Effects of MMP-1 and MMP-7 on Pulmonary Hypertension in Rats
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摘要:
目的 探究MMP-1和MMP-7在肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）发展中的作用。 方法 采用ELISA检测PAH患者血清中的MMPs（MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-10、MMP-14）的含量并选择出2种MMPs进行动物体内实验。收集临床信息并比较PAH患者和健康人的体重指数（body mass index， BMI）、NYHA心功能等级、6 min步行距离（6 min walking distance，6MWD）、脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）、平均肺动脉压（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）、甘油三酯（triglyceride，TGs）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、血红蛋白（hemoglobin，HB）、心率（heart rate，HR）等指标的差异。采用野百合碱诱导PAH大鼠模型，然后使用过表达MMP-1质粒和shMMP-7质粒分别上调和下调PAH大鼠中MMP-1和MMP-7的表达。通过苏木精-伊红染色法 （ hematoxylin-eosin staining，HE）观察肺动脉病理变化，Masson染色观察肌纤维和胶原纤维的变化，免疫荧光检测α-SMA和VWF，对左心室、右心室和室间隔进行称重后计算右心室肥厚指数。 结果 与健康人相比，PAH患者血清中的MMP-1（P < 0.0001）、MMP-2（P < 0. 001）、MMP-7（P < 0.01）、MMP-9（P < 0.001）、MMP-10（P < 0.001）、MMP-14（P < 0.01）含量升高，6MWD降低（P < 0.05），BNP含量升高（P < 0.001），NYHA分级升高（P < 0.0001）。与对照组相比，PAH大鼠的MMP-1（P < 0.0001）和MMP-7（P < 0.0001）在肺组织中蛋白表达升高，右心室肥厚指数增加（P < 0.0001），肺动脉血管增厚（P < 0.05），胶原纤维沉积增多（P < 0.05），α-SMA（P < 0.05）和VWF（P < 0.05）在血管中表达增多。与PAH组相比，在PAH大鼠中过表达MMP-1促进PAH发展，而干扰MMP-7则延缓其发展。 结论 MMPs（MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-10、MMP-14）在肺动脉高压患者血清中升高。MMP-1和MMP-7促进肺动脉高压大鼠模型的肺动脉血管重塑、肺纤维化和右心室功能不全。 Abstract:Objective To explore the effects of MMP-1 and MMP-7 on pulmonary arterial hypertension （PAH）. Methods The contents of MMPs （MMP-1, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-10, MMP-14） in the serum of PAH patients and healthy controls were detected and two MMPs were selected for in vivo experiments. Clinical information was collected and body mass index （BMI）, NYHA cardiac function class, 6 min walking distance （6MWD）, brain natriuretic peptide （BNP）, mean pulmonary arterial pressure （mPAP）, triglyceride （TGs）, low-density lipoprotein （LDL）, total cholesterol （TC）, hemoglobin （HB）, heart rate （HR） were compared between PAH patients and healthy controls. The PAH rat model was induced by monocrotaline, and then MMP-1 overexpression plasmid and