Effect of Norathyriol on the Epithelial-mesenchymal Transition of HK-2 Cells Induced by TGF-β1
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摘要:
目的 研究芒果苷元对TGF-β1诱导的HK-2细胞EMT的影响。 方法 MTT法检测各浓度芒果苷元对HK-2细胞活力的影响;用TGF-β1诱导HK-2细胞成EMT模型,并给以芒果苷元干预,在TGF-β1诱导24 h时显微镜下拍照记录细胞形态变化,划痕实验法检测细胞迁移能力,Transwell法检测细胞侵袭能力,Western blot法检测纤连蛋白(fibronectin,FN)和Ⅰ型胶原(collagen type Ⅰ,Col Ⅰ)蛋白表达水平。 结果 (1)芒果苷元(10-9~10-5 mol/L)浓度下HK-2细胞活力均无明显变化(P > 0.05);(2)与正常组相比,模型组细胞形态变长变梭,迁移和侵袭能力显著增强( P < 0.05,0.01),FN和ColⅠ蛋白表达水平显著上调( P < 0.05,0.01);与模型组相比,芒果苷元组细胞能维持原来的鹅卵石形,迁移和侵袭能力显著下降( P < 0.05,0.01),FN和ColⅠ蛋白表达水平显著下调( P < 0.05)。 结论 芒果苷元能抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞迁移和侵袭,阻止细胞形态的改变,下调细胞外基质成分FN和ColⅠ的蛋白表达,从而抑制EMT的发展。 Abstract:Objective To study the effects of norathyriol on epithelial-mesenchymal transition of HK-2 cells induced by TGF-β1. Methods MTT assay was used to detect the effect of norathyriol on HK-2 cell viability. The HK-2 cells were divided into normal group, model group, norathyriol (10-8, 10-7, 10-6 mol·L-1) groups and positive control (benzbromarone, 10-7 mol/L) group. The norathyriol and benzbromarone were incubated for 4 h before HK-2 cells were treated by TGF-β1 (10 ng/mL) to induce EMT. Then, the HK-2 cells were cultured for another 24 h or 48 h. Scratch assay was used to detect the migration motility of HK-2 cells. Transwell invasion assay was used to detect invasion ability of HK-2 cells. The proteins expression of fibronectin (FN) and collagen type Ⅰ (ColⅠ) were detected by western blot. Results (1) The norathyriol (10-9-10-5 mol/L)has no effects on the HK-2 cell viability, compared with the normal group (P > 0.05). (2) Compared with the normal group, the cells morphology of the model group changed from the original cobblestone shape to a long fusiform shape, the migration rate and the invasive ability of the model group was significantly increased ( P < 0.01). The protein expression of Col and FN in the model group was significantly increased. Compared with the model group, the cells morphology of norathyriol (10 -8, 10-7, 10-6 mol/L) and