Identification of Papaveraceae Based on Chloroplast DNA matK+rbcL+ trnH-psbA
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摘要:
目的 利用DNA条形码技术探索罂粟的鉴定方法，寻找可靠的DNA条形码序列对罂粟属植物进行种内和种间的鉴别。 方法 采用5种不同种类的虞美人和花菱草作为罂粟鉴别的种内植物、种间植物。利用叶绿体基因组matK、rbcL、trnH-psbA和核糖体基因组ITS2、ITS4、ITS5引物对提取的DNA进行扩增，并双向测序拼接，利用MEGA.X.对序列进行分析比对，计算种内、种间遗传距离，同时使用该软件构建NJ系统发育树。 结果 将测序结果录入Genbank中进行比对分析，结果显示单一DNA条形码序列无法有效区分虞美人与罂粟。通过Genbank下载数据使用matK+rbcL+trnH-psbA组合条形码构建系统发育树成功，对罂粟和虞美人样本测序结果进行验证。经验证，matK+rbcL+trnH-psbA组合条形码构建NJ发育树成功，能有效区分虞美人和罂粟。 结论 matK+rbcL+trnH-psbA作为组合DNA条形码使用，可以有效鉴别罂粟属内植物。 -
关键词:
- DNA条形码 /
- matK+rbcL+trnH-psbA /
- 分子鉴定 /
- 罂粟
Abstract:Objective To explore the identification method of Papaver with the use of DNA barcoding technology and find reliable DNA barcoding sequence for intraspecific and interspecific identification of Papaver. Methods Five different species of Papaver rhoeas and Eschscholtzia californica Cham were used as intraspecific and interspecific plants for the identification of Papaver. The extracted DNA was amplified using primers matK, rbcL, trnH-psbA from chloroplast genomes and ITS2, ITS4, ITS5 from ribosomal genomes, and then bidirectional sequencing and splicing were performed using MEGA X. Sequences were analyzed and aligned, intraspecific and interspecific genetic distances were calculated, and N-J phylogenetic trees were constructed using the software. Results The sequencing results, which were entered into Genbank for comparative analysis, showed that a single DNA barcode sequence was not effective in distinguishing between Papaver somniferum and Papaver rhoeas. At the same time, a phylogenetic tree was successfully constructed using matK+rbcL+trnH-psbA combined barcode through Genbank download data, and the sequencing results of Papaver samples in this study were verified by this method. The combination of matK+rbcL+trnH-psbA barcode successfully constructed the N-J tree, which could effectively distinguish between Papaver somniferum and Papaver rhoeas in this study. Conclusion matK+rbcL+ trnH-psbA can be used as a combined DNA barcode for the identification of Papaver. -
Key words:
- DNA barcoding /
- matK+rbcL+trnH-psbA /