shMMP-7 plasmid were used to up-regulate and down-regulate the expression of MMP-1 and MMP-7, respectively. Hematoxylin-eosin （HE） staining was used to observe the pathological of PAH, Masson staining was used to observe the changes of muscle fibers and collagen fibers, and immunofluorescence was used to detect the expression of α-SMA and VWF. The left ventricle, right ventricle and interventricular septum were weighed and the right ventricular hypertrophy index was calculated. Results The serum levels of MMP-1 （P < 0.0001）, MMP-2 （P < 0.001）, MMP-7 （P < 0.01）, MMP-9 （P < 0.001）, MMP-10 （P < 0.001） and MMP-14 （P < 0.01） in PAH patients were significantly higher than those in healthy controls. 6MWD was significantly decreased （P < 0.05）, BNP level was increased （P < 0.001）, NYHA class was increased （P < 0.0001）. Compared with the control group, the protein expression of MMP-1 （P < 0.0001） and MMP-7 （P < 0.0001） in lung tissue, right ventricular hypertrophy index （P < 0.0001）, pulmonary artery vascular thickness （P < 0.05）, and collagen fiber deposition （P < 0.05） were increased in PAH rats. The expressions of α-SMA （P < 0.05） and VWF （P < 0.05） in blood vessels were increased in PAH rats than control rats. Compared with PAH group, overexpression of MMP-1 in PAH rats promoted the development of PAH, while interference with MMP-7 delayed its development. Conclusions The serum levels of MMPs （MMP-1, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-10, MMP-14） are increased in patients with PAH. MMP-1 and MMP-7 promote pulmonary artery remodeling, pulmonary fibrosis and right ventricular dysfunction in PAH rats. -
Key words:
- MMP-1 /
- MMP-7 /
- Pulmonary arterial hypertension
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肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一种罕见的致命的心肺疾病，其定义为静息平均肺动脉压为25 mm汞柱或以上[1]。PAH主要表现为血管收缩、原位血栓形成、内膜病变和肺动脉肥厚性重塑，导致肺动脉压力升高[2-3]。血管扩张剂和血管收缩剂、生长抑制剂和促有丝分裂因子以及抗血栓和促血栓决定因素之间的平衡失衡是与PAH相关的潜在发病机制[4-5]。此外，肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）的增殖、肥大以及肺动脉中的胶原沉积是其典型的病理基础[6-7]。
