Screening Cut-off Value of 17- hydroxyprogesterone for Neonatal Congenital Adrenal Hyperplasia
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摘要:
目的 分析不同性别、胎龄、采血日龄、出生体重对17-羟孕酮（17-hydroxyprogesterone，17-OHP）浓度的影响，制定适合实验室自身的新生儿先天性肾上腺皮质增生症（congenital adrenal hyperplasia，CAH）筛查阳性切值。 方法 采用时间分辨荧光免疫分析法检测17-OHP浓度，采用Mann-Whitney U 检验、Kruskal-Wallis H检验比较不同性别、孕周、胎龄和采血日龄等特征的新生儿17-OHP浓度，多元线性回归分析各临床特征与17-OHP浓度的关系，以99.5%百分位数为17-OHP筛查阳性切值。 结果 2019年9月至2024年10月在昆明医科大学第一附属医院新筛中心进行CAH筛查的新生儿样本共52 836例，未确诊先天性肾上腺皮质增生症。男性新生儿17-OHP浓度高于女性新生儿，差异有统计学意义（Z= -17.768，P < 0.05）。分别比较6组不同胎龄、4组不同出生体重、3组不同采血日龄的新生儿17-OHP浓度，差异有统计学意义（X2分别为 5235.187 、3682.665 、493.414，P值均=0.00）。进一步两两比较，除采血日龄≥3且<4 d和≥4且<7 d新生儿17-OHP浓度差异无统计学意义外（Z= -0.950，P = 0.342），其余不同孕周、胎龄和采血日龄新生儿17-OHP浓度差异均有统计学意义（P < 0.05）。新生儿17-OHP浓度随胎龄和出生体重增加而下降。多元线性回归结果表明，17-OHP浓度与多个因素有关，按作用从大到小依次为胎龄、出生体重、采血日龄、性别。结论 应综合考虑多种因素对新生儿末梢血17-OHP浓度的影响，将昆明医科大学第一附属医院新筛中心CAH筛查17-OHP阳性切值修改为：正常体重足月新生儿≥14.00 nmol/L，早产或（和）低体重新生儿≥36.00 nmol/L，以提高新生儿CAH筛查的特异度，减少假阳性。 -
关键词:
- 新生儿遗传代谢病筛查 /
- 先天性肾上腺皮质增生症 /
- 17-羟孕酮 /
- 筛查切值
Abstract:Objective To analyze the effects of different gender, gestational age, birth weight and blood collection date on the value of 17-hydroxyprogesterone （17-OHP） in neonatal screening for congenital adrenal hyperplasia （CAH） and to develop a positive cut-off for CAH screening that is appropriate for the laboratory itself. Methods Time-resolved fluorescence immunoassay was used to detect 17-OHP concentration, and Mann-Whitney U test and Kruskal-Wallis H test were used to compare 17-OHP concentration of newborns with the different gender, gestational age, gestational age and blood collection age. The relationship between the clinical features and 17-OHP concentration was analyzed by multiple linear regression, and the cut-off value of 17-OHP screening was 99.5% percentile. Results A total of 52836 newborn samples for CAH screening were selected from September 2019 to October 2024 at the Screening Center of Neonatal Genetic Metabolic Disease of the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, and no cases of congenital adrenal hyperplasia were diagnosed. The 17-OHP concentration of male neonates was