CircRNA EZH2 Promotes Proliferation and Migration of Prostate Cancer Cells by Regulating miR-30c-5p
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摘要:
目的 探究circRNA EZH2通过调控miR-30c-5p对前列腺癌细胞的增殖和迁移的影响及其相关作用机制。 方法 通过TCGA数据库分析circRNA EZH2在前列腺癌组织中的表达差异及生存曲线；转染siRNA敲降前列腺癌LNCaP细胞中的circRNA EZH2表达后，CCK-8实验和划痕实验观察LNCaP细胞增殖和迁移，RT-qPCR和Western blot法测定miR-30c-5p、JAK1和PI3K蛋白的表达。 结果 在前列腺癌组织中circRNA EZH2的表达显著上调（P < 0.0001），且高表达circRNA EZH2的患者生存率降低；沉默circRNA EZH2的LNCaP细胞较正常LNCaP细胞的增殖和迁移能力下降（P < 0.0001），miR-30c-5p表达增高（P < 0.0001），JAK1表达降低（P < 0.0001），PI3K信号受抑制。 结论 EZH2在前列腺癌中高表达，通过调控miR-30c-5p激活PI3K信号通路促进前列腺癌LNCaP细胞的增殖和迁移。 -
关键词:
- 前列腺癌 /
- 环状RNA-EZH2 /
- miR-30c-5p /
- 增殖 /
- 迁移
Abstract:Objective To investigate the effect and related mechanism of circRNA EZH2 on proliferation and migration of prostate cancer cells through miR-30c-5p. Methods The expression difference and survival probability of EZH2 in prostate cancer were analyzed according to TCGA database. SiRNA were transfected to silence EZH2 in prostate cancer LNCaP cells, and proliferation and migration of LNCaP cells were detected by CCK-8 assay and wound healing assay, and the expression of miR-30c-5p, JAK1 and PI3K proteins were determined by RT-qPCR and western blot. Results The expression of EZH2 was up-regulated in prostate cancer tissues, and the survival rate of patients with high expression of EZH2 decreased. Compare with normal LNCaP cells, the proliferation and migration of EZH2-silenced LNCaP cells were decreased, miR-30c-5p expression was increased, JAK1 expression was decreased, and PI3K signal was inhibited. Conclusion EZH2 is highly expressed in prostate cancer and can promote the proliferation and migration of LNCaP cells by regulating miR-30c-5p/JAK1 axis and acting on PI3K signaling pathway. -
Key words:
- Prostate cancer /
- CircRNA EZH2 /
- miR-30c-5p /
- Proliferation /
- Migration
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前列腺癌是全球男性中最常见的癌症之一[1]，转移性前列腺癌的5 a生存率仅为31%，且复发及晚期前列腺癌通常被认为是无法治愈的[2]。在世界较发达地区，前列腺癌的发病率最高[3]，相比之下，亚洲男性的发病率低于全球水平，但前列腺癌仍然是影响男性健康的一个重大医学问题。因此，阐明前列腺癌的基因机制，寻找新的诊断和治疗的生物标志物至关重要。
