Molecular Epidemiological Investigation of the Fourth Human Case of Eurasian Avian-like H1N1 Swine Influenza Virus Infection in Yunnan Province
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摘要:
目的 对2022年云南省境内发现的1例（全省第4例）欧亚类禽猪流感病例进行分子流行病学调查，掌握其基因特征，揭示该新亚型欧亚类禽猪流感病毒对人类健康潜在影响。 方法 使用实时荧光定量PCR检测技术对病例的咽拭子标本、密切接触者和居住环境标本进行核酸检测。使用MDCK细胞进行阳性标本病毒分离，使用豚鼠血红细胞凝集实验和实时荧光定量RT-PCR方法对细胞培养物进行鉴定。通过Illumina Miseq二代基因测序平台进行全基因组测序，使用MEGA7.0软件构建系统发育树并分析其基因分子特征。 结果 成功分离云南省首例G5基因型欧亚类禽猪流感病毒，并获得该病毒全基因组序列。该病毒具有在哺乳动物的适应性或毒力、传播性增强的相关分子特征，与江苏分离的一株猪源毒株序列具有99.2%～99.7%的核苷酸一致性。该病毒在人群中传播的风险进一步增加。 结论 加强猪流感监测工作对于预防可感染人类的新型流感病毒亚型具有重要意义。 -
关键词:
- 欧亚类禽H1NI猪流感 /
- 二代测序 /
- 系统发育分析 /
- 氨基酸特征
Abstract:Objective To conduct a unique and pioneering molecular epidemiological investigation of a case of Eurasian avian-like H1N1 swine influenza identified in Yunnan Province in 2022 （the fourth such case in the province） and to understand its genetic characteristics so as to reveal its potential impact on human health. Methods Real-time fluorescent quantitative PCR detection technology was used for the nucleic acid testing of the case's pharyngeal swab samples, close contacts, and environmental samples from the living area. Positive samples were subjected to virus isolation using MDCK cells. Cell cultures were authenticated using erythrocyte agglutination assay with guinea pig blood and real-time fluorescence quantitative RT-PCR. Whole genome sequencing was performed using the Illumina MiseqNext-generation sequencing platform, and a phylogenetic tree was constructed using MEGA 7.0 software to analyze the genetic molecular characteristics. Results The first G5 genotype Eurasian avian-like H1N1 swine influenza virus in Yunnan Province was successfully isolated, and the whole genome sequence of the virus was obtained. This virus possessed the molecular characteristics associated with increased adaptability, virulence, or transmissibility in mammals and had a nucleotide consistency of 99.2%～99.7% with a porcine strain isolated in Jiangsu province. These findings underscored the potential threat this virus poses to human health. Conclusion The study underscores the importance of further monitoring swine influenza in preventing new influenza virus subtypes that can infect humans. -
流感病毒每年都会在人群中流行，并因进化过程中不断发生的抗原漂移、抗原转换和基因重组而产生新的毒株，从而导致零星的大流行发生[1]，不仅夺走了数百万人的生命，而且给公共卫生和科学界带来挑战。猪因其吸道上皮细胞中同时包含禽类受体（α-2，3-唾液酸受体）和类人受体（α-2，6-唾液酸受体），因而被认为是流感病毒的中间宿主[2]，当感染多个共流行的病毒时，病毒间会发生重组，并产生新的重组病毒[3]。一旦新型重组流感病毒在猪群中建立起来，不仅给养猪业造成巨大损失，并可能传播到人群中，引起人类流感暴发和大流行。2009年，一个猪源性的包含来自禽类、猪类和人类基因片段的H1N1大流行（pdm09）病毒的出现[1，4]，进一步强调了猪可以独立促进大流行流感毒株的产生。