higher than that of female neonates, and the difference was statistically significant （Z= -17.768, P < 0.05）. The 17-OHP concentration of neonates in 6 groups with different gestational age, 4 groups with different birth weight, and 3 groups with different blood collection days were compared respectively, and the difference was statistically significant （X2=5235.187 、3682.665 、493.414 respectively, P = 0.00）. Further pair comparison showed that there were statistically significant differences in 17-OHP concentration of neonates at different gestational weeks, gestational age and blood collection days （P < 0.05）, except that age of blood collection ≥3and<4 days and ≥4and<7 days（Z= -0.950, P = 0.342）. Neonatal 17-OHP concentration decreased with the gestational age and birth weight increase .The results of multiple linear regression showed that 17-OHP concentration was related to the several factors, including the gestational age, birth weight, age of blood collection and gender in descending order.Conclusion The effects of various factors on the concentration of 17-OHP in neonatal peripheral blood should be comprehensively considered. The cut-off value of 17-OHP for CAH screening in the Screening Center for Neonatal Genetic Metabolic Diseases in the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University was modified to ≥14.00 nmol/L for full-term neonates of normal weight and ≥36.00 nmol/L for premature or/and low-weight neonates so as to improve the specificity of neonatal CAH screening and reduce false positives. -
先天性肾上腺皮质增生症（congenital adrenal hyperplasia，CAH）是因为特定酶缺陷，引起肾上腺皮质激素生成减少或缺乏的一组先天性常染色体隐性遗传性疾病，其中21-羟化酶缺乏（21-hydroxylase deficiency，21-OHD）占所有CAH病例的95%以上[1]。同时其前体代谢物如17-羟孕酮（17-hydroxyprogesterone，17-OHP）增多，经旁路代谢产生过多的雄激素及睾酮 [2]。在失盐型CAH的新生儿，可能在生后数天发生肾上腺危象，表现为顽固性低钠、高钾血症、脱水、代谢性酸中毒、休克，甚至死亡；而单纯男性化型和非经典型的CAH患儿，出现皮肤色素沉着、女性男性化、男性性早熟等高雄激素表现，后期骨龄超前，身材矮小[3−4]。所以在症状发生前，体内激素水平已有改变时进行新生儿筛查，早期干预、治疗、改善预后非常重要。国内CAH发病率在1/12 000-1/25 000[5−7]，美国1/16 000[8]，南美洲1/14 531[9]。17-OHP是目前21-OHD新生儿筛查、临床诊断及随访的主要指标，但是新生儿外周血的17-OHP水平受多种因素的影响[10−11]。本文回顾性分析云南省昆明医科大学第一附属医院新筛中心2019年9月至2024年10月进行CAH 筛查的新生儿17-OHP检测结果，探讨建立适合新筛中心新生儿CAH筛查的17-OHP阳性切值，提高新生儿CAH筛查的特异度，减少假阳性。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
