Serological Study to Self-assembled Nanoparticle Influenza Vaccine with the M2e-HA2 Epitopes
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摘要:
目的 构建M2e-HA2串联表位的自组装纳米颗粒通用流感疫苗，并进行免疫血清学检测。 方法 将流感病毒M2e和HA2抗原表位与Ferritin蛋白串联表达，非变性条件下提取并经亲和层析纯化获得纳米自组装颗粒，经Western blot和电镜验证后免疫小鼠。2次免疫后采集小鼠血清，使用Western blot进行抗原性检测，使用ELISA进行抗体水平检测。 结果 成功制备M2e-HA2串联表位的自组装纳米颗粒，将其免疫小鼠后血清中产生高水平的M2e和HA2特异性抗体。 结论 M2e-HA2串联表位的自组装纳米颗粒可以刺激小鼠产生高水平的M2e和HA2特异性抗体，为通用流感疫苗研发奠定基础。 -
关键词:
- M2e-HA2串联表位 /
- 自组装纳米颗粒 /
- 流感疫苗 /
- 血清学
Abstract:Objective To construct the self-assembled nanoparticle influenza vaccine with the M2e-HA2 epitopes, and detect the immunological serology. Methods The M2e and HA2 antigen epitopes of influenza viruses were expressed in tandem with Ferritin protein, and the nanometer self-assembled particles were extracted under the condition of non-denatured and purified by affinity chromatography. The mice were immunized for two times, after the two immunizations, serum of mice was collected, western blot was used for antigenicity detection, and ELISA was used for antibody level detection. Results M2e-HA2self-assembled nanoparticles were successfully prepared, and high levels of M2e and HA2 specific antibodies were produced in the serum of immunized mice. Conclusion M2e-HA2 self-assembled nanoparticles can stimulate the production of high levels of M2e and HA2 specific antibodies in mice, laying the foundation for the development of a universal influenza vaccine. -
Key words:
- M2e-HA2 epitopes /
- Self-assembled nanoparticles /
- Influenza vaccine /
- Serological study
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随着经济的发展和生活方式的改变糖尿病的患病率逐年增加，我国最新流行病学统计结果显示18岁以上成人2型糖尿病发病率已达12.8%，糖尿病前期比例35.2%。中国大陆糖尿病患者总数估计为1.298亿[1]。本研究通过对云南省第一人民医院294例慢性丙型病毒性肝炎患者和52例2型糖尿病患者的临床资料进行分析，来探究慢性丙型病毒性肝炎患者2型糖尿病的流行病学特征并分析其危险因素。
1. 资料与方法
1.1 资料来源
选取2018年1月至2020年5月于云南省第一人民医院感染性疾病科及肝病科就诊的慢性丙型肝炎病毒感染患者及2020年10月于云南省第一人民医院内分泌代谢科就诊的2型糖尿病患者。所有选取的慢性丙型病毒性肝炎患者及2型糖尿病患者需分别满足2015年《丙型肝炎防治指南》[2]以及1999年WHO糖尿病诊断标准[3]。所有受试者需排除甲、乙、丁、戊肝炎病毒和非肝炎病毒感染、酒精性肝病、药物性肝病、自身免疫性肝病、肝硬化、肝癌等所致的肝脏疾病，排除其他类型糖尿病、内分泌疾病等引起的血糖水平异常，排除急、慢性肾脏疾病等引起的肾功能不全。本次研究共收集294例慢性丙肝患者，其中合并糖尿病患者70例，删除缺失的数据，故共有丙肝合并糖尿病（A组）患者56例，丙肝不合并糖尿病（B组）患者59例，再随机选取单纯不合并丙肝的2型糖尿病（C组）患者52例纳入最终研究。