CircRNA是一类内源性非编码RNA，源自前体mRNA反向剪接，其通过3′ 和5′ 端反向剪接形成共价闭合结构。近年来，在各种生物体中已鉴定出数以千计的circRNA，并发现他们在许多疾病中发挥着关键作用，尤其是癌症，circRNA可以参与癌证的诸多病理生理过程，包括细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡[4-6]。然而，目前有关circRNA在前列腺癌中的报道较少。Wen等[7]发现circRNA EZH2与胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭相关。但circRNA EZH2在前列腺癌中的作用和机制尚不清楚。
微小RNA（miRNA）是一类长度约22个核苷酸的非编码小RNA，在调节细胞周期、细胞增殖和凋亡以及肿瘤发展中起着关键作用。MiR-30c-5p是多种恶性肿瘤进展的关键调控基因，在非小细胞肺癌[8]、大肠癌[9]、胰腺癌[10]等疾病中均有报道。CircRNA和miRNA的相互作用在癌症发生和发展中起重要作用。本研究旨在为解释circRNA EZH2调控miR-30c-5p在前列腺癌中的作用机制提供理论依据，同时将为前列腺癌的诊断和治疗提供新的生物标志物和靶点。
1. 材料与方法
1.1 细胞系及主要试剂
人前列腺癌细胞系LNCaP（货号CL-0143）、人正常前列腺上皮细胞RWPE1（货号CL-0200）、人胚肾细胞HEK-293（货号CL-0001）购自武汉Procell公司；RPMI1640培养基、青链霉素双抗、谷氨酰胺、胎牛血清、胰酶均购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒购自上海东仁化学公司，划痕插件购自德国IBIDI公司；riboFECT™ CP转染试剂购自广州锐博生物公司；circRNA EZH2的siRNA（si-circRNA EZH2）、siRNA阴性对照（si-NC）、miR-30c-5p inhibitors序列由广州锐博生物公司合成；Trizol试剂盒购自美国Life technologies公司，FastKing RT Kit （With gDNase） FastKing cDNA第一链合成试剂盒购自北京天根公司，ECL显影液购自美国Millipore公司；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液均购自碧云天；双荧光素酶报告基因检测试剂盒、JAK1、PI3K抗体购自英国abcam公司；GAPDH抗体、HRP标记的IgG二抗购自美国CST公司。荧光素酶载体购自上海海吉浩格生物科技有限公司；Lipofectamine®3000、购自美国Thermo公司；RNase R购自广州吉赛公司。
1.2 生物信息学分析
在癌症基因组图谱（TCGA）[11]数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）中获取数据对前列腺癌旁和肿瘤组织中的circRNA EZH2表达差异进行分析，中位数作为阈值区分高低表达。用Kaplan-Meier曲线检测circRNA EZH2与前列腺癌进展的时间相关性，起点事件为手术切除；终点事件为死亡；删失数据为失访、死于其他疾病、观察结束时病人尚存活。Logrank法检验及单因素预后分析，Cox风险比例模型多因素预后分析。用starBase v2.0筛选下游靶基因。
1.3 细胞培养及转染
用含10% FBS、1%双抗和1%谷氨酰胺的RPMI 1640培养基，于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养LNCaP细胞。待细胞汇合度达80%时，将细胞接种至6孔培养板，每孔接种5×104个细胞，过夜培养。细胞分为：对照组、阴性对照组、si-circRNA EZH2组、si-circRNA EZH2和miR-30c-5p inhibitors联合应用组。参照riboFECT™ CP转染试剂说明书进行转染。转染前，对照组更换为无双抗的RPMI 1640培养基；阴性对照组更换为含si-NC（50 nM）的RPMI 1640培养基；si-circRNA EZH2组更换为含si-circRNA EZH2（50 nM）的RPMI 1640培养基；si-circRNA EZH2和miR-30c-5p inhibitors联合应用组更换为含si-circRNA EZH2（50 nM）和miR-30c-5p inhibitors的RPMI 1640培养基，继续培养48 h。
1.4 CCK-8法检测细胞增殖能力
接种LNCaP细胞至96孔板内，另接种3孔LNCaP细胞正常培养作为CCK-8对照组，每孔接种2500个细胞，每组3个孔重复。RPMI1640培养基继续培养48 h后，每孔加入10 μLCCK-8试剂，在培养箱内孵育2 h后，于酶标仪450 nm波长下检测吸光度。
1.5 划痕实验检测细胞迁移能力