收集2019年9月到2024年10月昆明医科大学第一附属医院新筛中心CAH筛查数据，均来自所有活产新生儿的检测数据。所有检测经过监护人知情同意。本研究经昆明医科大学第一附属医院伦理委员会批准（2022伦审L第199号）。
1.2 研究方法
1.2.1 血样采集
新生儿出生3 d后采集足跟血，自然晾干后4℃密封保存，冷链递送至新筛中心进行检测。
1.2.2 标本检测
采用时间分辨荧光免疫分析法（time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）检测滤纸干血斑标本中17-OHP浓度。试剂购自芬兰Perkin Elmer公司，所有操作按照试剂说明书进行。Wallac victor 2-
1420 分析仪进行荧光分析。收到标本后5个工作日出具检测报告。每块实验板均带低、中2个浓度质控品，保证实验结果可靠。1.2.3 结果判断
同一标本两次检测17-OHP≥13.00 nmol/L（切值为试剂盒推荐），则召回新生儿采血复查，复查17-OHP结果仍≥13.00 nmol/L，召回新生儿进行电解质、生化及激素检测，结合临床症状，必要时进行基因检测确诊。
1.2.4 分组及分析指标
新生儿根据不同性别、胎龄、出生体重、采血日龄进行分组。根据胎龄（gestational age，GA）分为超早产组（GA<28周）、极早产组（28≤GA<32周）、中期早产组（32≤GA<34周）、晚期早产组（34≤GA<37周）、足月儿组（37≤GA<42周）和过期产儿组（GA≥42周）。根据出生体重（birth weight，BW）分为极低出生体重组（BW<
1500 g）、低出生体重组（1500 g≤BW<2500 g）、正常出生体重组（2500 g≤BW<4000 g）和巨大儿组（BW≥4000 g）。根据采血日龄分为≥3且<4 d、≥4且<7 d、≥7 d。比较各组间17-OHP浓度，分析17-OHP浓度的影响因素。1.3 统计学分析
采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。偏态分布资料以四分位数表示。2个独立样本组间几何均数比较及进一步两两比较采用Mann-Whitney U检验。多个独立样本组间几何均数多重比较采用 Kruskal-Wallis H 检验。多元线性回归分析17-OHP浓度的影响因素[12]。P < 0.05为差异有统计学意义。以99.5%百分位数为17-OHP筛查切值[13]。
2. 结果
2.1 CAH筛查一般情况
共完成CAH筛查检测的新生儿52 836例，未确诊先天性肾上腺皮质增生症。初筛阳性率1.12% （590/52 836），初筛阳性召回率90%（531/590）。
2.2 不同组别新生儿末梢血17-OHP浓度比较
经正态性检验，17-OHP 浓度呈正偏态分布。比较末梢血17-OHP浓度几何均数，男性新生儿（27 569例）高于女性（25 267例），差异有统计学意义（Z= -17.768，P < 0.05）。分别比较6组不同胎龄（X2=
5235.187 ）、4组不同出生体重（X2=3682.655 ）、3组不同采血日龄（X2= 493.414）的17-OHP浓度，差异有统计学意义（P值均=0.00）。进一步两两比较，除采血日龄≥3且<4 d与≥4且<7 d新生儿17-OHP浓度差异无统计学意义外（Z= -0.950，P = 0.342），其余不同孕周、胎龄和采血日龄新生儿17-OHP浓度差异均有统计学意义（P < 0.05），且新生儿17-OHP浓度随胎龄和出生体重的增加而下降。采血日龄≥7 d组新生儿17-OHP浓度大于采血日龄<7 d组，但99.5%百分位数值小于采血日龄<7 d组，见表1。表 1 不同组别新生儿末梢血 17-OHP浓度（nmol/L）Table 1. Neonatal peripheral blood 17-OHP concentration in different groups （nmol/L）组别 n 几何均数 百分位数 Z P P25 P50 P75 P99.5 性别 女 25 267 3.19 2.33 3.32 5.00 25.17 −17.768 <0.001* 男 27 569 3.30 2.54 3.64 5.50 28.52 GA（周） <28 87 17.31 9.24 16.60 34.30 — −2.442a 0.015* 28≤GA<32 477 12.75 8.38 13.50 21.15 88.70 −3.162 a 0.002* 32≤GA<34 581 11.12 7.51 11.40 17.55 63.36 −15.760 a <0.001* 34≤GA<37 3059 6.81 4.43 7.02 10.40 36.46 −55.799 a <0.001* 37≤GA<42 48490 3.38 2.38 3.34 