1.2 调查内容与实验室检查
收集患者的一般临床资料，包括性别、年龄、地区、饮酒史。实验室检查包括HCV RNA、抗HCV抗体、LDH、AST、ALT、ALP、GGT、TBIL、DBIL、TBA、TP、ALB、GLB、BUN、CR、UA、TC、TG、HDL-C、LDL-C、血糖。
1.3 统计学处理
采用SPSS26.0数据统计包进行统计学分析。计量资料服从正态分布以均数 ± 标准差（
$\bar x \pm s $ ）表示，不服从正态分布以中位数（四分位数）[M（X25%，X75%）]表示。3组数据满足正态分布及方差齐性比较时采用方差分析，两两比较采用Bonferroni检验；满足正态分布但不满足方差齐性采用Welch检验，两两检验采用Dunnett’ s T3检验；不满足正态分布的数据采用非参数秩和K-W检验，两两比较采用Bonferroni检验。计数资料以例数和百分比n（%）表示，组间差异性比较采用R×C列联表资料的χ2检验进行统计分析，R×C列联表两两比较采用Bonferroni检验。单因素分析有统计学意义的变量（性别、年龄、地区、饮酒史、LDH、AST、ALT、ALP、GGT、TBIL、DBIL、TBA、ALB、GLB、UA、TC、TG、LDL-C）作为自变量，采用无序多元Logistic回归检验，以P < 0.05表示差异有统计学意义。2. 结果
2.1 流行病学特征
慢性丙型病毒肝炎患者2型糖尿病的检出率：294例慢性丙型病毒肝炎患者中70例患有2型糖尿病，2型糖尿病检出率为23.8%。
2.2 单因素分析
慢性丙型肝炎病毒感染者2型糖尿病患病情况与单纯不合并丙型病毒肝炎的2型糖尿病进行单因素分析：结果显示在3组中性别、年龄、地区、饮酒、UA、GLB、LDL-C、TC、LDH、GLB、AST、ALT、ALP、GGT、TBiL、DBiL、TBA、TG，差异有统计学意义（P < 0.05），TP、HDL-C、BUN、CR，差异无统计学意义（P > 0.05），见表1、表2。在所分的3组中，对差异有统计学意义的指标分别进行两两比较，UA在丙肝合并糖尿病与丙肝不合并糖尿病组，差异有统计学意义（P < 0.05），在丙肝不合并糖尿病与单纯不合并丙肝的2型糖尿病组差异有统计学意义（P < 0.05），在丙肝合并糖尿病与单纯不合并丙肝的2型糖尿病组，差异无统计学意义（P > 0.05）；地区、饮酒、GLB、TC、LDL-C、LDH、ALB、AST、ALT、ALP、GGT、TBIL、DBIL、TBA、TG在丙肝合并糖尿病与单纯不合并丙肝的2型糖尿病组，差异有统计学意义（P < 0.05），在丙肝不合并糖尿病与单纯不合并丙肝的2型糖尿病，差异有统计学意义（P < 0.05），在丙肝合并糖尿病与丙肝不合并糖尿病组，差异无统计学意义（P > 0.05）；性别虽然在3组比较中，差异具有统计学意义，但每2组分别进行比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。年龄在小于40岁组与大于60岁组、50～60岁组，差异有统计学意义（P < 0.05），见表1、表2。
表 1 慢性丙型肝炎患者感染2型糖尿病计数资料单因素分析 [n（%）]Table 1. Univariate analysis of enumeration data of patients with chronic hepatitis C infected with type 2 diabetes mellitus [n（%）]因素 A组（n = 56） B组（n = 59） C组（n = 52） χ2 P 性别 男 44（78.6） 45（76.3） 30（57.7） 6.859 0.032 女 12（21.4） 14（23.7） 22（42.3） 地区 城市 30（53.6）* 30（50.8）* 42（80.8） 12.406 0.002 农村 26（46.4）* 29（49.2）* 10（19.2） 饮酒史 无 24（42.9）* 24（40.7）* 38（73.1） 14.134 0.001 有 32（57.1）* 35（59.3）* 14（26.9） 年龄（岁） < 40 1（1.79） 11(18.65) 3（5.77） 18.633 0.004 40~50 21（37.50） 23(38.98) 11（21.15） 50~60 15（26.79）# 14(23.73) # 20（38.46）# > 60 19（33.93）# 11（18.64）# 18（34.62）# 与C组比较，*P < 0.05；与 < 40岁比较，# P < 0.05。 