 4.14 7.179 ± 0.360 5.07 94.99 ± 3.93
    S-(-)-普萘洛尔 7.913 ± 0.270 3.36 7.700 ± 0.270 3.53 98.91 ± 3.33
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    表  2  提取回收率与基质效应结果(%)

    Table  2.   Extraction recovery and matrix effect results(%)

    理论浓度(μg/mL)目标物提取回收率 (n = 5)基质效应 (n = 5)
    $ (\overline{x}\pm s) $RSD$ (\overline{x}\pm s) $RSD
    0.1 R-(+)-普萘洛尔 104.45 ± 7.01 6.71 102.66 ± 3.70 3.60
    S-(-)-普萘洛尔 105.60 ± 4.45 4.22 106.02 ± 3.75 3.54
    2 R-(+)-普萘洛尔 100.91 ± 5.62 5.57 107.92 ± 3.86 3.57
    S-(-)-普萘洛尔 98.31 ± 4.79 4.87 106.52 ± 4.12 3.87
    8 R-(+)-普萘洛尔 92.18 ± 5.32 5.77 112.51 ± 1.74 1.54
    S-(-)-普萘洛尔 102.92 ± 2.14 2.08 100.30 ± 2.50 2.49
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    表  3  稳定性试验结果($\bar x \pm s $/%)

    Table  3.   Stability test results ($ \bar x \pm s $/%)

    理论浓度(μg/mL)目标物进样器放置24 h室温放置12 h
    实测质量浓度(n = 5)RSD实测质量浓度 (n = 5)RSD
    0.1 R-(+)-普萘洛尔 0.110 ± 0.003 3.18 0.111 ± 0.003 3.08
    S-(-)-普萘洛尔 0.111 ± 0.002 1.63 0.113 ± 0.002 1.72
    2 R-(+)-普萘洛尔 2.071 ± 0.160 7.76 1.890 ± 0.150 8.04
    S-(-)-普萘洛尔 2.271 ± 0.010 0.58 2.250 ± 0.037 1.63
    8 R-(+)-普萘洛尔 7.882 ± 0.200 2.49 7.436 ± 0.282 3.80
    S-(-)-普萘洛尔 8.846 ± 0.120 1.31 8.907 ± 0.210 2.33
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    表  4  R-(+)-普萘洛尔和S-(-)-普萘洛尔在不同肝微粒体中的回归方程、t1/2和CLint

    Table  4.   Regression equation,t1/2 and CLint of R-(+)- propranolol and S-(-)- propranolol in different liver microsomes

    肝微粒体目标物回归方程R2t1/2/minCLint/mL·min−1·mg−1
    大鼠 R-(+)-普萘洛尔 y = −0.0117x−0.08 0.9777 59.23* 0.023*
    S-(-)-普萘洛尔 y = −0.0153x−0.0006 0.9359 45.00# 0.031#
    R-(+)-普萘洛尔 y = −0.0063x−0.141 0.8946 111.77* 0.012*
    S-(-)-普萘洛尔 y = −0.014x +0.0021 0.9885 49.50# 0.028#
    R-(+)-普萘洛尔 y = −0.0086x−0.0537 0.9559 80.58* 0.017*
    S-(-)-普萘洛尔 y = −0.0089x + 0.0066 0.9648 77.87# 0.018#
    R-(+)-普萘洛尔 y = −0.0037x−0.076 0.9117 187.30 0.007
    S-(-)-普萘洛尔 y = −0.0026x−0.0677 0.9072 266.54 0.005
      注:R-(+)-普萘洛尔:与人肝微粒体比较,*P < 0.05;S-(-)-普萘洛尔:与人肝微粒体比较,#P < 0.05。
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-07-01
  • 网络出版日期:  2023-03-01
  • 刊出日期:  2023-03-25

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