4.85 14.20 −5.169 a <0.001* ≥42 142 2.62 1.92 2.64 3.79 — BW（g） BW< 1500 536 11.34 8.69 13.55 21.00 171.45 −21.108b <0.001* 1500 ≤BW<2500 4220 4.51 3.57 6.11 9.93 50.18 −49.792b <0.001* 2500 ≤BW<4000 46748 3.36 2.39 3.37 4.92 15.30 −9.028 b <0.001* BW≥ 4000 1332 2.54 2.11 3.00 4.18 11.93 采血日龄（d） ≥3且<4 15732 3.25 2.40 3.37 5.03 30.00 −0.950c 0.342 ≥4且<7 29163 3.66 2.38 3.41 5.12 26.10 −21.029 c <0.001* ≥7 7941 5.07 2.78 4.07 6.07 24.47 注：GA：胎龄；BW：出生体重；a非参数Mann-Whitney U 检验，与下一组较大胎龄组比较；b非参数Mann-Whitney U 检验，与下一组较大出生体重组比较；c非参数Mann-Whitney U 检验，与下一组较大采血日龄组比较；“-”表示无此值；*P < 0.05。 2.3 多元线性回归分析结果
以新生儿末梢血17-OHP浓度为因变量，新生儿性别、胎龄、出生体重、采血日龄为自变量，进行多元线性回归分析，结果表明所有自变量均进入回归方程，作用从大到小依次为胎龄、出生体重、采血日龄、性别，均对17-OHP浓度有影响（P < 0.05）。其中采血日龄和性别与17-OHP浓度成正相关关系，见表2。
表 2 新生儿末梢血17-OHP浓度影响因素的多元线性回归分析结果Table 2. Results of multiple linear regression analysis of influencing factors of neonatal peripheral blood 17-OHP concentration变量 未标准化系数 标准化系数 t P B 标准误差 Beta 胎龄 −4.033 0.071 −0.295 −56.781 0.000* 出生体重 −1.316 0.085 −0.081 −15.505 0.000* 采血日龄 0.145 0.038 0.016 3.816 0.000* 性别 0.360 0.050 0.029 7.211 0.000* *P < 0.05。 2.4 17-OHP筛查切值
因多元线性回归分析结果显示胎龄与新生儿末梢血17-OHP浓度的相关性最大，并结合不同性别、胎龄、出生体重和采血日龄99.5%百分位数值的情况，将新筛中心CAH筛查17-OHP切值修改为：正常体重足月新生儿≥14.00 nmol/L，早产或（和）低体重新生儿≥36.00 nmol/L。之前按照试剂盒说明书，初筛阳性采用一个阳性切值17-OHP≥13.00 nmol/L进行判别，初筛阳性590人，初筛阳性率1.12%（590/
52836 ）；如果按照目前统计的阳性切值分不同组别进行判别，初筛阳性人数降至382人，初筛阳性率0.72%（382/52 836），差异有统计学意义（X2=44.447，P = 0.000），假阳性率明显降低。3. 讨论
新生儿CAH筛查目的是为了预防危及生命的肾上腺皮质危象以及由此导致的脑损伤或死亡；预防女性患儿由于外生殖器男性化造成性别判断错误；预防过多雄激素造成的成年后身材矮小、心理、生理发育等障碍，使患儿在临床症状出现之前及早得到诊治[14]，研究表明新生儿17-OHP浓度受出生体重、胎龄、采血日龄、血pH值、血糖、窒息、感染、应激等因素的影响，CAH筛查存在较高的假阳性率及较低的阳性预测值[9，15−17]，因此需设定合理的CAH筛查阳性切值，过高导致漏诊，过低则增加假阳性率，造成人力、物力的浪费及新生儿家长的担忧。
本文通过对
52836 例新生儿17-OHP筛查检测数据进行分析，结果显示不同性别、胎龄、出生体重及不同采血日龄组间新生儿末梢血17-OHP浓度比较均存在统计学差异（P < 0.05），新生儿17-OHP浓度随胎龄和出生体重增加而下降，可能由于早产儿或出生体重较低的新生儿的肾上腺发育不成熟，合成氢化可的松的某种酶的活性或含量不足，阻碍了皮质醇的合成，导致17-OHP等前体物质堆积，而非酶的先天性缺陷导致[16，18]。多元线性回归分析结果表明，胎龄、出生体重、采血日龄、性别与17-OHP浓度均有相关性，胎龄与新生儿末梢血17-OHP浓度的相关性最大。虽然采血日龄与17-OHP浓度成正相关，但采血日龄≥7 d组新生儿17-OHP浓度99.5%百分位数值小于采血日龄<7 d组。综合考虑多元线性回归分析结果和不同胎龄、出生体重、采血日龄、性别99.5%百分位数值的情况，将我院新筛中心CAH筛查17-OHP切值修改为：正常体重足月新生儿≥14.00 nmol/L，早产或（和）低体重新生儿≥36.00 nmol/L。