表 2 慢性丙型肝炎患者感染2型糖尿病计量资料单因素分析[（$\bar x \pm s $ ）或M（X25%，X75%）]Table 2. Univariate analysis of quantitative data of chronic hepatitis C patients infected with type 2 diabetes mellitus [（$\bar x \pm s $ ） or M（X25%，X75%）]指标 A组 B组 C组 F/H P UA（μmol/L） 367.91 ± 118.41* 313.87 ± 118.11# 385.65 ± 92.68 6.416 0.002 GLB（g/L） 34.93 ± 6.47# 33.43 ± 9.92# 27.02 ± 5.44 16.262 < 0.001 LDL-C（mmol/L） 2.17 ± 1.29# 2.30 ± 0.88# 2.98 ± 1.04 8.677 < 0.001 TC（mmol/L） 3.79 ± 1.36# 3.91 ± 1.17# 4.78 ± 1.17 10.266 < 0.001 AST（U/L） 29（25，54）# 66（26，92）# 10（14，24） 42.730 < 0.001 ALT（U/L） 46（20，66）# 48（19，67）# 15（14，29） 17.546 < 0.001 ALP（U/L） 57（69，126）# 73（67，140）# 34（55，89） 21.340 < 0.001 GGT（U/L） 102（29，131）# 105（35，140）# 17（23，40） 21.780 < 0.001 TBiL（μmol/L） 15.1（11，26.1）# 15.6（11.6，27.2）# 5（8，13） 21.758 < 0.001 DBiL（μmol/L） 8.8（3.8，12.6）# 7.1（4.7，11.8）# 1.8（2.9，4.7） 31.314 < 0.001 TBA（μmol/L） 45.3（5，50.3）# 29.5（3.6，33.1）# 3.8（2.3，6.1） 26.819 < 0.001 BUN（mmol/L） 4.2（4，8.2） 1.8(3.9，5.7) 2.2(4.4，6.6) 4.923 0.085 CR（μmol/L） 41(59，100) 19(54，73) 19(55，74) 5.949 0.051 TG（mmol/L） 0.94(0.66，1.6)# 0.67(0.71，1.38)# 1.21(1.43，2.64) 31.150 < 0.001 TP（g/L） 70.31 ± 9.34 67.40 ± 10.11 67.83 ± 6.77 4.056 0.132 HDL-C（mmol/L） 0.97 ± 0.40 0.96 ± 0.47 1.00 ± 1.24 1.186 0.553 LDH（U/L） 227.29 ± 78.39# 221.25 ± 80.84# 156.94 ± 34.95 12.343 < 0.001 ALB（g/L） 35.38 ± 6.72# 36.19 ± 7.41# 40.29 ± 4.62 28.729 < 0.001 与B组比较，*P < 0.05；与C组比较，#P < 0.05。 2.3 多因素分析
单因素分析差异有统计学意义的变量（性别、年龄、地区、饮酒史、LDH、AST、ALT、ALP、GGT、TBIL、DBIL、TBA、ALB、GLB、UA、TC、TG、LDL-C）为自变量，以A组、B组、C组为因变量，采用无序多元Logistic回归分析。各变量 赋值情况，见表3。结果显示，丙肝合并糖尿病与丙肝不合并糖尿病患者相比年龄（OR = 1.708）及TBA（OR = 1.044）是其独立危险因素。单纯不合并丙肝的2型糖尿病与丙肝不合并糖尿病患者相比，年龄（OR = 1.202）、TG（OR = 15.963）为其独立危险因素，LDH（OR = 0.949）是保护因素。丙肝合并糖尿病与单纯不合并丙肝的2型糖尿病患者相比，LDH（OR = 1.060）、性别（OR = 126.009）为其独立危险因素，TG（OR = 0.120）为其保护因素（P < 0.05）。见表4、表5、表6。