接种LNCaP细胞至IBIDI插件内，每孔接种5×104个细胞，使用RPMI 1640培养基在37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。待汇合度达80%时，移除划痕插件，于0 h和24 h时间点观察划痕宽度，在倒置显微镜下拍摄记录。
1.6 RT-qPCR检测细胞中相关circRNA、miRNA及JAK1的mRNA表达水平
按照TRIZOL法提取LNCaP细胞中的总RNA，测量RNA浓度后，逆转录合成cDNA第一条链。根据qPCR试剂盒说明书对cDNA进行扩增。引物序列见表1。反应体系为10 μL，反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共进行45个循环。以GAPDH作为circRNA EZH2和JAK1的内参，以U6作为miR-30c-5p的内参，运用2-∆∆Ct法进行定量分析。
表 1 RT-qPCR所需引物序列Table 1. Primer sequences基因 引物序列（5′-3′） circRNA EZH2 Forward Primer：GGACCACAGTGTTACCAGCAT Reversed Primer：GTGGGGTCTTTATCCGCTCAG miR-30c-5p Forward Primer：GCAGTGTAAACATCCTACACTCT Reversed Primer：TCCAGTTTTTTTTTTTTTTTGCTGA JAK1 Forward Primer：ATGTCCTTGTTGAGAGTGA Reversed Primer：CATCCTTGACGGTGTAATAC GAPDH Forward Primer：TGTGGGCATCAATGGATTTGG Reversed Primer：ACACCATGTATTCCGGGTCAAT U6 Forward Primer：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT Reversed Primer：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT 1.7 Western blot实验检测细胞中JAK1和PI3K的表达水平
JAK1信号在癌症中常被激活[12]，于是笔者检测了circRNA EZH2对其是否有调控。加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂，从LNCaP细胞中提取总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行定量。样品中的蛋白采用SDS-PAGE分离并湿转移至PVDF膜上，BSA封闭后加入JAK1（1∶1000）和PI3K（1∶1000）一抗，在4 ℃下孵育过夜。二抗（1∶2000）室温孵育1 h，使用ECL显影液曝光。使用Image J软件测定灰度值。
1.8 双荧光素酶报告基因实验
将circRNA EZH2的野生型（WT）或突变型（MUT）3’-UTR克隆到pGL3启动子荧光素酶载体。按照制造商说明，使用Lipofectamine®3000用miR-30c-5p mimic和circRNA EZH2或其突变体转染HEK-293细胞。48 h后通过双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。
1.9 RNase R处理
总RNA（2 μg）在37 ℃下与3 U/mg RNase R共同孵育15 min。qRT-PCR检测circRNA EZH2的表达。
1.10 统计学处理
通过Graph-Pad Prism 9 软件（GraphPad Software，San Diego，CA）进行 Kolmogorov-Smirnov检验数据的正态性。正态分布的连续性变量均以平均数±标准差（mean ± SD）表示，并通过Graph-Pad Prism 9 软件进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析，如有差异进一步用Tukey's检测两两比较，P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 circRNA EZH2在前列腺癌中高表达
首先通过TCGA数据库评估了circRNA EZH2在499例前列腺癌肿瘤样本和52例癌旁组织中的表达，肿瘤样本中位数为2.504，癌旁组织中位数为1.483，发现circRNA EZH2在前列腺癌组织中显著高表达（P < 0.01，图1A）。此外，对TCGA数据库中的前列腺癌样本进行Kaplan-Meier分析结果显示，前列腺癌患者中，circRNA EZH2表达水平较高的患者（250例）相较于circRNA EZH2表达水平较低的患者（249例）生存率更低（图1B）。RT-qPCR结果显示，circRNA EZH2在前列腺癌LNCaP细胞中的表达较人前列腺上皮细胞RWPE1中更高（P < 0.001，图1C）。这些数据表明circRNA EZH2在前列腺中过表达，并且circRNA EZH2高表达与前列腺癌的进展和不良预后相关。