基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一类重要的锌酶家族，在血管的正常重塑和修复过程中负责降解细胞外基质成分。根据其结构和底物特异性，MMPs可分为5个主要亚类:（1）胶原酶（MMP-1、MMP-8和MMP-13）；（2）明胶酶（MMP-2和MMP-9）；（3）基质裂解素（MMP-3、MMP-10、MMP-11）；（4）基质蛋白酶（MMP-7和MMP-26）；（5）膜型（MT）MMP （MMP-14，MMP-15和MMP-16）[8]。MMPs的失调可能导致PAH中细胞外基质积聚和组织破坏[9]。平滑肌细胞和巨噬细胞可产生MMPs，如MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9降解的ECM成分，促进血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）增殖和迁移，导致血管僵硬度增加或肺动脉顺应性降低[10-11]。在PAH动物模型中，微阵列分析显示MMP-2，8，9，10，11，12和20参与了野百合碱（monocrotaline，MCT）诱导的大鼠的细胞外基质调节[12]。因此，本研究目的是探究不同亚类MMPs在PAH患者血清中的含量变化以及健康人和患者临床信息差异，并选择对PAH作用尚不明确的MMP-1和MMP-7进行研究。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 临床信息和样本收集
从临床上收集15例肺动脉高压（PAH）患者和16例健康人的血清样本和患者信息，信息包括：年龄、性别、体重指数（body mass index，BMI）、NYHA心功能等级、6 min步行距离（6 min walking distance，6MWD）、脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）、平均肺动脉压（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）、甘油三酯（triglyceride，TGs）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）、总胆固醇（Total cholesterol，TC）、血红蛋白（hemoglobin，HB）、心率（heart rate，HR）。所有信息和血清样本的获取均由本人签署知情同意书。病例纳入标准为：6 min步行距离为100～500 m，WHO肺动脉高压分级为Ⅱ级[13]；NYHA心功能分级为Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ级[14]；急性血管反应实验阴性，且未接受内皮素拮抗剂、前列环素类药物治疗的患者。排除标准为：（1）患者病情不稳定；（2）合并其他系统的病情不稳定的疾病；（3）哺乳、妊娠。临床研究获得昆明市第三人民医院伦理审查委员会批准，批准号为：2017051716。
1.1.2 实验动物
18只8周龄雄性Wistar大鼠，体重200～240 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2019-0010。
1.1.3 主要试剂
大鼠肺大动脉平滑肌细胞（RPASMC）（BNCC359367）购自北纳生物。MMP-7（ab205525）、MMP-1（ab134184）、α-SMA（ab220179）和VWF（ab6994）抗体购自abcam（美国）。shMMP-7质粒和MMP-1过表达质粒购自上海吉满生物。野百合碱（MCT，HY-N0750）购自MCE（美国）。MMP-1（ml038199）、MMP-2（ml058669）、MMP-7（ml026250）、MMP-9（ml058617）、MMP-10（ml026262）、MMP-14（ml026258）等ELISA检测试剂盒购自酶联生物。用于进行qRT-PCR检测的MMP-7和β-actin引物由擎科生物合成，引物序列如下：
MMP-7：Forward：5′-AACAGTCCTAAGTGGCATT-3′，
Reverse：5′-TAAGAACCGAGGCAAGTC-3′；
β-actin：Forward：5′-GCAGGAGTACGATGAGTCCG-3′，
Reverse：5′-ACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3′。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
RPASMC细胞接种于含10%血清和1%青链霉素的DMEM-H完全培养基中并放置在含5% CO2的恒温培养箱中培养。细胞传代方法：弃去旧的培养基，用1 mL PBS清洗细胞后加入1 mL胰酶（0.25% Trypsin + 0.02% EDTA）消化细胞，然后用完全培养基终止消化。将细胞悬液收集到15 mL离心管中进行离心1000 r/min×5 min。去除上清后加入2 mL新的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液平均加入3个T75培养瓶中培养。使用Lipo2000转染试剂将shMMP-7干扰质粒转染入RPASMC细胞中，转染48 h后收集细胞进行检测。