表 3 变量赋值表Table 3. Variable assignment table因素 变量名 编码说明 性别 X1 男 = 0，女 = 1 地区 X2 城市 = 0，农村 = 1 饮酒 X3 无 = 0，有 = 1 组别 Y 组A = 1，组2 = 2，组3 = 3 表 4 丙肝合并糖尿病与丙肝不合并糖尿病Logistic回归Table 4. Logistic regression between hepatitis C patients with or without concomitant diabetes因素 Β SE Wald P OR 95%CI 年龄 0.076 0.028 7.530 0.006 1.708 1.022～1.138 TBA 0.043 0.017 6.494 0.011 1.044 1.010～1.079 注：丙肝不合并糖尿病为对照组。 表 5 单纯不合并丙肝的2型糖尿病与丙肝不合并糖尿病Logistic回归Table 5. Logistic regression of type 2 diabetes patients with or without concomitant hepatitis C项目 Β SE Wald P OR 95%CI 年龄 0.184 0.064 8.372 0.004 1.202 1.061～1.361 TG 2.770 1.062 6.810 0.009 15.963 1.993～127.859 LDH −0.052 0.022 5.849 0.016 0.949 0.910～0.990 注：丙肝不合并糖尿病为对照组。 表 6 丙肝合并糖尿病与单纯不合并丙肝的2型糖尿病Logistic回归Table 6. Logistic regression between hepatitis C complicated with diabetes and type 2 diabetes without hepatitis C因素 Β SE Wald P OR 95%CI LDH 0.058 0.022 7.139 0.008 1.060 1.016～1.106 性别（1） 4.836 2.431 3.957 0.047 126.009 1.074～14789.234 TG −2.117 1.074 3.886 0.049 0.120 0.015～0.988 注：单纯不合并丙肝的2型糖尿病为对照组，性别（1）表示女性为对照组。 3. 讨论
全球每年约300～400万人新感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)，目前约有1.5～2亿人被慢性感染，估计全球丙型肝炎病毒感染率为2.8%，每年因HCV感染导致的死亡病例约为 35 万例[4]。肝脏是物质代谢的核心，丙型肝炎病毒除引起肝脏功能受损外还会引起许多肝外疾病，如：代谢综合征、冷沉球蛋白血症、淋巴瘤、自身免疫性疾病、高丙种球蛋白血症、迟发性皮肤卟啉病、涎腺炎和心肌病等，2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是HCV诱发代谢综合征中的一种[5]。Cuadros D F等[6]通过大型调查发现并证实了HCV感染和糖尿病之间存在关联。在瑞典进行的一项以全国人口为基础的研究中，2型糖尿病是慢性丙型病毒性肝炎患者肝外疾病的第2大危险因素[7]。本研究共收集294例慢性丙型肝炎患者，其中70例患有2型糖尿病，慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C ，CHC）患者中2型糖尿病检出率为23.8%，这比Rouabhia S等[8]发现丙型肝炎合并2型糖尿病患病率33.5%低，但比Yuan M等[9]发现HCV感染患者中患2型糖尿病患病率为8.16%高，可能与各地经济、社会、文化差异有关。一项HCV和T2DM相关性的Meta分析发现，CHC患者更容易发展为T2DM，CHC患者中T2DM的患病率约为13%～33%[10]，笔者的研究结果在此范围。
Ali S A等[11]结果显示，丙型肝炎合并糖尿病和丙型肝炎不合并糖尿病组的ALT、AST均高于健康对照组，差异具有统计学意义（P < 0.05），这是因为HCV感染后会在人体肝细胞内大量复制，造成细胞质内的酶释放入血流，使血清中这些酶的活性增高，引起患者肝脏受损、肝功能异常[12]，笔者得出的结果在CHC患者中ALT、AST数值比单纯不合并丙肝的2型糖尿病患者高，且差异有统计学意义（P < 0.05），因此CHC患者与单纯不合并丙肝的2型糖尿病患者相比肝功能更差，需要注意对丙肝患者肝脏的保护，防止进一步恶化诱发一系列肝外表现。邓舒妮等[13]的研究发现慢性丙型病毒性肝炎合并糖尿病与不合并糖尿病患者的ALT、AST、ALP指标，差异无统计学意义（ P > 0.05），郭异凡等[14] 单因素分析也发现ALT、AST、ALP，差异无统计学意义（ P > 0.05），这与本研究得出慢性丙型病毒肝炎合并糖尿病与不合并糖尿病患者相比，肝功能差异无统计学意义的结果一致。