图 1 CircRNA EZH2在前列腺癌中高表达A：CircRNA EZH2在前列腺癌组织中的表达差异；B：CircRNA EZH2在前列腺癌患者中的生存曲线；C：circRNA EZH2在前列腺癌LNCaP细胞和正常前列腺上皮RWPE1细胞中的表达。*** P < 0.001。Figure 1. circRNA EZH2 in prostate cancer2.2 CircRNA EZH2环状结构的验证
通过RNase R酶切实验，证实了circRNA EZH2具有高度保守的环状结构，结果显示，线性EZH2被RNase R酶切，而circRNA EZH2没有被酶切（P < 0.001），见图2。
图 2 qRT-PCR检测LNCaP细胞总RNA经RNase R处理后circRNA EZH2及线性EZH2的表达***P < 0.001。Figure 2. qRT-PCR detected the expression of circRNA EZH2 and linear EZH2 after RNase treatment total RNA from LNCaP cells2.3 敲降circRNA EZH2抑制前列腺癌细胞增殖和迁移
在LNCaP细胞中通过转染si-circRNA EZH2成功下调circRNA EZH2的表达，且转染si-NC未改变circRNA EZH2的表达（P < 0.0001，图3A）。CCK-8检测表明，转染si-circRNA EZH2可抑制LNCaP细胞的增殖（P < 0.0001，图3B），使其生长密度降低（图3D）。此外，划痕实验表明，转染si-circRNA EZH2后，LNCaP细胞的迁移明显减弱（P < 0.0001，图3C、3E）。以上数据表明，circRNA EZH2促进LNCaP细胞的增殖和迁移。
图 3 CircRNA EZH2对前列腺癌细胞增殖和迁移的影响A：circRNA EZH2的RT-qPCR结果分析图；B：CCK-8实验结果；D：LNCaP细胞生长情况图；C和E：LNCaP细胞划痕实验及其结果分析。****P < 0.0001。Figure 3. The effects of circRNA EZH2 on proliferation and migration of prostate cancer cells2.4 circRNA EZH2靶向调控miR-30c-5p
通过CircBase、StarBase等数据库进行预测发现circRNA EZH2具有hsa-miR-30c-5p结合位点，推测circRNA EZH2可能与miR-30c-5p有相互作用（图4A）。双荧光素酶报告基因实验显示，miR-30c-5p显著降低了WT-circRNA EZH2的荧光素酶活性（P < 0.0001，图4B）。通过RT-qPCR实验对miR-30c-5p抑制剂效果进行验证，结果显示与对照组和过表达组相比，miR-30c-5p抑制剂显著降低了miR-30c-5p 的表达（P < 0.001，图4C）。RT-qPCR实验显示，在转染si-circRNA EZH2的LNCaP细胞中miR-30c-5p表达显著上调，转染si-circRNA EZH2和miR-30c-5p 抑制剂后，miR-30c-5p的表达与仅转染si-circRNA EZH2组相比明显降低（P < 0.0001，图4D）。而circRNA EZH2的表达受miR-30c-5p抑制剂影响不明显（P < 0.0001，图4E），猜测miR-30c-5p可能是circRNA EZH2的下游靶基因。
图 4 CircRNA EZH2靶向miR-30c-5pA：circRNA EZH2和miR-30c-5p的配对序列；B：双荧光素酶报告基因检测WT/MUT-circRNA EZH2插入的报告基因和miR-30c-5p mimic及其阴性对照共转染LNCaP细胞后的荧光素酶活性；C：RT-qPCR实验检测miR-30c-5p抑制剂的干扰效果；D：miR-30c-5p的RT-qPCR结果分析；E：circRNA EZH2的RT-qPCR结果分析。**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.0001。Figure 4. CircRNA EZH2 targeted miR-30c-5p2.5 circRNA EZH2/miR-30c-5p轴调控前列腺癌细胞增殖和迁移
CCK-8（P < 0.0001，图5A）和细胞培养显微镜观察（图5B）显示，miR-30c-5p抑制剂的加入下调了转染si-circRNA EZH2对LNCaP细胞增殖的抑制，且细胞增殖能力恢复至较control组和si-NC组无显著差异。此外，LNCaP细胞的迁移能力也在抑制miR-30c-5p后恢复（P < 0.0001，图5C、5D）。上述实验结果说明circRNA EZH2可以通过调控miR-30c-5p的表达来调控LNCaP细胞增殖和迁移。