- Molecular identification /
- Papaveraceae
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随着影像学学科的飞速发展，通过对影像技术的灵活运用可以对骨骼表面软骨进行更好的观察和测量，其中超声与MRI可对软骨进行测量[1-2]。二者无辐射，安全无害，但大量影像循证医学研究表明MRI在真实软骨测量准确性方面好于超声，是间接观察软骨的最佳选择[3]。随着MRI检查手段和系统的不断升级，可以很好的利用其对关节软骨损伤和病变检测，1.5T磁共振T1WI TSE成像技术可以测量出真实的软骨厚度[4]。对于踝关节损伤患者，除了考虑骨折和韧带损伤，软骨的损伤也逐渐得到骨科医生的关注，许多研究表明软骨厚度通常小于2 mm，然而软骨厚度也会因地方、性别、和个体的不同而表现出很大的差异[5]。因此对距骨软骨厚度测量将帮助骨科医生预测需要修复的软骨量，并以合理的成本进行治疗，而不会过度侵犯患者，在距骨解剖假体的设计过程中也要考虑软骨存在[6-8]。Giannicola等[9]研究发现软骨厚度分布与骨骼长短、粗细均不相关，即我们不能简单从骨骼CT和X光片显像中预测出软骨厚度。当前国内尚未有对距骨关节面软骨厚度测量的相关文献报道，因此应用MRI测量成人正常距骨表面软骨厚度，构建国内成人正常距骨表面软骨厚度参数势在必行。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2021年01月至2021年11月在云南省中医医院MRI室行检查的踝关节无关节炎、无外伤史的成人100例，其中男性、女性各50例，年龄18～60岁，中位年龄37岁，签署知情同意告知书，对踝关节进行扫描，如实记录体重、身高与年龄。已通过医院伦理委员会审批。
1.2 仪器与方法
使用荷兰飞利浦1.5T磁共振仪。扫描线圈：SENSE-FLEX-M-COIL，C1-COIL，C3-COIL，T/R HEAD COIL KNEE/FOOT COIL。扫描序列：冠状位T1WI TSE ，矢状位T2WI TSE，矩阵512×512，FOV 16 cm，层厚为3 mm，层距为1 mm。扫描体位：取仰卧位，足部先进，沙袋固定足部于中立位。
1.3 测量方法
选择在冠状位通过距骨关节面中垂线的矢状位图像作为测量图像，以胫距关节面前、中、后3个点作为测量点，各测量点垂直于相应的关节面，测量软骨厚度为关节软骨低信号的垂直高度，得出软骨厚度a、b、c（图1）。所有图片均放大3倍，由3名骨科医师独立分别完成3个测量点测量，每个点取3者所得平均值作为最终结果，测量精度为0.01 mm。
软骨测量点的选择：选择在冠状位通过距骨关节面中垂线的矢状位图像作为测量图像，以胫距关节面前、中、后3个点作为测量点，各测量点垂直于相应的关节面，测量软骨厚度为关节软骨低信号的垂直高度，得出软骨厚度a、b、c。
1.4 统计学处理
采用SPSS25.0统计学软件包进行统计学分析，基本描述正态分布计量资料采用均数据±标准差表示，正态分布计量资料两组间比较采用两独立样本t检验，相关性分析采用Pearson相关性分析，P < 0.05表示差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 性别与前、中、后距骨关节面软骨厚度的关系
男性前、中、后距骨关节面软骨厚度分别为（1.00±0.18）mm、（1.40±0.21）mm、（0.87±0.18）mm；女性前、中、后距骨关节面软骨厚度分别为（0.96±0.19）mm、（1.29±0.20）mm、（0.86±0.15）mm；男性和女性距骨前、后关节软骨面厚度差异无统计学意义（P > 0.05），距骨中关节面软骨厚度，差异有统计学意义（P < 0.05），见表1。
表 1 男、女性各指标比较Table 1. Comparison of male and female indicators指标 男性 女性 t P a（mm） 1.00 ± 0.18 0.96 ± 0.19 1.342 0.183 b（mm） 1.40 ± 0.21 1.29 ± 0.20 2.715 0.008* c（mm） 0.87 ± 0.18 0.86 ± 0.15 0.089 0.930 年龄（岁） 37.00 ± 11.96 41.42 ± 14.10 −1.680 0.096 身高（m） 1.70 ± 0.06 1.64 ± 0.06 5.194 < 0.001* 体重（Kg） 67.61 ± 6.29 58.04 ± 4.47 8.707 < 0.001* a：前关节面软骨厚度；b：中关节面软骨厚度；c：后关节面软骨厚度。*P < 0.05。 2.2 身高、体重、年龄与距骨前、中、后关节面软骨厚度的关系
男性与女性年龄差异无统计学意义（P > 0.05），男性身高、体重均大于女性，差异有统计学意义（P < 0.05），考虑为男女差异。经Pearson相关性分析男、女性身高、体重、年龄与距骨前、中、后关节面软骨厚度均无相关性（P > 0.05），见表2、表3、表4。