1.2.2 PAH大鼠模型构建
将18只8周龄的Wistar大鼠在SPF动物房适应性饲养7 d后随机分为6组，每组3只大鼠。Wistar大鼠背部皮下注射60 mg/kg MCT构建PAH模型，对照组大鼠背部注射等量生理盐水。PAH+shRNA NC、PAH+shMMP-7 、PAH+pcDNA3.1、PAH+pcDNA3.1-MMP-1等4组的Wistar大鼠分别于MCT注射前48 h、注射后第7天和第14天用气管滴入法给予质粒50 μg/50 μL脂质体混合物。实验完成后进行肺组织取材进行实验检测，大鼠右心室、室间隔和左心室等部位取材后进行称重计算右心室肥厚指数（右心室/（左心室+室间隔）。
1.2.3 ELISA检测
将收集到的临床病人血清用于ELISA检测MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-10、MMP-14等的含量。首先设置空白孔、标准品孔、待测样本孔，向各孔中加入相应的样本混匀，然后向标准品孔和待测样本孔加入酶标试剂100 μL，放置在37 ℃恒温箱中孵育60 min后弃去孔内液体后洗涤并拍干重复5次。依次加入显色剂A和B进行孵育显示15 min，最后向各孔中加入终止液终止反应，并用酶标仪检测450 nm处的吸光度值。根据标准品孔测量的OD值绘制标准曲线并生成方程式用于计算待测样本孔的浓度。
1.2.4 qRT-PCR
用qRT-PCR实验检测RPASMC细胞中MMP-7的干扰效率。使用TRIzol试剂提取RPASMC细胞中总RNA，用分光光度计检测RNA的浓度和260/280值。根据测量的RNA浓度计算后从各个样本中取2 μg总RNA将其反转录为cDNA。以cDNA为模板进行qPCR检测，检测所得的Ct值使用2（-ΔΔCt）进行结果分析计算MMP-7的相对表达量，β-actin作为内参。
1.2.5 Western blot
使用Western blot检测RPASMC细胞中MMP-7和Wistar大鼠肺组织中的MMP-1和MMP-7的蛋白表达水平。使用含1%蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液从RPASMC细胞和肺组织中提取蛋白质，并使用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测细胞和组织中的蛋白浓度。将蛋白变性后使用10% SDS-PAGE电泳用于将不同分子量的蛋白进行分离，将分离的蛋白转印至0.45 μm PVDF膜上。在常温下用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1 h，在4 ℃环境下用MMP-1（1∶1000）和MMP-7（1∶1000）抗体孵育PVDF膜过夜，然后在常温下用二抗（1∶10000）孵育PVDF膜1 h。最后用ECL使目的蛋白显色并化学发光仪进行观察。
1.2.6 HE染色
将4%多聚甲醛固定的肺组织样本使用乙醇脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋和切片。将肺组织切片使用二甲苯和乙醇进行脱蜡和水化。用蒸馏水洗涤切片后用苏木素染色切片5 min。自来水洗涤后用1%盐酸酒精将切片分化2 s，再次用自来水冲洗15 min。在室温下进行伊红染色3 s，使用乙醇脱水、二甲苯透明。最后用中性树胶封片并在显微镜下观察。
1.2.7 Masson染色
将肺组织切片用二甲苯和乙醇脱蜡和水化后，使用Masson染色试剂盒对切片进行染色。首先用Weigert铁苏木素染色液染色5 min后酸性乙醇分化5 s。Masson蓝化液返蓝5 min并洗涤后用丽春红品红染色液染色5 min，用弱酸工作液洗涤1 min。磷钼酸溶液洗涤1 min后再次用弱酸工作液洗涤。将切片放入苯胺蓝染色液中染色1 min后用弱酸溶液洗涤1 min，用乙醇脱水并用二甲苯透明后中性树胶封片并在显微镜下观察。
1.2.8 IF染色
将肺组织切片放入二甲苯和乙醇中脱蜡和水化后进行抗原修复，用PBS洗涤后在37 ℃下使用5%羊血清封闭切片1 h。用α-SMA（1∶200）和VWF（1∶500）抗体在4 ℃下孵育切片过夜，用二抗标记目的蛋白后加入含DAPI的抗淬灭的封片剂封片。在荧光显微镜下进行观察蛋白表达和分布。
1.3 统计学处理
采用GraphPad Prism 6.0软件作图和统计分析。所有计量资料均服从正态分布，数据表示为“平均值±标准差”，2组间的比较采用Student’s t检验，单因素方差分析如果有差异进一步两两比较采用Turkey’s检验，多组间比较采用One Way-ANOVA分析。以P < 0.05表示差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 MMPs在PAH患者血清中的水平