图 5 CircRNA EZH2调控miR-30c-5p轴对前列腺癌细胞增殖和迁移的影响A：CCK-8实验结果；B：LNCaP细胞生长情况图； C和D：LNCaP细胞划痕实验及其结果分析。*P < 0.05；****P < 0.0001。Figure 5. CircRNA EZH2 regulated cell proliferation and migration via miR-30c-5p in prostate cancer cell2.6 circRNA EZH2调控JAK1和PI3K信号通路
RT-qPCR结果显示（P < 0.0001，图6A），si-circRNA EZH2的转染使JAK1的表达显著下调，而si-circRNA EZH2转染后加入miR-30c-5p抑制剂使JAK1的表达相较于仅转染si-circRNA EZH2组显著上调，Western blot实验也得到同样的结果（P < 0.0001，图6B、6C）。Western blot结果显示，转染si-circRNA EZH2后PI3K的表达下调，而同时转染si-circRNA EZH2和miR-30c-5p抑制剂后PI3K的表达水平高于仅转染si-circRNA EZH2组（P < 0.005，图6B、6D）。这表明PI3K信号与circRNA EZH2的高表达正相关，且受miR-30c-5p的负调控。
图 6 CircRNA EZH2对JAK1和PI3K的调控A：JAK1的RT-qPCR结果分析；B-D：JAK1和PI3K的western blot及其结果分析。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.0001。Figure 6. CircRNA EZH2 regulated JAK1 and PI3K3. 讨论
CircRNA丰富而保守，而且与大多数其他线性RNA相比，circRNA更加稳定，因此circRNA可作为有效的生物标志物和治疗靶点。目前关于circRNA EZH2的研究较少，在已有报道中，circRNA EZH2能通过NF-κB通路调节猪肠上皮细胞的炎症反应[13]；circRNA EZH2在胶质瘤中可作为miR-1265的海绵调控DDAH1和CBX3的表达[14]。因此，circRNA EZH2的失调可能在调节人类癌症的进展中起重要作用。本研究中，笔者发现circRNA EZH2在前列腺癌组织中高表达，并证明circRNA EZH2在前列腺癌细胞中过表达且与癌症发展相关。Kaplan-Meier分析表明，circRNA EZH2过表达与前列腺癌患者的生存率降低显著相关。功能缺失实验表明，circRNA EZH2在前列腺癌细胞中促进其增殖和迁移。在机制上，circRNA EZH2通过调控miR-30c-5p来调控JAK1的表达并激活PI3K信号通路。这些发现为了解circRNA EZH2在前列腺癌进展中的致癌作用提供了见解，并表明circRNA EZH2可能是前列腺癌预后和治疗的生物标志物。
已经证明，circRNA可以和miRNA相互作用，以发挥生物学功能。笔者的结果证明，circRNA EZH2能够调控miR-30c-5p的表达，进而调控下游基因JAK1的表达，促进前列腺癌生长。JAK1是Janus激酶家族成员之一，在多种类型的细胞中表达。它在许多肿瘤，包括前列腺癌的发展中有重要作用，并在转移性癌症进展中起关键作用[12]。在笔者的实验中，沉默circRNA EZH2能下调JAK1的mRNA和蛋白表达，这表明circRNA EZH2可能作为一种JAK1抑制剂在前列腺癌的治疗中发挥作用。
本研究本研究的另一个重要发现是circRNA EZH2可以激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信号。PI3K的信号传导与人类肿瘤进展、肿瘤微血管密度增加以及癌细胞的趋化性和侵袭潜力显著相关，PI3K的突变在常见的人类癌症中经常发生[15]，被认为是癌症治疗的关键靶点之一。笔者推测circRNA EZH2在前列腺癌中的调控作用可能与PI3K信号有关，并在LNCaP细胞中检测了circRNA EZH2是否对PI3K信号有影响。PI3K信号通路在许多癌症的发展中起着关键作用，在前列腺癌中也经常被异常激活，尤其是在转移性前列腺癌中[16]。PI3K信号的过度激活促进了前列腺癌的增殖，转移和复发。例如，miR-133a-3p下调激活的PI3K信号能促进前列腺癌骨转移[17]。雄激素剥夺疗法是治疗前列腺癌的一种主要方法，然而，大多数患者会对雄激素剥夺产生抵抗力，从而导致肿瘤持续生长，患者死亡率上升[18]。PI3K信号通路的激活能够重新连接雄激素受体的信号传导，从而减少肿瘤对雄激素的需求，以促进前列腺癌生长[19]。笔者发现circRNA EZH2的抑制下调了PI3K信号的表达，相反的是，miR-30c-5p的抑制激活了PI3K信号。这些结果阐明了circRNA EZH2可作为PI3K通路的调节剂，并可作为干预前列腺癌的潜在靶标。