benzbromarone (10-7 mol/L) groups maintain thecobblestone shape partly, the migration rate (10-8, 10-7, 10-6 mol/L) and the invasive ability (10-6 mol/L) of norathyriol were significantly decreased (P < 0.01); The protein expression of Col and FN were significantly down-regulated in the norathyriol (10 -6 mol/L) group and the benzbromarone group (P < 0.05, 0.01). Conclusion Norathyriol can inhibit the migration and invasion of HK-2 cells induced by TGF-β1 and down-regulate the protein expression of fibronectin (FN) and collagen type Ⅰ (ColⅠ). -
Key words:
- Norathyriol /
- TGF-β1 /
- HK-2 cell /
- Migration /
- Invasion /
- Epithelial-mesenchymal transition (EMT)
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冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease,CAHD)是冠状动脉血管粥样硬化导致的血液循环障碍,以血管腔狭窄或阻塞为特征,致使心肌缺血、缺氧而引起的一系列临床症状,简称冠心病[1-2]。经皮冠状动脉介入治疗术(percutaneous coronary intervention,PCI)是目前全球范围内应用最广泛的心肌再灌注疗法,可有效提高冠心病和心肌梗死患者的生存率,改善患者的生存质量[3-4]。然而,PCI术后新生内膜病理性增生,管腔直径的丢失而引起的支架内“再狭窄”(in-stent restenosis,ISR),严重影响其临床疗效及患者预后[5]。临床上常口服氯吡格雷和阿司匹林以防治支架内再狭窄的发生,虽然有一定疗效,但对ISR致急性冠脉事件发生的预后仍不乐观。
PCI术后的ISR 是血管对损伤的一种病理反应,支架扩张后造成的血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)损伤, VSMCs过度增殖、迁移而导致血管新生内膜形成,支架附近的血栓形成是导致ISR病程进展的3个主要原因[6-7]。冠脉支架植入后内皮细胞间连接受损,脂蛋白和单核细胞侵入内皮下,抗栓剂表达减少,一氧化氮(nitric oxide,NO)生成减少,屏障功能受损引发一系列复杂的事件,包括内皮剥脱、血栓前内膜暴露和随后的炎症、生长因子和细胞因子的释放、血小板活化及VSMCs增殖和迁移还能促进损伤部位的血栓形成[8-11]。综上,VECs的损伤是ISR的启动因素;VSMCs的过度增殖、迁移与凋亡不足造成支架内膜的逐渐增厚,演变为不稳定的动脉粥样硬化斑块,是ISR形成的中心环节;血管壁重构和局部血栓形成是ISR的最终结果。因此,关注VSMCs的增殖及迁移并尽快恢复VECs的活性将成为研究药物对ISR作用的关键靶标。
昆明山海棠[Tripterygium hypoglaucum (Levl) hutch,THH]属卫茅科雷公藤属植物,民间用于治疗类风湿性关节炎、肾小球肾炎等免疫系统疾病具有较好的临床疗效[12]。卫茅碱(Euonymine,C38H47NO18,分子量:805.783)是从THH根木中提取活性最高的雷公藤次碱化合物,见图1[13]。课题组前期研究发现,昆明山海棠提取物抑制VSMCs的增殖,提示昆明山海棠在PCI术ISR方面的具体机制有进一步深入研究的价值;而作为THH中活性最高的雷公藤次碱化合物卫茅碱,是否具有抗ISR的作用值得关注。因此,本实验培养与ISR密切相关的VSMCs和HUVECs,进一步探讨卫茅碱对VSMCs和HUVECs增殖、迁移及细胞周期的调控作用,为卫茅碱临床应用于涂层支架提供理论和实验依据。
图 1 卫茅碱的化学结构式[13]Figure 1. Chemical structural of Euonymine1. 材料与方法
1.1 药物与试剂
卫茅碱由云南省中医药大学周志宏老师馈赠,纯度为98.8%;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),DMEM高糖培养基购自Gibico公司;0.25%胰酶购自BI公司;双抗青链霉素溶液购自Hyclone公司;DMSO购自Solarbio公司。