笔者收集了16例健康者（Ctrl组），15例PAH患者（PAH组）的临床信息进行分析，临床样本的基线资料表见表1。结果显示，与健康对照组相比，PAH患者的BMI、mPAP、HR、TGs、LDL、TC、HB没有明显变化（P > 0.05，图1B，图1E-G），而6MWD降低（P < 0.05，图1A），脑钠肽BNP含量升高（P < 0.001，图1C），NYHA分级升高（P < 0.0001，图1D）。通过ELISA试剂盒检测临床收集的血清中的MMPs水平发现，相比较于Ctrl组，PAH患者血清中MMP-1（P < 0.0001），图2A、MMP-2（P < 0.001），图2B、MMP-7（P < 0.01），图2C、MMP-9（P < 0.001），图2D、MMP-10（P < 0.001），图2E、MMP-14（P < 0.01）升高，图2F。以上结果说明，PAH患者血清中的MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-10、MMP-14的含量均升高，PAH患者的心功能不全。由于MMP-1、MMP-7在PAH中的作用研究尚不明确，因此在此次研究中笔者选择MMP-1和MMP-7进一步探究其对PAH的作用。
表 1 临床PAH患者和健康人的基线资料表[$ \bar x \pm s $ /n（%）]Table 1. Baseline data table of clinical PAH patients and healthy individuals [$ \bar x \pm s $ /n（%）]项目 健康人（n = 16） PAH患者（n = 15） 年龄（岁） 31.69 ± 11.45 69.07 ± 11.11 性别（女性） 10（62.50） 4（26.67） BMI（cm/kg2） 22.13 ± 2.68 23.60 ± 5.49 NYHA心功能等级 0 16（100.00） 0（0.00） 1 0（0.00） 6（40.00） 2 0（0.00） 9（60.00） 6MWD（m） 593.00 ± 69.19 508.67 ± 102.102 BNP（pg/mL） 55.19 ± 15.71 139.13 ± 89.37 mPAP（mmHg） 19.62 ± 1.20 19.86.25 ± 3.46 HR（次/min） ≤80 11（68.75） 10（66.67） > 80 5（31.25） 5（33.33） TGs（mmol/L） 1.74 ± 0.50 1.45 ± 0.99 LDL（mmol/L） 2.71 ± 0.55 2.63 ± 0.70 TC（mmol/L） 3.87 ± 0.55 4.41 ± 0.94 HB（g/L） 135.56 ± 11.37 141.47 ± 20.43 
图 1 健康人和PAH患者临床指标的差异A：比较健康人与PAH组的6MWD差异；B：比较健康人与PAH组的BMI差异；C：比较健康人与PAH组的BNP差异；D：比较健康人与PAH组的NYHA分级差异；E：比较健康人与PAH组的LDH差异；F：比较健康人与PAH组的TGs差异；G：比较健康人与PAH组的mPAP差异；H：比较健康人与PAH组的HR差异；I：比较健康人与PAH组的HB差异；J：比较健康人与PAH组的TC差异。*P < 0.05，***P < 0.001，****P < 0.0001。Figure 1. Differences of clinical indicators between healthy people and patients with PAH
图 2 Ctrl组与PAH患者血清中MMPs的水平A：ELISA试剂盒检测健康人和PAH患者MMP-1水平；B：ELISA试剂盒检测健康人和PAH患者MMP-2水平；C：ELISA试剂盒检测健康人和PAH患者MMP-7水平；D：ELISA试剂盒检测健康人和PAH患者MMP-9水平；E：ELISA试剂盒检测健康人和PAH患者MMP-10水平；F：ELISA试剂盒检测健康人和PAH患者MMP-14水平。**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。Figure 2. Concentration levels of MMPs in serum of patients with Ctrl group and PAH2.2 RPASMC筛选shMMP-7最佳干扰序列
