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一种经济的乳兔骨髓来源的肥大细胞诱导培养及鉴定

王禹雪 张华莉 陈理军 陆永萍

王禹雪, 张华莉, 陈理军, 陆永萍. 一种经济的乳兔骨髓来源的肥大细胞诱导培养及鉴定[J]. 昆明医科大学学报, 2023, 44(6): 1-5. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20230622
引用本文: 王禹雪, 张华莉, 陈理军, 陆永萍. 一种经济的乳兔骨髓来源的肥大细胞诱导培养及鉴定[J]. 昆明医科大学学报, 2023, 44(6): 1-5. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20230622
Yuxue WANG, Huali ZHANG, Lijun CHEN, Yongping LU. An Economical Method for Cultivation and Identification of Mast Cell Derived from Suckling Rabbit Bone Marrow[J]. Journal of Kunming Medical University, 2023, 44(6): 1-5. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20230622
Citation: Yuxue WANG, Huali ZHANG, Lijun CHEN, Yongping LU. An Economical Method for Cultivation and Identification of Mast Cell Derived from Suckling Rabbit Bone Marrow[J]. Journal of Kunming Medical University, 2023, 44(6): 1-5. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20230622

一种经济的乳兔骨髓来源的肥大细胞诱导培养及鉴定

doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20230622
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(82260095);云南省高等学校工程研究中心建设项目(2021);云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项基金重点项目(202001AY070001-008)
详细信息
    作者简介:

    王禹雪(1989~),女,彝族,云南蒙自人,博士研究生,主要从事心血管超声工作

    通讯作者:

    陆永萍,E-mail: luyongp@163.com

  • 中图分类号: Q291

An Economical Method for Cultivation and Identification of Mast Cell Derived from Suckling Rabbit Bone Marrow

  • 摘要:   目的  通过一种操作简单的体外诱导培养体系获得更加成熟、更具有典型特征的肥大细胞。  方法  将乳兔的骨髓吹出放入含DMEM高糖培养基中,隔天换液,待细胞铺满,改用F12诱导培养基,隔天换液,镜下观察有细胞变圆时,更换为1640促成熟培养基,隔7 d换液,直至细胞诱导成熟。利用甲苯胺蓝染色检测其功能,流式细胞仪检测表面CD117及FcεR1α表达结果。  结果   6周后甲苯胺蓝染色可观察到:加入β-巯基乙醇的可得到含较多异染颗粒的细胞。采用流式细胞术进行检测:加入β-巯基乙醇时:CD117+、FcεRIα+双阳性细胞的比例为 96.2%,与不加β-巯基乙醇相比有统计学意义(P < 0.05)。  结论  利用SCF、IL-3及β-巯基乙醇可以成功诱导出兔骨髓来源的肥大细胞,为下一步对兔进行炎性损伤研究提供了依据,使后续基础及临床研究成为可能。
  • 九十年代初期的研究表明,在动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)形成过程中,动脉内膜和外膜层聚集着肥大细胞(mast cells,MCs),首次提出MCs参与AS进程[1]

    血管的微环境一旦发生变化,炎性细胞便会从血管外膜的滋养血管中渗出,参与疾病的变化[2-3]。MCs激活时释放出来的趋化因子、细胞因子、组胺、白三烯等炎症因子[4]使血管的通透性增加,导致单核巨噬细胞和淋巴细胞聚集到斑块处[5],释放出大量的中性蛋白酶,可以加速低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)进入到血管内膜局部并聚集[6],促进AS斑块形成。

    在骨髓细胞向MCs分化及活化过程中白细胞介素3(interleukin-3,IL-3)和干细胞因子(stem cell factor,SCF)起到重要作用[7-8]。本研究旨在通过提取乳兔骨髓细胞,利用IL-3、SCF、β-巯基乙醇联合作用诱导培养骨髓来源肥大细胞并鉴定其纯度与活性,为进一步研究肥大细胞与AS的关系提供依据。

    IL-3、SCF(美国Peprotech公司);FBS、DMEM、DMEM/F12、RPMI-1640(美国Gibco公司);实验动物:2周龄乳兔,昆明医科大学实验动物学部,环境条件符合国家实验动物环境及设施标准要求,室内保持安静、清洁、干燥和通风。自由饮水。实验动物使用许可证号:SCXK(滇)2015-0002。