欧亚类禽猪流感病毒（Eurasian avian-like H1N1 swine influenza virus，EAH1N1 SIV）是在猪群中主要流行的流感病毒中的一种，是由禽H1N1流感病毒引入猪，并于1979年在比利时的猪群中首次发现并广泛流行[5]。2001年在中国香港特别行政区首次发现欧洲以外的欧亚类禽 H1N1猪流感病毒[6]。之后，EA H1N1 SIV在我国的猪群中占主导地位[7]。据报道，EA H1N1 SIV在猪体内长期进化后可有效传播，并在人群中引起流感大流行[8]。EA H1N1SIV可优先与人类型唾液酸受体结合[8]。现有的研究表明，欧洲、中国大陆和其他亚洲国家已有数例人感染EA H1N1SIV的病例[9−15]及死亡个案[13，16]。在2022年前，云南省先后发现过3起欧亚类禽猪流感感染人事件[14，17]，面临欧亚类禽猪流感公共卫生风险较大。本研究报告了2022年发现的云南省首例人感染三重重组G5型EA H1N1 SIV病例（云南省第4例人感染EA H1N1 SIV病例）。
1. 材料与方法
1.1 样本来源
由临沧市疾控中心送检的1份疑似EA H1N1SIV阳性病例咽拭子，4份密接者咽拭子和35份环境标本。
1.2 实时荧光定量RT-PCR检测
使用江苏硕世全自动核酸提取仪提取标本核酸，按照全国流感监测技术指南（2017版）[18]公布的引物探针进行实时荧光定量RT-PCR检测。反应条件为：60 ℃，20 min；95 ℃，1 min；95 ℃，15 s，60 ℃，30 s，40个循环。
1.3 病毒分离鉴定
核酸检测阳性的原始样本使用 MDCK 细胞37 ℃，5%CO2培养箱孵育进行病毒分离，每天观察CPE，当CPE达到75%～100%的细胞时，置于-80 ℃低温冰箱收获。使用豚鼠血红细胞凝集实验和实时荧光定量RT-PCR方法对细胞培养物进行鉴定。
1.4 病毒基因序列测定
使用西安天隆科技有限公司GeneRotex 96全自动核酸提取仪提取毒株基因组RNA，使用Invitrogen公司（美国）SuperScriptⅢ One-Step RT-PCR with Platinum Taq试剂盒扩增提取的RNA的 8 个节段，PCR 产物按照试剂盒说明书进行纯化（QIAquick 96 PCR Purification Kit），按照Nextera XT DNA Library Preparation Kit 说明书构建测序文库，利用 Illumina Miseq测序平台进行二代测序。
1.5 病毒的遗传进化与分子特征分析
应用GISAID、NCBI下载的参考毒株序列与分离株基因序列进行同源性比对；采用MEGA7.0软件进行序列比对和进化分析，Bootstrap 值
1000 次重复构建neighbor-joining进化树。2. 结果
2.1 流行病学调查
一名既往健康的5岁男孩，无旅居史，于2022年9月19日出现流感样疾病（influenza-like illness，ILI）症状，发烧39.3 ℃，咳嗽伴咽痛和头痛，随后前往医院就诊。使用常规治疗，未服用奥司他韦等抗流感病毒药物情况下，病情未加重并在1周内康复。经问询，患者在出现症状前7d内未与出现ILI症状的个体发生接触，家中圈养饲养鸡、猪等家畜。患者的4位密切接触者均未出现ILI症状。
2.2 样本鉴定、病毒分离和命名
对1份疑似EA H1N1SIV阳性病例和4份密切接触者的咽拭子及35份环境样本拭子进行实时荧光定量RT-PCR检测。结果显示，疑似EA H1N1SIV阳性病例咽拭子结果为EA-H1N1 SIV阳性。密切接触者及外环境标本为阴性。使用MDCK细胞对阳性病例标本进行病毒分离，经37 ℃，5%CO2细胞培养箱孵育48 h后，显微镜下观察到流感病毒典型的细胞病变，见图1，经红细胞凝集和实时荧光定量RT-PCR鉴定确定获得一株流感毒株，命名为：A/Yunnan-Lincang/ASWL01/2022 （H1N1v），简写为“YN/01/22”。
图 1 YN/01/22感染MDCK细胞的病变（cytopathic effects，CPE）情况（164x）A：MDCK细胞对照；B：48 h CPE；C：72 h CPE。Figure 1. Cytopathic effects of MDCK cells infected with YN/01/22（164x）2.3 病毒基因分子特征
通过二代测序平台，获得了YN/01/22的8个基因片段（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS）的全长序列。
全基因的系统发育分析显示， YN/01/22是新型三重重组EA H1N1 SIV病毒，含有来自欧亚禽样猪H1N1 （HA和NA）、A（H1N1）pdm09 （PB2、PB1、PA、NP和M）和经典猪H1N1 （NS）的基因，见图2，属于G5型基因型，见表1。所有8个片段与A/swine/Jiangsu/HD11/2020（JS/HD11/20）的核苷酸有99.2%～99.7%的相同之处，该毒株同样为G5基因型，从江苏的一个屠宰场的一头健康的猪鼻拭子中分离[19]。
图 2 EA H1N1 SIV分离株基因进化树A：PB2基因系统发育树；B：HA基因系统发育树；C：M基因系统发育树；D：NA基因系统发育树；E：NP基因系统发育树；F：NS基因系统发育树；G：PA基因系统发育树；H：PB1基因系统发育树。Figure 2. The genetic phylogenetic tree of EA H1N1 SIV isolate表 1 不同型别的欧亚类禽猪流感基因型分型依据Table 1. Genotyping basis of different types of eurasian avian-like swine influenza genotypes