回顾性分析我筛查中心CAH初筛阳性率和初筛阳性召回率都不低，但未确诊1例阳性患儿，存在很高的假阳性率。如果用统计的阳性切值分不同组别进行判别，初筛阳性人数下降了35.25%，说明CAH筛查只采用一个阳性切值不合理。但需谨防孕母或新生儿糖皮质激素治疗史、血17-OHP延迟升高等因素带来的筛查假阴性结果[19−20]。在后续工作中将不断积累检测数据，不断优化阳性切值，降低假阳性率，提高阳性预测值。液相色谱-串联质谱检测技术（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）具有1次实验可检测多种物质，高效、高特异度、高灵敏度的优点，考虑到多种因素影响新生儿17-OHP浓度，研究表明利用液相色谱-串联质谱法对常规时间分辨荧光免疫分析法检测出的阳性样本进行二阶筛查，同时检测类固醇激素合成代谢途径中特定酶促反应的产物及酶阻断的前体化合物（如11⁃脱氧皮质醇、21⁃脱氧皮质醇、皮质醇和雄烯二酮）及其比值（如（17-羟孕酮+雄烯二酮）/皮质醇、（17-羟孕酮+21-脱氧皮质醇）/皮质醇）[14，21−24]，能有效降低假阳性率，提高阳性预测值。我筛查中心已经开展串联质谱检测新生儿多种遗传代谢病，尚未开展CAH的二阶筛查，希望后续能把此项工作作为常规筛查方法的有力补充，提高CAH筛查的特异度和灵敏度。
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表 1 不同组别新生儿末梢血 17-OHP浓度（nmol/L）
Table 1. Neonatal peripheral blood 17-OHP concentration in different groups （nmol/L）
组别 n 几何均数 百分位数 Z P P25 P50 P75 P99.5 性别 女 25 267 3.19 2.33 3.32 5.00 25.17 −17.768 <0.001* 男 27 569 3.30 2.54 3.64 5.50 28.52 GA（周） <28 87 17.31 9.24 16.60 34.30 — −2.442a 0.015* 28≤GA<32 477 12.75 8.38 13.50 21.15 88.70 −3.162 a 0.002* 32≤GA<34 581 11.12 7.51 11.40 17.55 63.36 −15.760 a <0.001* 34≤GA<37 3059 6.81 4.43 7.02 10.40 36.46 −55.799 a <0.001* 37≤GA<42 48490 3.38 2.38 3.34 4.85 14.20 −5.169 a <0.001* ≥42 142 2.62 1.92 2.64 3.79 — BW（g） BW< 1500 536 11.34 8.69 13.55 21.00 171.45 −21.108b <0.001* 1500 ≤BW<2500 4220 4.51 3.57 6.11 9.93 50.18 −49.792b <0.001* 2500 ≤BW<4000 46748 3.36 2.39 3.37 4.92 15.30 −9.028 b <0.001* BW≥ 4000 1332 2.54 2.11 3.00 4.18 11.93 采血日龄（d） ≥3且<4 15732 3.25 2.40 3.37 5.03 30.00 −0.950c 0.342 ≥4且<7 29163 3.66 2.38 3.41 5.12 26.10 −21.029 c <0.001* ≥7 7941 5.07 2.78 4.07 6.07 24.47 注：GA：胎龄；BW：出生体重；a非参数Mann-Whitney U 检验，与下一组较大胎龄组比较；b非参数Mann-Whitney U 检验，与下一组较大出生体重组比较；c非参数Mann-Whitney U 检验，与下一组较大采血日龄组比较；“-”表示无此值；*P < 0.05。 
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表 2 新生儿末梢血17-OHP浓度影响因素的多元线性回归分析结果
Table 2. Results of multiple linear regression analysis of influencing factors of neonatal peripheral blood 17-OHP concentration
变量 未标准化系数 标准化系数 t P B 标准误差 Beta 胎龄 −4.033 0.071 −0.295 −56.781 0.000* 出生体重 −1.316 0.085 −0.081 −15.505 0.000* 采血日龄 0.145 0.038 0.016 3.816 0.000* 性别 0.360 0.050 0.029 7.211 0.000* *P < 0.05。
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