    1.2.1   兔骨髓细胞的获取

    麻醉:(经2周龄乳兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠,1 mL/kg)→浸泡(75%C2H5OH,10 min)→剥离(后肢皮肤切开,逐层分离,剥离肌肉)→暴露股骨→取出→浸泡(75% C2H5OH的无菌培养皿中浸泡3~5 min)→股骨两端剪去→吹打骨髓(吸取DMEM高糖培养基后吹打骨髓,股骨变白)→获取细胞(1000 r/min,5 min。如果在获取的细胞中有较多红细胞,则应用红细胞裂解液进行处理)→培养体系(含84 mL DMEM高糖培养基、15 mL FBS、1 mL双抗)。

    1.2.2   细胞的培养

    接种到T25瓶中(含DMEM高糖培养基)→隔天换液→细胞铺满→消化细胞→新培养瓶→贴壁→改用F12诱导培养基(含84 mL DMEM/F12、15 mL FBS、1 mL双抗、10 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3及0、10×10-5 mol/L的β-巯基乙醇)→放置37 ℃、5% CO2 饱和湿度环境→隔天换液→镜下观察细胞有变圆→更换为1640促成熟培养基(含84 mL RPMI 1640、15 mFBS、1 mL双抗、10 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3及0、10×10-5 mol/L的β-巯基乙醇)→7 d换液→直至细胞诱导成熟。

    1.2.3   肥大细胞功能学鉴定

    诱导成熟的重悬细胞液→载玻片→干燥→甲苯胺蓝染色→95% C2H5OH脱色→清洗→镜下观察。

    1.2.4   肥大细胞形态学鉴定

    通过光镜下观察不同培养时间的细胞形态,直至诱导成熟。

    消化细胞→洗2次(PBS)→细胞密度1×10 7个/mL→每管100 μL→单染管各加入5.0 μL的 CD117-PE抗体及FcεR1α-FITC抗体→双染管加两种抗体→空白对照管(无抗体)→避光孵育30 min→每管加1 mL PBS→离心10 min(400 g)→去上清→上法洗涤1次→去上清→每管加100 μL PBS→检测。

    2 d后开始出现以形态为长梭形的贴壁细胞;7 d时:细胞基本将培养瓶铺满;2周时:细胞逐渐变形;4周时:细胞基本变为圆形,悬浮细胞变多;6周时:细胞基本变为类圆形,且形态均匀具有折光性(图1)。

    图  1  肥大细胞变形过程(100×)
    A:7 d时长梭形贴壁细胞;B:2周时细胞逐渐变形;C:4周时细胞逐渐变圆;D:6周时变为类圆形细胞。
    Figure  1.  Changes in mast cells(100×)

    培养6周细胞成熟后利用甲苯胺蓝染色:可以观察到细胞质为紫红色,细胞核为蓝色。异染颗粒的细胞加入β-巯基乙醇比不加入β-巯基乙醇的能得到更多(图2)。

    图  2  甲苯胺蓝染色(100×)
    A:β-巯基乙醇浓度0 mol/L;B:β-巯基乙醇浓度10×10-5 mol/L。
    Figure  2.  Toluene blue staining(100×)

    培养6周收集细胞,利用流式细胞术检测细胞表面CD117及FcεR1α的表达情况,加入β-巯基乙醇双阳性细胞的比例达96.2%,大于不加入β-巯基乙醇的(图3),且与不加β-巯基乙醇相比有统计学意义(P < 0.05),见表1

    图  3  流式细胞仪检测细胞的双阳性率
    A:β-巯基乙醇为0 mol/L;B:β-巯基乙醇为10×10-5 mol/L。
    Figure  3.  Double positive rate of cells detected by flow cytometry
    表  1  不同浓度β-巯基乙醇诱导后CD117+ FcεRIα+肥大细胞的比例
    Table  1.  The proportion of CD117+ FcεRIα+ mast cells induced by different concentrations of β-mercaptoethanol
    β-巯基乙醇
    (mol/L)
    实验次数CD117+ FcεRIα+
    肥大细胞的比例(%)
    P
    0548.97 ± 3.120.7069
    10×10−55 95.64 ± 4.66#
      与β-巯基乙醇浓度为0 mol/L比较,#P < 0.05。
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    在正常人的心脏、主动脉及脂肪组织中有少量的MCs存在,当人类发生疾病时MCs的数量就会增多,比如AS。近年来,研究表明MCs在AS的发生、发展及斑块稳定性中有着重要作用[9]