白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质，浓度为30-50 g/L，90%以上的血清总蛋白和全部的血清白蛋白来自肝脏合成[15]。Saad Y等[16]的研究发现HCV感染患者晚期肝纤维化，导致肝脏产生白蛋白能力比健康对照组降低，这与笔者得出的结论慢性丙型病毒肝炎合并糖尿病及不合并糖尿病患者与单纯不合并丙肝的2型糖尿病患者相比有较低的血清白蛋白一致。由于CHC患者肝脏产生白蛋白减少，导致球蛋白相对增多，而总蛋白保持相对稳定，所以CHC患者与单纯不合并丙肝的2型糖尿病患者相比有较高的血清球蛋白，总蛋白差异无统计学意义（P > 0.05）。慢性丙型病毒肝炎合并糖尿病与不合并糖尿病患者的白蛋白、球蛋白差异无统计学意义（P > 0.05），说明糖尿病可能并不会加重CHC患者肝脏产生蛋白的能力。
慢性HCV感染患者的TC、LDL-C和TG水平低于非感染患者，当HCV被清除后低血脂血症会消失[17]。Dai C Y等[18]做了一项研究，通过统计分析得出患有丙肝的患者TC、TG、LDL-C比健康对照组水平显著降低。Marzouk D等[19]研究发现，慢性HCV感染患者的TC和LDL-C水平低于非感染患者，2组患者的HDL-C水平大致相同。病毒导致的低脂血症可能与HCV感染后抑制了微粒体甘油三酸酯转移蛋白的活性，使极低密度脂蛋白组装减少，导致不能把肝内过多的甘油三酯转移出去，血清中的脂质减少，使肝脏中甘油三酯积累增加，从而发生肝脂肪变性，引起肝源性糖尿病的发生[20]。这与笔者得出TC、TG、LDL-C数值在CHC与单纯不合并丙肝的2型糖尿病患者相比偏低且差异有统计学意义（P < 0.05），而HDL-C在CHC与单纯不合并丙肝的2型糖尿病患者中，差异无统计学意义（P > 0.05）的结果基本一致。
UA在丙肝合并糖尿病与丙肝不合并糖尿病患者有统计学差异（P < 0.05），且水平高于丙肝不合并糖尿病患者，说明糖尿病可以加重丙肝患者血清中尿酸浓度。丙肝合并糖尿病与单纯不合并丙肝的2型糖尿病患者，差异无统计学意义（P > 0.05），丙肝不合并糖尿病与单纯不合并丙肝的2型糖尿病患者，差异有统计学意义（P < 0.05）且单纯不合并丙肝的2型糖尿病患者血尿酸水平比丙肝不合并糖尿病患者高，但3组UA平均数值均未达到高尿酸血症诊断标准。说明糖尿病可能会使正常人血尿酸水平升高，而与丙肝病毒感染无关，但笔者没有具体进行这方面研究。BUN、CR在3组间均无统计学意义，说明糖尿病不会使丙肝患者BUN、CR水平升高，且单纯丙肝病毒感染不会引起BUN、CR数值升高，表明对于CHC患者，丙型肝炎病毒感染不会引起肾功能严重受损。
欧阳清慧等[21]研究发现性别、饮酒在丙肝合并糖尿病与不合并糖尿病组间无统计学意义（P > 0.05），丁月荷[22]的研究发现在丙肝合并糖尿病与不合并糖尿病的2组中性别、地区、饮酒，差异无统计学意义（P > 0.05），与笔者得出的慢性丙肝合并糖尿病与不合并糖尿病组在性别、地区、饮酒，差异无统计学意义（P > 0.05）结果一致。慢性丙肝合并糖尿病患者与单纯不合并丙肝的2型糖尿病患者相比，丙肝合并糖尿病患者人数的农村比例较高，饮酒者人数比例也较高。同样地，慢性丙肝不合并糖尿病与单纯不合并丙肝的2型糖尿病患者相比，丙肝不合并糖尿病患者人数的农村比例较高，饮酒者人数比例也较高。表明慢性丙型病毒性肝炎合并或不合并糖尿病与单纯不合并丙肝的2型糖尿病患者相比其患病率农村高于城市，饮酒者多于不饮酒者，提示要重视对农村饮酒患者的丙型病毒性肝炎的防治。
邵辉等[23]研究发现慢性丙型肝炎合并糖尿病患者中年龄大于60岁的人数多于小于60岁。笔者得出的结果是大于60岁年龄组和50～60岁年龄组慢性丙型肝炎合并糖尿病人数多于小于40岁年龄组且差异有统计学意义（P < 0.05），说明丙肝患者中年龄越大越容易合并糖尿病。同时，笔者的研究发现大于60岁年龄组和50～60岁年龄组单纯不合并丙肝2型糖尿病患病人数也多于小于40岁年龄组且差异有统计学意义（P < 0.05），Nguyen C T等[24]通过Mtea分析也证实了这一观点，年龄的增长与2型糖尿病的患病率呈正相关，表明随着年龄的增长，2型糖尿病的发病率逐渐增加，提示年龄是2型糖尿病的危险因素，年龄越大的人需要更加重视血糖的管理。