表 2 身高与各指标相关性分析Table 2. Correlation analysis between height and various indexes指标 r P a（mm） 0.11 0.297 b（mm） 0.05 0.600 c（mm） −0.03 0.764 a：前关节面软骨厚度；b：中关节面软骨厚度；c：后关节面软骨厚度。 表 3 体重与各指标相关性分析Table 3. Correlation analysis between body weight and various indexes指标 r P a（mm） 0.08 0.429 b（mm） 0.17 0.099 c（mm） 0.06 0.588 a：前关节面软骨厚度；b：中关节面软骨厚度；c：后关节面软骨厚度。 表 4 年龄与各指标相关性分析Table 4. Correlation analysis between age and various indicators指标 r P a（mm） −0.14 0.182 b（mm） −0.09 0.389 c（mm） −0.15 0.131 a：前关节面软骨厚度；b：中关节面软骨厚度；c：后关节面软骨厚度。 3. 讨论
在磁共振成像中使用各同向性体素进行厚度测量，来自各同向性体素的MRI数据结果表明，在关节间隙宽度和软骨厚度的测量值的位置准确测量软骨厚度是体素大小的2倍或更大是科学合理的，因此本研究所有测量图像均放大3倍；通过与3个模型、5个正常尸体髋部标本和9个骨关节炎患者的实验结果进行比较，验证了该模拟方法的有效性。MRI提供了软骨和软骨下骨厚度的良好表征，支持其在骨软骨结构和改变的研究和临床诊断中的应用[10-11]，也正是如此为本研究MRI测量软骨厚度提供了研究基础。
虽然超声与MRI可对软骨进行测量，二者无辐射，安全无害，超声可以作为评估股骨中、后股骨区域相对软骨厚度的可行临床工具。然而，在软骨厚度 < 2 mm时，超声在相关测量值之间的绝对一致性较差，由于更多的基于MRI测量，超声测量的绝对有效性受到同行质疑[12]。而CT需要通过造影技术对软骨进行测量，有创且辐射大，不适于对人体进行研究，但动物研究可考虑CT造影技术；目前来说，相对于超声、CT测量软骨厚度，MRI测量更为准确、安全、敏感，因此本研究选择了MRI测量。
近年来关节软骨损伤越来越受到骨科医生所关注，距骨软骨面损伤是踝关节最常见的软骨损伤[13]，主要表现为踝部肿痛、关节异物感、活动受限，多见于青壮年男性。X线片是踝关节扭伤后需拍摄的常规影像学检查，以前是距骨软骨面损伤的主要诊断依据，但X线片会忽略50%以上的软骨病变。MRI敏感度高，可清晰显示距骨软骨病变、骨髓水肿范围，是软骨损伤最佳无创检查[14]；关节软骨损伤的患者日益受到重视，准确的诊断软骨损伤显得更为重要，而X线片误诊率较高，并不利于疾病的诊疗，因此目前MRI检查更有意义。当然，本研究只是起了一个抛砖引玉的作用，而且由于各方面的原因存在一定的局限性，本研究纳入的样本量有限，研究的还不够深入，由于选择健康志愿者进行检查成本高，实施难度大，本研究对象根据病情需要选择踝关节无关节炎、无外伤史的门诊就诊成人，节约成本，也能代表正常距骨软骨厚度，下一步将对运动前后、踝关节损伤后距骨软骨厚度的变化进行探索，希望更多的学者加入进一步更加全面的研究。
通过MRI对距骨表面软骨厚度测量研究发现，成人后距骨表面软骨厚度趋于稳定，与身高、体重、年龄均无相关性，负重区距骨软骨厚度明显大于非负重区，且负重区软骨厚度男性大于女性。展望未来，对于这一现象相信随着影像学学科的不断前进，笔者能更好的对不同区域的软骨进行更深入的研究。
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图 1 ITS2、ITS4、ITS5、rbcL、psbA-trnH、matK 序列扩增产物电泳图
Figure 1. Electrophoretogram of ITS2\ITS4\ITS5\rbcL\psbA-trnH\matK gene sequence amplification products
图 3 Genbank中下载的数据进行psbA-trnH+matK+rbcL联合分析构建N-J系统发育树
Figure 3. The data downloaded from Genbank were analyzed by PSBA-TRNH +matK+rbcL to construct the N-J phylogenetic tree
图 4 样本rbcL、psbA-trnH、matK 序列种内、种间平均遗传距离分布图
Figure 4. The distribution of interspecific and intraspecific genetic distancebased on psbA-trnH+matK+rbcL sequences
图 5 基于rbcL+psbA-trnH+matK 序列联合构建的 NJ 系统发育树
Figure 5. NJ phylogenetic tree based on psbA-trnH+matK+rbcL sequences