1.2 细胞系
HUVECs购自中国典型培养物保藏中心,人脐动脉来源VSMCs购自中国科学院昆明动物研究所。
1.3 仪器
CK-40显微镜购自Olympus公司,荧光显微镜购自尼康有限公司。
1.4 方法
1.4.1 卫茅碱的配制
用DMSO溶液完全溶解卫茅碱后,加入PBS配成2 mg/mL母液,临用前稀释成所需浓度。
1.4.2 台盼蓝检测卫茅碱对HUVECs成活率的影响
取HUVECs单细胞悬液,浓度106/mL移入EP管中,加入0.4%台盼蓝溶液后混匀,用血球计数板对拒染细胞和蓝染细胞计数,实验重复6次,取其平均值,求活细胞率[14]:
$$ {\text{活细胞率}}({\%}) = \frac{{\text{拒染细胞总数}}}{{\text{拒染细胞总数}} + {\text{蓝染细胞总数}}} \times 100{\%} $$ 1.4.3 MTT 法检测卫茅碱对HUVECs及VSMCs增殖的影响
实验分组如下:正常对照组(0.2%DMSO)、HUVECs及VSMCs实验组分别加入卫茅碱至终浓度为12.5,25,50,100 µg/mL。取第8代细胞制备悬液,培养箱中(37℃、5%CO2、95%湿度)孵育24 h后,弃液,无血清培养基同化24 h。加药前及加药后1 d、2 d、3 d及4 d各取一块板,实验结束前4 h加入20 µL MTT溶液,置于CO2培养箱孵育4 h后,每孔加入100 μL三联液,直到紫蓝色结晶溶解,放培养箱过夜。隔日在酶标仪波长570 nm处测OD值。计算细胞生长抑制率IR(%)[14]:
$$ {\text{生长抑制率}}=\frac{ {\text{实验组}}{\rm{OD}} {\text{值}}- {\text{空白组}}{\rm{OD}} {\text{值}}}{ {\text{对照组}}{\rm{OD}} {\text{值}}- {\text{空白组}}{\rm{OD}} {\text{值}}}\times 100\% $$ 1.4.4 迁移实验
实验分组如下:正常对照组(0.2%DMSO),模型组(20% FBS诱导),20%FBS + Euonymine 25 µg/mL,20%FBS + Euonymine 100 µg/mL。将VSMCs的悬浮液以5×104个/mL的比例放入Culture Insert-2 Wells(Ibidi,NO:81176,Martinsried,德国)中,在标准条件下培养24 h,根据制造商的说明移除插件,创造一个500 μm宽的无细胞空间(又称划痕),并在0 h时间点拍照。细胞迁移距离(d) = 0 h距离-24 h距离,单位μm。
1.4.5 流式细胞仪分析
将准备好的1×106个VSMCs细胞悬液以1000 r/min离心5 min,然后用PBS清洗。将细胞悬液在4℃下用70%的乙醇进行过夜固定,然后在4℃下用PBS洗涤2次;加入终浓度为50 mg/L的RNaseA,在37℃的水浴中孵育30 mins。用终浓度为50 mg/L的PI在4℃下孵育30 min。通过流式细胞仪测量荧光强度,并通过流式细胞仪分析DNA含量。
1.5 统计学处理
所有实验数据采用均数±标准差(
$\bar x \pm s $ )表示,使用SPSS 19.0版统计软件包处理数据。各组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),P < 0.05认为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 HUVEC和VSMCs的细胞培养结果
正常组HUVECs细胞贴壁生长,细胞呈梭形或不规则三角形,核清晰,呈圆形或椭圆形; 正常的VSMCs多数呈梭形或长梭形, “峰、谷”生长状态明显,见图2。
2.2 Euonymine对HUVECs的存活率影响
将不同浓度的Euonymine(10,50,100 µg/mL)分别与HUVECs共同孵育后,实验结果提示Euonymine干预后,HUVECs的存活率降低,时效关系明显,见图3。不同浓度的Euonymine在72 h可使细胞存活率分别减少11.9%、22.4%和33.8% (P < 0.01)。
2.3 MTT法检测Euonymine对HUVECs及VSMCs增殖的影响
2.3.1 Euonymine抑制HUVECs增殖
分别用不同浓度的Euonymine(12.5,25,50,100 µg/mL)与HUVECs共同孵育后,MTT结果显示,不同浓度的Euonymine和对照组相比,OD值分别减少16.1%,25.0%,43.5%,87.0% (P < 0.01)。实验结果提示,Euonymine抑制HUVECs增殖,见表1。以HUVECs的生长抑制率对Euonymine浓度的自然对数值(LN)做量效Logistic回归分析(γ = 0.98,S = 7.59),求得Euonymine对HUVECs的生长抑制率曲线,IC50为28.6 µg/mL,见图4。