多元Logistic回归分析显示，丙肝合并糖尿病与丙肝不合并糖尿病患者相比，年龄越大越易合并糖尿病，年龄增大1岁丙肝合并糖尿病的风险性是年龄减少1岁的1.078倍。陈敬群多因素Logistic回归分析发现：年龄、是否合并脂肪肝为HCV感染者患2型糖尿病的独立影响因素[25]，这是因为随着年龄的增加，肝脏本身的代谢功能下降，加上人们刚从工作岗位进入退休状态，生活、饮食的改变，运动量不断减少，引起体重增加、免疫力下降以致糖代谢紊乱的风险增加，导致2型糖尿病的发生概率上升[26]。丙肝合并糖尿病的患者TBA数值比丙肝不合并糖尿病大，TBA数值增大一个单位其平均风险性增加0.044倍。分析其原因可能为：胆汁酸在肝细胞中由胆固醇合成，随胆汁分泌进入肠道，在肠道中进行肠肝循环被重吸收入肝再次利用，少部分进入血液循环，胆汁酸可以反映肝细胞合成、摄取、分泌、加工转化等功能，动态检测餐后血清TBA水平可以观察急性肝炎的慢性过程或慢性肝炎纤维化过程，它对肝胆系统疾病的灵敏度和特异度高于其他指标[27]。当嗜肝性HCV侵入肝脏后引起肝细胞损害，必然引起胆汁酸代谢异常，导致血总胆汁酸增高，同时HCV感染长期存在严重影响肝细胞正常功能，最终引起肝源性糖尿病的发生。
单纯不合并丙肝的2型糖尿病患者与丙肝不合并糖尿病患者相比，年龄、TG为其独立危险因素，年龄越大越易患有2型糖尿病[28]，年龄增大1岁患2型糖尿病的平均风险增加0.202倍。TG数值增大一个单位患2型糖尿病的风险是减小一个单位的15.963倍。LDH是保护因素，单纯不合并丙肝的2型糖尿病患者的LDH平均值比丙肝不合并糖尿病患者的小，LDH水平增大一个单位患2型糖尿病的平均风险降低了约5%。
丙肝合并糖尿病与单纯不合并丙肝的2型糖尿病患者相比，LDH、性别为其独立危险因素，TG为其保护因素。丙肝合并糖尿病患者的LDH平均值比单纯不合并丙肝的2型糖尿病患者大，并且其增大一个单位后丙肝合并糖尿病患者的患病平均风险增加0.060倍。男性患者人数是女性患者的126倍，说明性别也是影响丙肝合并糖尿病患者的一个重要因素，可能与男性的生活习惯有关，例如：喜欢饮酒、吸烟等，这些暴露都会引起丙肝和2型糖尿病的发生。丙肝合并糖尿病患者的TG水平比2型糖尿病患者低，可能与病毒导致的低脂血症有关，TG增大一个单位丙肝合并糖尿病的患病平均风险降低了约88%。
综上所述，HCV感染会导致肝功能受损，年龄和总胆汁酸是慢性丙肝患者易患2型糖尿病的危险因素，因此临床中年龄越大的丙肝患者越要注意血糖监测，同时加用促进胆汁酸代谢的药物，避免2型糖尿病的发生。
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图 1 M2e-HA2自组装纳米颗粒载体构建
a：M2e片段PCR扩增产物，大小139 bp；b：HA2-ferritin片段PCR扩增产物，大小1 210 bp；C：Hind Ⅲ Ⅰ和Xho Ⅰ酶切验证得到1 296 bp的阳性片段。
Figure 1. Construction of M2e-HA2 self-assembled nanoparticles
图 2 M2e-HA2自组装纳米颗粒表达验证
a：非变性Western blot检测M2e-HA2表达，使用M2抗体，大小在180 kD以上；b：变性Western blot检测M2e-HA2表达，使用M2抗体，大小在48.355 kD。
Figure 2. Validation of expression of M2e-HA2 self-assembled nanoparticles
图 3 M2e-HA2自组装纳米颗粒纯化产物验证
a：非变性PAGE胶考马斯亮蓝染色检测M2e-HA2多聚体，证明产物条带单一；b：非变性Western blot检测M2e-HA2纯化产物，使用M2抗体，大小在180 kD以上；c：变性Western blot检测M2e-HA2纯化产物，使用M2抗体，大小在48.355 kD；d：透射电镜观察M2e-HA2纯化产物，可看到结构稳定大小在100 nm左右的纳米颗粒，标尺大小为200 nm。
Figure 3. Validation of purified products of M2e-HA2 self-assembled nanoparticles
图 4 M2e-HA2自组装纳米颗粒免疫血清学验证
a：变性western blot检测M2e-HA2纯化产物，使用M2e-HA2二免小鼠血清1∶200稀释作为一抗，大小在48.355 kD；b：非变性western blot检测M2e-HA2纯化产物，使用M2e-HA2二免小鼠血清1∶200稀释作为一抗，大小在180 kD以上；c：ELISA检测M2e-HA2二免小鼠血清中特异性抗体水平。分别使用人工合成的M2e多肽片段和HA2多肽片段孵育酶标板检测血清中抗体水平，平均血清稀释度分别为1∶1 066.667 和 1∶1 333.333。
Figure 4. Immune serological validation of M2e-HA2 self-assembled nanoparticles
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