总而言之，本研究发现circRNA EZH2在前列腺癌组织中上调，并有助于前列腺癌进展。circRNA EZH2的缺失可影响miR-30c-p的功能，下调JAK1表达并干扰PI3K信号通路，从而抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移。综上，circRNA EZH2可能作为前列腺癌过程中的致癌基因，为前列腺癌的诊断和治疗提供潜在靶标。
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图 1 CircRNA EZH2在前列腺癌中高表达
A：CircRNA EZH2在前列腺癌组织中的表达差异；B：CircRNA EZH2在前列腺癌患者中的生存曲线；C：circRNA EZH2在前列腺癌LNCaP细胞和正常前列腺上皮RWPE1细胞中的表达。*** P < 0.001。
Figure 1. circRNA EZH2 in prostate cancer
图 2 qRT-PCR检测LNCaP细胞总RNA经RNase R处理后circRNA EZH2及线性EZH2的表达
***P < 0.001。
Figure 2. qRT-PCR detected the expression of circRNA EZH2 and linear EZH2 after RNase treatment total RNA from LNCaP cells
图 3 CircRNA EZH2对前列腺癌细胞增殖和迁移的影响
A：circRNA EZH2的RT-qPCR结果分析图；B：CCK-8实验结果；D：LNCaP细胞生长情况图；C和E：LNCaP细胞划痕实验及其结果分析。****P < 0.0001。
Figure 3. The effects of circRNA EZH2 on proliferation and migration of prostate cancer cells
图 4 CircRNA EZH2靶向miR-30c-5p
A：circRNA EZH2和miR-30c-5p的配对序列；B：双荧光素酶报告基因检测WT/MUT-circRNA EZH2插入的报告基因和miR-30c-5p mimic及其阴性对照共转染LNCaP细胞后的荧光素酶活性；C：RT-qPCR实验检测miR-30c-5p抑制剂的干扰效果；D：miR-30c-5p的RT-qPCR结果分析；E：circRNA EZH2的RT-qPCR结果分析。**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.0001。
Figure 4. CircRNA EZH2 targeted miR-30c-5p
图 5 CircRNA EZH2调控miR-30c-5p轴对前列腺癌细胞增殖和迁移的影响
A：CCK-8实验结果；B：LNCaP细胞生长情况图； C和D：LNCaP细胞划痕实验及其结果分析。*P < 0.05；****P < 0.0001。
Figure 5. CircRNA EZH2 regulated cell proliferation and migration via miR-30c-5p in prostate cancer cell
图 6 CircRNA EZH2对JAK1和PI3K的调控
A：JAK1的RT-qPCR结果分析；B-D：JAK1和PI3K的western blot及其结果分析。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.0001。
Figure 6. CircRNA EZH2 regulated JAK1 and PI3K
表 1 RT-qPCR所需引物序列
Table 1. Primer sequences
基因 引物序列（5′-3′） circRNA EZH2 Forward Primer：GGACCACAGTGTTACCAGCAT Reversed Primer：GTGGGGTCTTTATCCGCTCAG miR-30c-5p Forward Primer：GCAGTGTAAACATCCTACACTCT Reversed Primer：TCCAGTTTTTTTTTTTTTTTGCTGA JAK1 Forward Primer：ATGTCCTTGTTGAGAGTGA Reversed Primer：CATCCTTGACGGTGTAATAC GAPDH Forward Primer：TGTGGGCATCAATGGATTTGG Reversed Primer：ACACCATGTATTCCGGGTCAAT U6 Forward Primer：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT Reversed Primer：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT 
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