图 2 ITS序列上大量的碱基突变与缺失
Figure 2. A large number of base mutations and deletions in ITS sequence
表 1 供试样本编号与分组
Table 1. Serial numbers of laboratory samples and section
简称 名称 拉丁学名 数量 种属 Genbank中是否有数据 分组 PSL 云南罂粟 Papaver somniferum.L 25株 罂粟属 有 入库比对组 PSL-1 新疆罂粟 Papaver somniferum.L 20株 罂粟属 有 入库比对组 POL 东方虞美人 Papaver Oriental.L 15株 罂粟属 有 入库比对组 PAM 沙地虞美人 Papaver ammophilum 15株 罂粟属 无 待鉴定组 PAL 阿尔卑斯虞美人 Papaver alpinum 15株 罂粟属 有 入库比对组 PCY 塞浦路斯虞美人 Papaver cyprium 15株 罂粟属 无 待鉴定组 PNU 冰岛虞美人 Papaver nudicaule 15株 罂粟属 有 入库比对组 ECC 加州虞美人 Eschscholtzia californica Cham 10株 花菱草属 有 入库比对组 
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表 2 扩增引物序列的设计
Table 2. The sequences of primer for amplification
引物名称 序列 Tm值（℃） 参考Genbank ID rbcL-F ATGTCACCACAAACAGAAACTAAAGC 58.16 DQ912886 rbcL-R TCGCATGTACCTGCAGTTGC 59.09 matK-F CGATCTATTCATTCAATATTTC 48.90 JF626525 matK-R TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT 58.65 ITS4（新设计） GCCTCCGCTTATTGATATCTGC 56.33 KF022360 ITS5（新设计） GGAAGTAAAAGTCGTAACAACAGG 54.28 ITS4-1（查文献） TCCTCCGCTTATTGATATGC 54.53 MT707523 ITS5-1（查文献） GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 53.29 ITS2-F ATGCGATACTTGGTGTGAAT 52.99 MH711392 ITS2-R GACGCTTCTCCAGACTACAAT 56.26 PSBA-TRNH-F GTTATGCATGAACGTAATGCTC 54.84 AY328311.1 PSBA-TRNH-R CGCGCATGGTGGATTCACAATCC 62.24
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表 3 罂粟属植物的BLAST比对结果
Table 3. BLAST comparison results of Papaver somniferum and its adulterants
样本名称 BLAST 最佳匹配物种 最高评分 基因匹配度（%） 数据Genbank编号 PSL-ITS4
PSL-ITS5Papaver rhoeas 虞美人 1292 100 DQ912886 Papaver somniferum 罂粟 1352 100 DQ912880 PAL-ITS4
PSL-ITS5Papaver rhoeas 虞美人 1214 100 AY328311 Papaver nudicaule 野罂粟 1273 100 KF022360 PSL-matK Papaver rhoeas 虞美人 1447 100 MW411801 Papaver somniferum 罂粟 1474 100 MT707522 PAL-matK Papaver nudicaule 野罂粟 1476 100 MW411801 Stylophorum lasiocarpum 金罂粟 1473 100 MW232434 PAM-matK Papaver rhoeas 虞美人 1467 100 NC037831 Papaver somniferum 罂粟 1439 100 MK820043 PYC-matK Papaver rhoeas 罂粟花 1482 100 MF943221 Papaver triniifolium 三叶罂粟 1459 100 MT707533 ECC-matK Eschscholzia californica 加州花菱草 1489 100 Mk281585
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