表 1 不同浓度Euonymine对HUVECs增殖的影响($ \bar x \pm s $ ,n = 6)Table 1. Effect of different concentrations of Euonymine on the proliferation of HUVECs ($\bar x \pm s $ ,n = 6)分组 OD (570 nm) IR(%) F P 正常对照组 DMSO 0.768 ± 0.06 Euonymine(µg/mL) 12.5 0.654 ± 0.08△ 16.1 25 0.591 ± 0.19△ 25.0 5.97 0.030* 50 0.460 ± 0.07△ 43.5 100 0.152 ± 0.12△ 87.0 *P < 0.05;与正常对照组相比较,△P < 0.05。 2.3.2 Euonymine抑制VSMCs增殖
分别用不同浓度的Euonymine(12.5,25,50,100 µg/mL)与VSMCs共孵育2 d,与对照组相比,MTT提示各浓度OD值减少(P < 0.01),见表2。另外,Euonymine (25,50,100 μg/mL)对VSMCs的抑制率在96 h分别达到43.9%、63.2%、88.9%,见表2。以VSMCs的生长抑制率对Euonymine浓度的自然对数值(LN)做量效Logistic回归分析(γ = 0.99,S = 4.62),IC50为33.92 µg/mL,见图5。
表 2 不同浓度Euonymine对VSMCs增殖的影响($\bar x \pm s$ ,n = 6)Table 2. Effect of different concentrations of Euonymine on the proliferation of VSMCs ($\bar x \pm s $ ,n = 6)分组 OD (570 nm) 24 h 48 h 72 h 96 h 正常对照组 DMSO 0.788 ± 0.16 0.841 ± 0.14 0.885 ± 0.08 0.925 ± 0.20 Euonymine
(µg/mL)12.5 0.688 ± 0.10 0.680 ± 0.13 0.676 ± 0.12△ 0.637 ± 0.04 25 0.626 ± 0.08△ 0.628 ± 0.19△ 0.607 ± 0.10△ 0.569 ± 0.12△ 50 0.524 ± 0.11△ 0.425 ± 0.15△ 0.419 ± 0.07△ 0.402 ± 0.18△ 100 0.312 ± 0.07△ 0.259 ± 0.13△ 0.219 ± 0.17△ 0.188 ± 0.08△ 200 0.259 ± 0.04△ 0.185 ± 0.16△ 0.156 ± 0.06△ 0.137 ± 0.18△ F 6.21 6.49 6.61 6.76 P 0.041* 0.041* 0 .031* 0.028* *P < 0.05;与正常对照组比较,△P < 0.05。 2.4 Euonymine抑制VSMCs迁移
迁移实验结果显示,各实验组的迁移距离分别是:正常对照组 (77.33±9.02) μm,模型组(260.05±26.12) μm,Euonymine 25 µg/mL组(189.36±15.68) μm,Euonymine 100 µg/mL(135.33±11.04 )μm。实验结果提示,与模型组相比,不同浓度的Euonymine均抑制VSMCs迁移(P < 0.01),见图6。
2.5 Euonymine对细胞周期的影响
2.5.1 Euonymine对血清诱导的HUVECs的细胞周期影响
实验结果显示,与模型组相比,低剂量Euonymine组(25 µg/mL)升高G0/G1期的细胞,而降低S期和G2/M期的细胞数;高剂量Euonymine组(100 µg/mL)S期细胞数进一步减少,G2/M期细胞数减少(P < 0.01)。结果提示,Euonymine干预后, HUVECs有丝分裂被阻断于G0/G1期(P < 0.01),见图7。
2.5.2 Euonymine对血清诱导的VSMCs细胞周期影响
实验结果显示,与模型组相比,Euonymine 25 µg/mL升高G0/G1期的细胞数,而降低S期和G2/M期的细胞数;100 µg/mL组S期细胞数进一步减少,G0/G1期、G2/M期细胞数增多(P < 0.01)。实验结果提示,低剂量Euonymine组使VSMCs有丝分裂停滞于G0/G1期,而高剂量Euonymine组VSMCs有丝分裂阻滞于G0/G1期和G2/M期;将药物作用时间延长至 48 h,实验结果和24 h趋势保持一致,见图8。