笔者使用3个shMMP-7序列转染RPASMC细胞后，通过qRT-qPCR 和western blot检测细胞中MMP-7的表达水平，western blot检测结果显示，相比于shRNA NC组3个shMMP-7干扰质粒均可以下调MMP-7蛋白的表达，而2#干扰质粒下调最明显（P < 0.0001），见图3A与3B，而qRT-qPCR检测结果发现，相比于shRNA NC组shMMP-7-2#对MMP-7 mRNA干扰率超过80%（P < 0.0001），见图3C。RT-PCR和Western blot实验结果均说明shMMP-7-2#干扰质粒的干扰效果最佳，将用于动物实验。
图 3 筛选3个shMMP-7干扰质粒对MMP-7蛋白水平和mRNA水平的干扰效率A和B：western blot检测比较3个shMMP-7干扰质粒对MMP-7蛋白表达的干扰效率； C：qRT-PCR检测比较3个shMMP-7干扰质粒对MMP-7 mRNA的干扰效率。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。Figure 3. Interference efficiency of three shMMP-7 interfering plasmids screened on MMP-7 protein level and mRNA level2.3 MMP-1和MMP-7对PAH的作用
笔者使用MCT构建PAH大鼠模型，并用pcDNA3.1-MMP-1过表达质粒和shMMP-7干扰质粒处理PAH大鼠模型，探究MMP-1和MMP-7对PAH的作用。将大鼠的右心室、左心室、室间隔进行称重，计算右心室肥厚指数（右心室/（左心室+室间隔），见图4。与对照组相比，模型组大鼠的右心室肥厚指数升高（P < 0.0001）；与模型组相比，右心室肥厚指数在MMP-7干扰组降低（P < 0.0001）而在MMP-1过表达组升高（P < 0.05）。将大鼠的肺组织取材后进行western blot、HE、Masson、IF等检测。Western blot结果显示（图5A-C），与对照组相比，模型组的MMP-1和MMP-7蛋白表达水平升高（P < 0.0001）；与模型组相比，过表达MMP-1组的MMP-1蛋白表达升高（P < 0.0001），干扰MMP-7组的MMP-7蛋白表达降低（P < 0.0001），说明质粒转染成功。通过HE染色观察肺血管壁厚度（图5D），发现与对照组相比，模型组中的肺血管厚度增加，而上调MMP-1增强了血管厚度变化，下调MMP-7则减弱了血管壁的厚度变化。通过Masson三色染色观察肺中胶原和肌纤维（图5E），与对照组相比，模型组的肺中胶原纤维和肌纤维增多，而与模型组相比下调MMP-7则降低了胶原和肌纤维的含量，上调MMP-1的作用则相反；与模型组相比，上调MMP-1增强了胶原和肌纤维变化，下调MMP-7则减弱了其变化。通过IF检测肺组织中的α-SMA（图6A）和VWF（图6B）表达与分布，与对照组相比，模型组中的α-SMA和VWF表达及分布增加，主要集中于肺血管。过表达MMP-1增强了α-SMA和VWF表达及分布，干扰MMP-7则减弱了α-SMA和VWF表达及分布。
图 4 MMP-1和MMP-7对PAH大鼠模型的右心室肥厚指数的影响*P < 0.05，**P < 0.01，****P < 0.0001。Figure 4. Impacts of MMP-1 and MMP-7 on right ventricular hypertrophy index in a PAH rat model
图 5 MMP-1过表达质粒和MMP-7干扰质粒对PAH的蛋白表达水平和病理作用A-C：western blot检测过表达MMP-1质粒和干扰MMP-7质粒的转染效率； D:HE染色观察MMP-1和MMP-7对PAH的形态学影响（40×）；E:Masson染色观察MMP-1和MMP-7对PAH肌纤维和胶原纤维的影响（40×）。****P < 0.0001。Figure 5. Protein expression levels and pathological effects of MMP-1 overexpression plasmid and MMP-7 interference plasmid on PAH
图 6 MMP-1和MMP-7对PAH中α-SMA和vWF蛋白的表达的影响（40×）A:IF检测PAH中α-SMA的表达和分布；B：IF检测PAH中vWF的表达和分布。Figure 6. Effects of MMP-1 and MMP-7 on α-SMA and vWF protein expression in PAH （40×）3. 讨论
PAH是一组慢性、频繁进展的肺部疾病，具有较高的发病率和病死率[15]。虽然主要的病理改变以肺血管阻力进行性增加为特征，但PAH患者常发展为右心室衰竭（right ventricular failure，RVF）并导致死亡[16-17]。在临床样本研究中发现PAH患者的心功能降低，6MWD降低，BNP含量增加，结果表明PAH患者出现右心功能不全。PAH肺血管阻力增加会导致PAH患者的右心室前负荷增加，右心室经过代偿性肥厚和失代偿性肥厚，最终导致右心衰竭。在动物实验中PAH大鼠模型的研究结果也表明，PAH大鼠右心室肥厚指数比对照组升高。
