Identification of Papaveraceae Based on Chloroplast DNA matK+rbcL+ trnH-psbA
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摘要:
目的 利用DNA条形码技术探索罂粟的鉴定方法，寻找可靠的DNA条形码序列对罂粟属植物进行种内和种间的鉴别。 方法 采用5种不同种类的虞美人和花菱草作为罂粟鉴别的种内植物、种间植物。利用叶绿体基因组matK、rbcL、trnH-psbA和核糖体基因组ITS2、ITS4、ITS5引物对提取的DNA进行扩增，并双向测序拼接，利用MEGA.X.对序列进行分析比对，计算种内、种间遗传距离，同时使用该软件构建NJ系统发育树。 结果 将测序结果录入Genbank中进行比对分析，结果显示单一DNA条形码序列无法有效区分虞美人与罂粟。通过Genbank下载数据使用matK+rbcL+trnH-psbA组合条形码构建系统发育树成功，对罂粟和虞美人样本测序结果进行验证。经验证，matK+rbcL+trnH-psbA组合条形码构建NJ发育树成功，能有效区分虞美人和罂粟。 结论 matK+rbcL+trnH-psbA作为组合DNA条形码使用，可以有效鉴别罂粟属内植物。 -
关键词:
- DNA条形码 /
- matK+rbcL+trnH-psbA /
- 分子鉴定 /
- 罂粟
Abstract:Objective To explore the identification method of Papaver with the use of DNA barcoding technology and find reliable DNA barcoding sequence for intraspecific and interspecific identification of Papaver. Methods Five different species of Papaver rhoeas and Eschscholtzia californica Cham were used as intraspecific and interspecific plants for the identification of Papaver. The extracted DNA was amplified using primers matK, rbcL, trnH-psbA from chloroplast genomes and ITS2, ITS4, ITS5 from ribosomal genomes, and then bidirectional sequencing and splicing were performed using MEGA X. Sequences were analyzed and aligned, intraspecific and interspecific genetic distances were calculated, and N-J phylogenetic trees were constructed using the software. Results The sequencing results, which were entered into Genbank for comparative analysis, showed that a single DNA barcode sequence was not effective in distinguishing between Papaver somniferum and Papaver rhoeas. At the same time, a phylogenetic tree was successfully constructed using matK+rbcL+trnH-psbA combined barcode through Genbank download data, and the sequencing results of Papaver samples in this study were verified by this method. The combination of matK+rbcL+trnH-psbA barcode successfully constructed the N-J tree, which could effectively distinguish between Papaver somniferum and Papaver rhoeas in this study. Conclusion matK+rbcL+ trnH-psbA can be used as a combined DNA barcode for the identification of Papaver. -
Key words:
- DNA barcoding /
- matK+rbcL+trnH-psbA /
- Molecular identification /
- Papaveraceae
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图 1 ITS2、ITS4、ITS5、rbcL、psbA-trnH、matK 序列扩增产物电泳图
Figure 1. Electrophoretogram of ITS2\ITS4\ITS5\rbcL\psbA-trnH\matK gene sequence amplification products
图 3 Genbank中下载的数据进行psbA-trnH+matK+rbcL联合分析构建N-J系统发育树
Figure 3. The data downloaded from Genbank were analyzed by PSBA-TRNH +matK+rbcL to construct the N-J phylogenetic tree
图 4 样本rbcL、psbA-trnH、matK 序列种内、种间平均遗传距离分布图
Figure 4. The distribution of interspecific and intraspecific genetic distancebased on psbA-trnH+matK+rbcL sequences
图 5 基于rbcL+psbA-trnH+matK 序列联合构建的 NJ 系统发育树
Figure 5. NJ phylogenetic tree based on psbA-trnH+matK+rbcL sequences
图 2 ITS序列上大量的碱基突变与缺失
Figure 2. A large number of base mutations and deletions in ITS sequence
表 1 供试样本编号与分组
Table 1. Serial numbers of laboratory samples and section
简称 名称 拉丁学名 数量 种属 Genbank中是否有数据 分组 PSL 云南罂粟 Papaver somniferum.L 25株 罂粟属 有 入库比对组 PSL-1 新疆罂粟 Papaver somniferum.L 20株 罂粟属 有 入库比对组 POL 东方虞美人 Papaver Oriental.L 15株 罂粟属 有 入库比对组 PAM 沙地虞美人 Papaver ammophilum 15株 罂粟属 无 待鉴定组 PAL 阿尔卑斯虞美人 Papaver alpinum 15株 罂粟属 有 入库比对组 PCY 塞浦路斯虞美人 Papaver cyprium 15株 罂粟属 无 待鉴定组 PNU 冰岛虞美人 Papaver nudicaule 15株 罂粟属 有 入库比对组 ECC 加州虞美人 Eschscholtzia californica Cham 10株 花菱草属 有 入库比对组 
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表 2 扩增引物序列的设计
Table 2. The sequences of primer for amplification
引物名称 序列 Tm值（℃） 参考Genbank ID rbcL-F ATGTCACCACAAACAGAAACTAAAGC 58.16 DQ912886 rbcL-R TCGCATGTACCTGCAGTTGC 59.09 matK-F CGATCTATTCATTCAATATTTC 48.90 JF626525 matK-R TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT 58.65 ITS4（新设计） GCCTCCGCTTATTGATATCTGC 56.33 KF022360 ITS5（新设计） GGAAGTAAAAGTCGTAACAACAGG 54.28 ITS4-1（查文献） TCCTCCGCTTATTGATATGC 54.53 MT707523 ITS5-1（查文献） GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 53.29 ITS2-F ATGCGATACTTGGTGTGAAT 52.99 MH711392 ITS2-R GACGCTTCTCCAGACTACAAT 56.26 PSBA-TRNH-F GTTATGCATGAACGTAATGCTC 54.84 AY328311.1 PSBA-TRNH-R CGCGCATGGTGGATTCACAATCC 62.24
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表 3 罂粟属植物的BLAST比对结果
Table 3. BLAST comparison results of Papaver somniferum and its adulterants
样本名称 BLAST 最佳匹配物种 最高评分 基因匹配度（%） 数据Genbank编号 PSL-ITS4
PSL-ITS5Papaver rhoeas 虞美人 1292 100 DQ912886 Papaver somniferum 罂粟 1352 100 DQ912880 PAL-ITS4
PSL-ITS5Papaver rhoeas 虞美人 1214 100 AY328311 Papaver nudicaule 野罂粟 1273 100 KF022360 PSL-matK Papaver rhoeas 虞美人 1447 100 MW411801 Papaver somniferum 罂粟 1474 100 MT707522 PAL-matK Papaver nudicaule 野罂粟 1476 100 MW411801 Stylophorum lasiocarpum 金罂粟 1473 100 MW232434 PAM-matK Papaver rhoeas 虞美人 1467 100 NC037831 Papaver somniferum 罂粟 1439 100 MK820043 PYC-matK Papaver rhoeas 罂粟花 1482 100 MF943221 Papaver triniifolium 三叶罂粟 1459 100 MT707533 ECC-matK Eschscholzia californica 加州花菱草 1489 100 Mk281585
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