3. 讨论
PCI术后ISR是一个多因素多环节参与的复杂病理生理过程。冠脉支架植入后可导致VECs损伤,促进血管收缩,启动一系列血管损伤和炎症反应,还能促进损伤部位的血栓形成[15-19]。因此,VECs的损伤是ISR的启动因素;VSMCs的过度增殖、迁移与凋亡造成支架内膜的逐渐增厚,是ISR形成的中心环节。目前,可供临床使用的支架涂层药物很少,包括紫杉醇和雷帕霉素及其衍生物,这些支架涂层药物降低了支架内再狭窄率,但内皮延迟愈合和支架内血栓形成增加等主要不良后果严重降低了其治疗效果[20]。
本实验将卫茅碱作为研究材料,检测其对HUVECs和VSMCs增殖的影响,探讨其在防治PCI术后ISR中的潜在作用机制。本实验首先观察卫茅碱对 HUVEC和VSMCs 活性的影响。 从MTT 法测定结果来看,卫茅碱可抑制HUVECs和 VSMCs增殖,IC50 分别为28.6 µg/mL和33.92 µg/mL。接着笔者研究了卫茅碱对VSMCs迁移影响。结果表明,与模型组相比,卫茅碱在各个时间点对VSMCs的迁移距离有明显的抑制作用(P < 0.01),高剂量卫茅碱对VSMC的迁移抑制率最高达到79.1%。
细胞周期作为增殖信号转导的最终共同路径,细胞周期的推进在血管增生性疾病中起着关键作用[21-29]。为此笔者同时检测了卫茅碱对HUVECs和VSMCs的细胞周期的影响。流式结果表明,HUVECs与卫茅碱共孵育24 h,低剂量卫茅碱组(25 µg/mL)使G1/G0期细胞增加,S期及G2/M期细胞减少(P < 0.01),随着卫茅碱浓度增加到100 µg/mL,G1/G0期细胞增加明显,S期及G2/M期细胞减少,提示卫茅碱抑制HUVECs增殖可能主要通过抑制细胞周期由G1/G0期向S期过渡,使之停滞于细胞周期的G1/G0期。同时笔者观察到VSMCs经卫茅碱处理24 h 时,低剂量卫茅碱(25 μg/mL)主要阻滞细胞于G0/G1 期,而高剂量卫茅碱则阻滞于G0/G1及G2/M 期,延长卫茅碱与VSMCs的孵育时间到72 h ,不同剂量组VSMCs均体现为G2/M 期阻滞,且剂量依赖性明显。因此,卫茅碱抑制VSMCs 的增殖作用可能与其引起细胞G0/G1和G2/M 期阻滞密切相关。
综上所述,卫茅碱主要通过抑制VSMCs的增殖和迁移,同时影响细胞周期,对于抑制PCI术后ISR的形成有潜在的临床应用价值,但其对HUVECs亦有非选择性的抑制作用,其机理可能与其抑制HUVEC细胞周期的G1/G0期向S期过渡,使之停滞于细胞周期的G1/G0期有关。
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[1] Liu B C,Tang T T,Lv L L,et al. Renal tubule injury:A driving force toward chronic kidney disease[J]. Kidney international,2018,93(3):568-579. doi: 10.1016/j.kint.2017.09.033 [2] Djudiai S,Boor P. Cellular and molecular mechanisms of kidney fibrosis[J]. Molecular Aspects of Medicine,2019,65:16-36. doi: 10.1016/j.mam.2018.06.002 [3] 石咏琪,王墨. 肾间质纤维化发生机制研究进展[J]. 现代医药卫生,2019,35(19):3002-3006. doi: 10.3969/j.issn.1009-5519.2019.19.020 [4] Cruz-Solbes A S,Youker K. Epithelial to mesenchymal transition (EMT) and endothelial to mesenchymal transition (EndMT):role and implications in kidney fibrosis[J]. Results and Problems in Cell Differentiation,2017,60:345-372. [5] Iwano M,Plieth D,Danoff T M,et al. Evidence that fibroblasts derive from epithelium during tissue fibrosis[J]. The Journal of Clinical Investigation,2002,110(3):341-350. doi: 10.1172/JCI0215518 [6] 遆安航,陈瑾,翟康欣,等. 连翘归尾煎对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移、凋亡和周期的影响[J]. 