细胞外基质蛋白的重塑是PAH的重要病理特征之一[18]，这是由ECM成分的合成和蛋白水解之间复杂的相互作用引起的。MMPs是一个根据结构相似性[19]分类的基质降解蛋白酶家族。基质金属蛋白酶也根据底物特异性分为胶原酶（降解纤维胶原）、基质裂解素、膜型基质金属蛋白酶（具有广谱活性）和明胶酶（裂解基底膜成分）。诸多研究报道MMPs促进了动物PAH的进展[20-22]，在PAH动物模型中，MMP-2的水平和活化增加[23]，活性MMP-2可能促进细胞外基质重塑，也可能参与血管平滑肌细胞迁移和增殖[24-25]。MMP9是一种可降解大部分纤维胶原的明胶酶，被认为是细胞外基质分解的标志物，可能在炎症反应和血管生成的控制中发挥重要作用[26-27]。MMP-8是PAH发病过程中肺血管上调的一种新的保护因子，通过改变基质组成和破坏PASMCs中整合素-β3/FAK和YAP/ taz依赖的机械信号来对抗病理机制生物学反馈[28]。多个研究报道的MMP-1在PAH中的作用不一致。Wright等[29]报道，TIMP-1在香烟烟雾诱导的血管重塑和肺动脉高压中表达上调，可抑制间质胶原酶MMP-1，促进成熟胶原纤维的沉积。George等[5]研究发现MMP-1降低了平滑肌细胞的增殖，并防止了胶原蛋白在肺动脉树中的过度沉积。然而，有研究发现MMP-1和MMP-10在PAH患者的血管壁中层、血清和M1型极化的巨噬细胞中升高，在野百合碱和缺氧诱导的PAH啮齿动物模型的肺中也升高[12]。另外，活化的MMP-10过表达通过上调细胞周期蛋白D1和增殖细胞核抗原促进PASMC增殖和迁移，提示浸润巨噬细胞产生的MMP-10参与了血管重塑。Brian Saunders等[30]研究表明，MMP-1的激活是由MMP-10介导的，并且它会诱导人毛细血管管网塌陷，这表明MMP-10通过调节MMP-1的激活，在调节血管细胞行为中起关键蛋白酶的作用。MMP-7可将pro-TNF-α、Syndecan-1和E-cadherin裂解成可溶性形式；可通过释放FAS配体发挥促凋亡作用，并通过肝素结合表皮生长因子发挥抗凋亡作用[31]。此外，MMP-7可能通过降解s-Flt-1和CTGF，释放VEGF-A，从而保护PAH的发展。但是Arvidsson等[32]发现，与健康对照组相比，PAH患者血浆中MMP-7的水平升高，表明其可能参与了PAH的病理生理过程。膜型基质蛋白酶1（MT1-MMP）又名MMP-14，与MT2-MMP一道作为MMP-2的激活剂调节其活性和血管生成[33]。在此次研究中笔者发现PAH患者的血清中MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-10、MMP-14的含量升高。MMP-2和MMP-9在PAH中的作用已经研究较充分。MMP-1、MMP-7、在PAH中的作用尚不明确。因此，在本次研究中笔者选择MMP-1和MMP-7进行研究二者在PAH中的作用。
PAH的发病机制包括内皮血管生成、平滑肌细胞增殖和肥大、外膜成纤维细胞增殖、肌成纤维细胞分化和细胞外基质（ECM）沉积[34]。笔者在PAH大鼠模型中研究发现，与对照组相比，PAH组的肺组织中MMP-1和MMP-7蛋白表达升高，这与临床患者血清中表达结果一致。笔者通过HE染色、 Masson染色、IF检测观察血管重塑和胶原沉积以及相关蛋白的表达，发现肺动脉血管增厚，肌纤维增生伴肥大，大量胶原纤维沉积在血管外周，α-SMA和vWF表达增加，主要分布在血管。与PAH组相比，上调MMP-1可以促进PAH的血管重塑和纤维化，而下调MMP-7延缓了PAH的进展。因此，MMP-1和MMP-7在PAH的发展过程中发挥促进作用。
综上所述，本研究表明MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-10、MMP-14在PAH患者血清中含量增加，可能促进PAH的恶性表型。另外，在PAH大鼠模型，MMP-1和MMP-7促进PAH发展并导致右心室肥厚。该项研究可能为MMP-1和MMP-7成为PAH诊断的潜在指标提供理论基础。
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图 1 健康人和PAH患者临床指标的差异
A：比较健康人与PAH组的6MWD差异；B：比较健康人与PAH组的BMI差异；C：比较健康人与PAH组的BNP差异；D：比较健康人与PAH组的NYHA分级差异；E：比较健康人与PAH组的LDH差异；F：比较健康人与PAH组的TGs差异；G：比较健康人与PAH组的mPAP差异；H：比较健康人与PAH组的HR差异；I：比较健康人与PAH组的HB差异；J：比较健康人与PAH组的TC差异。*P < 0.05，***P < 0.001，****P < 0.0001。