    当下有研究认为MCs是利用其表面的趋化因子受体-3与AS斑块中表达的嗜酸细胞活化CC趋化因子亚族中趋化因子配体-11结合而向病变部位聚集[10]。MCs起源于骨髓造血干细胞[11],促进MCs成熟的分子主要有SCF和神经生长因子(nerve growthfactor,NGF)[17],SCF可能在MCs向受累区域聚集发挥作用,而MCs侵入受累区域可能会进一步导致更多的炎性细胞浸润,促进AS斑块形成。

    IL-3又被叫做肥大细胞生长因子,在MCs的生长、分化、迁移和效应中具有重要作用。活化T细胞、天然杀伤(NK)细胞和MCs都可产生IL-3,且对于SCF在MCs前体的发生、发展、扩增具有促进意义[12-13]。SCF的配体CD117(c-kit)除在其表面外,各种造血祖细胞中均可存在。MCs发挥重要表面标志的是FcεRIα,但FcεRIα还表达于嗜酸性粒细胞等细胞表面,只有MCs同时表达CD117和FcεRIα[14]。甲苯胺蓝染色是一种常用于识别及判断MCs功能状态的方法,同时也是MCs的特异性染色,可染细胞核为蓝色,胞质内为异染性紫红色颗粒,说明其具有吞噬功能[15]。通过甲苯胺蓝染色和流式细胞仪检测结果对诱导获得的MCs的纯度进行鉴定,就目前来说,利用兔的骨髓间质干细胞来诱导培养MCs的报道是极少的。

    本研究选用2周龄的乳兔来获取骨髓间质干细胞,因为当兔龄大于或者小于2周龄时,笔者发现细胞生长速度变得缓慢,可能是2周龄的骨髓间质干细胞的活性更好,更有利于细胞的培养。当IL-3浓度10 ng/mL、SCF浓度为10 ng/mL,加入β-巯基乙醇时:甲苯胺蓝染色及流式检测均较不加入β-巯基乙醇时可以获取更多、双阳性率更高的MSc,原因可能为β-巯基乙醇作为一种还原剂,在降低氧对细胞产生氧化损伤的同时促进干细胞生长。所以该培养体系是一种良好的体外诱导培养体系,其操作简单,且能获得更加成熟、更具有典型特征的MCs,为下一步对兔行进炎性损伤研究提供了优势。综上所述,本研究利用形态学、功能学2个方面对诱导的兔骨髓来源MCs进行鉴定,培养出的细胞不仅具有成熟MCs的生物学特性,还具有其功能,这便为后续的基础研究及临床研究奠定基础。

  • 图  1  肥大细胞变形过程(100×)

    A:7 d时长梭形贴壁细胞;B:2周时细胞逐渐变形;C:4周时细胞逐渐变圆;D:6周时变为类圆形细胞。

    Figure  1.  Changes in mast cells(100×)

    图  2  甲苯胺蓝染色(100×)

    A:β-巯基乙醇浓度0 mol/L;B:β-巯基乙醇浓度10×10-5 mol/L。

    Figure  2.  Toluene blue staining(100×)

    图  3  流式细胞仪检测细胞的双阳性率

    A:β-巯基乙醇为0 mol/L;B:β-巯基乙醇为10×10-5 mol/L。

    Figure  3.  Double positive rate of cells detected by flow cytometry

    表  1  不同浓度β-巯基乙醇诱导后CD117+ FcεRIα+肥大细胞的比例

    Table  1.   The proportion of CD117+ FcεRIα+ mast cells induced by different concentrations of β-mercaptoethanol

    β-巯基乙醇
    (mol/L)
    实验次数CD117+ FcεRIα+
    肥大细胞的比例(%)
    P
    0548.97 ± 3.120.7069
    10×10−55 95.64 ± 4.66#
      与β-巯基乙醇浓度为0 mol/L比较,#P < 0.05。
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出版历程
  • 收稿日期:  2023-03-06
  • 网络出版日期:  2023-06-26
  • 刊出日期:  2023-06-25

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