山西医科大学学报,2021,52(5):565-571. [7] Saral L,Michael Z,Raghu K. Partial epithelial-to-mesenchymal transition and other new mechanisms of kidney fibrosis[J]. Trends in Endocrinology and Metabolism,2016,27(10):681-695. doi: 10.1016/j.tem.2016.06.004 [8] Meng X M,Nikolic-paterson D J,Lan H Y. TGF-β:the master regulator of fibrosis[J]. Nature Reviews. Nephrology,2016,12(6):325-338. doi: 10.1038/nrneph.2016.48 [9] Xu C G,Zhu X L,Wang W,et al. Ursolic acid inhibits epithelial-mesenchymal transition in vitro and in vivo[J]. Pharmaceutical Biology,2019,57(1):169-175. doi: 10.1080/13880209.2019.1577464 [10] Fan Y,Wang X,Li Y,et al. PAK4 enhances TGF-β1-induced epithelial- mesenchymal transition through activating β-catenin signaling pathway in renal tubular epithelial cells[J]. International Journal of Clinical and Experimental pathology,2018,11(6):3026-3035. [11] Song Y,Lv S S,Wang F,et al. Overexpression of BMP-7 reverses TGF-β1-induced epithelial-mesenchymal transition by attenuating the Wnt3/β-catenin and /Smad2/3 signaling pathways in HK-2 cells[J]. Molecular Medicine Reports,2019,21(2):833-841. [12] 周栋,傅海燕. 细胞外基质的产生、重塑与肾脏纤维化[J]. 江苏医药,2015,41(8):936-938. [13] 李淑菊,詹晓丹,田锋,等. 参地补肾胶囊含药血清对高糖诱导转分HK-2细胞ZO-1、α-SMA表达的影响[J]. 中国中医药科技,2018,25(6):797-800. [14] Louis K,Hertig A. How tubular epithelial cells dictate the rate of renal fibrogenesis?[J]. World Journal of Nephrology,2015,4(3):367-373. doi: 10.5527/wjn.v4.i3.367 期刊类型引用(8)
1. 吴珍,谭菊香,朱芬燕,李卓然,万丽红. 10年前后复发高血压性脑卒中新入院患者的健康知识变化情况研究. 中华现代护理杂志. 2021(24): 3303-3307 . 百度学术
2. 徐芳成琳,周慧芳. 老年阿尔茨海默病病人饮食干预进展. 护理研究. 2020(09): 1597-1599 . 百度学术
3. 宋喜玲. 全面护理干预在高血压老年患者中的应用效果观察. 内蒙古医学杂志. 2018(08): 1013-1014 . 百度学术
4. 梁煜,谭健烽,万崇华,伊向仁,拓西平,许波. 老年人慢性病多维健康测定量表高血压模块的构建研究. 中国全科医学. 2018(07): 847-851 . 百度学术
5. 郭桢. 老年高血压病患者社区护理干预研究进展. 实用临床护理学电子杂志. 2018(28): 192-194 . 百度学术
6. 刘凯. 研究低盐饮食干预对高血压患者动态血压的影响. 世界最新医学信息文摘. 2018(36): 47 . 百度学术
7. 冷建智. 低盐饮食管理在社区中老年难治性高血压患者中的应用分析. 中国卫生产业. 2018(05): 42-43 . 百度学术
8. 刘翠朵. 饮食疗法联合运动干预在老年高血压患者血压控制中的应用效果. 首都食品与医药. 2018(11): 34-35 . 百度学术
其他类型引用(3)
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