Figure 1. Differences of clinical indicators between healthy people and patients with PAH
图 2 Ctrl组与PAH患者血清中MMPs的水平
A：ELISA试剂盒检测健康人和PAH患者MMP-1水平；B：ELISA试剂盒检测健康人和PAH患者MMP-2水平；C：ELISA试剂盒检测健康人和PAH患者MMP-7水平；D：ELISA试剂盒检测健康人和PAH患者MMP-9水平；E：ELISA试剂盒检测健康人和PAH患者MMP-10水平；F：ELISA试剂盒检测健康人和PAH患者MMP-14水平。**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。
Figure 2. Concentration levels of MMPs in serum of patients with Ctrl group and PAH
图 3 筛选3个shMMP-7干扰质粒对MMP-7蛋白水平和mRNA水平的干扰效率
A和B：western blot检测比较3个shMMP-7干扰质粒对MMP-7蛋白表达的干扰效率； C：qRT-PCR检测比较3个shMMP-7干扰质粒对MMP-7 mRNA的干扰效率。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。
Figure 3. Interference efficiency of three shMMP-7 interfering plasmids screened on MMP-7 protein level and mRNA level
图 4 MMP-1和MMP-7对PAH大鼠模型的右心室肥厚指数的影响
*P < 0.05，**P < 0.01，****P < 0.0001。
Figure 4. Impacts of MMP-1 and MMP-7 on right ventricular hypertrophy index in a PAH rat model
图 5 MMP-1过表达质粒和MMP-7干扰质粒对PAH的蛋白表达水平和病理作用
A-C：western blot检测过表达MMP-1质粒和干扰MMP-7质粒的转染效率； D:HE染色观察MMP-1和MMP-7对PAH的形态学影响（40×）；E:Masson染色观察MMP-1和MMP-7对PAH肌纤维和胶原纤维的影响（40×）。****P < 0.0001。
Figure 5. Protein expression levels and pathological effects of MMP-1 overexpression plasmid and MMP-7 interference plasmid on PAH
图 6 MMP-1和MMP-7对PAH中α-SMA和vWF蛋白的表达的影响（40×）
A:IF检测PAH中α-SMA的表达和分布；B：IF检测PAH中vWF的表达和分布。
Figure 6. Effects of MMP-1 and MMP-7 on α-SMA and vWF protein expression in PAH （40×）
表 1 临床PAH患者和健康人的基线资料表[
$ \bar x \pm s $ /n（%）]Table 1. Baseline data table of clinical PAH patients and healthy individuals [
$ \bar x \pm s $ /n（%）]项目 健康人（n = 16） PAH患者（n = 15） 年龄（岁） 31.69 ± 11.45 69.07 ± 11.11 性别（女性） 10（62.50） 4（26.67） BMI（cm/kg2） 22.13 ± 2.68 23.60 ± 5.49 NYHA心功能等级 0 16（100.00） 0（0.00） 1 0（0.00） 6（40.00） 2 0（0.00） 9（60.00） 6MWD（m） 593.00 ± 69.19 508.67 ± 102.102 BNP（pg/mL） 55.19 ± 15.71 139.13 ± 89.37 mPAP（mmHg） 19.62 ± 1.20 19.86.25 ± 3.46 HR（次/min） ≤80 11（68.75） 10（66.67） > 80 5（31.25） 5（33.33） TGs（mmol/L） 1.74 ± 0.50 1.45 ± 0.99 LDL（mmol/L） 2.71 ± 0.55 2.63 ± 0.70 TC（mmol/L） 3.87 ± 0.55 4.41 ± 0.94 HB（g/L） 135.56 ± 11.37 141.47 ± 20.43 
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