分离株不同来源的基因片段 HA NA PB2 PB1 PA NP M NS 基因型 A/Jiangsu/1/2011a EA EA EA EA EA EA EA EA 1 A/swine/Hong_Kong/72/2007a EA EA EA EA EA EA EA CS 2 A/Hunan/ 42443 /2015aEA EA PDM PDM PDM PDM EA CS 3 A/swine/Guangdong/ 1361 /2010aEA EA PDM PDM PDM PDM PDM PDM 4 A/Fujian-cangshan/SWL624/2016a EA EA PDM PDM PDM PDM PDM CS 5 A/swine/Guangdong/1/2010a EA EA CS CS CS CS EA CS 6 A/swine/Hong_Kong/ 2421 /2012aEA EA EA EA EA EA PDM EA 7 A/swine/Guangdong/NS2897/2012a EA EA PDM EA PDM PDM PDM EA 8 A/swine/Guangxi/S2/2013a EA EA EA EA PDM PDM EA CS 9 A/swine/Hong_Kong/268/2012a EA EA CS CS CS CS CS CS 10 A/swine/Hong_Kong/201/2010a EA PDM CS CS CS CS CS CS 11 A/Yunnan-Lincang/ASWL01/2022b EA EA PDM PDM PDM PDM PDM CS 5 a：欧亚禽猪流感基因型分型参考株；b：云南临沧人感染欧亚禽猪流感分离株；EA：基因片段来源于欧亚类禽猪流感病毒；CS：基因片段来源于经典猪流感病毒；PDM：基因片段来源于A（H1N1）pdm09流感病毒。 氨基酸位点突变分析结果显示，YN/01/22病毒在哺乳动物的适应性或毒力、传播性和抗病毒抗性方面具有突变位点其相关分子标记，见表2。
表 2 A/Yunnan-Lincang/ASWL01/2022毒株的氨基酸分子特征分析Table 2. The amino acid molecular characteristics of A/Yunnan-Lincang/ASWL01/2022 strain基因 氨基酸
突变位点意义 毒株 CA/07/09 HN/42443/15 GD/1/10 FJ/624/16 JS/HD11/20 YN/01/22 HA E190D
G225D/E病毒受体结合特异性从α-2，
3-唾液酸转变为α-2，6-唾液酸[20]D
DD
EV
ED
ED
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ENA H275Ya
N295Sa神经氨酸酶抑制剂耐药位点 H
NH
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NPB2 L89V
T271A G590S
Q591R
D701N被证明对增加聚合酶活性、
增强病毒复制和传播性至关重要。V
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A
G
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A
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DT588I 除增加哺乳动物细胞中的聚合酶活性外，
还被证明介导干扰素-β表达的抑制T I T T I I 627 宿主特异性的决定因素，
禽流感是E，人类流感是KE E E E E E NS1 P42S
D92E增加哺乳动物病毒毒力或适应性 S
DS
DS
DS
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DM2 S31N 金刚烷胺类抗病毒药物耐药 N N N N N N M1 T215A 增加哺乳动物病毒毒力或适应性 A A A A A A PA L336M
K356R
S409N增加聚合酶活性、增强病毒复制
和传播性至关重要M
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NM
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NL
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NPB1 X99H
I368R物种之间传播 H
IH
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INP Q357K 增加哺乳动物病毒毒力或适应性 K K K K K K a：H1 Numbering。 3. 讨论
EA-H1N1 SIV于2001年开始在中国的猪群中广泛流行，自2002年以来，流行率持续上升[21]，目前已在中国的猪群中占主导地位。2009年人类流感大流行后，EA N1N1、PDM09 H1N1、TRH1N2和CS H1N1 SIV之间发生了复杂而广泛的重组[22−25]，进而产生了不同的基因型。根据EA-H1N1 SIV重组基因型内部基因片段的进化分支分布，中国流行的EA-H1N1 SIV基因型分为11种，见表1[7]，2001～2013年G1型广泛流行，2009～2013年G2和G4型共流行，自2013年起，G3和G5型逐渐成为猪群中的优势基因型。根据同源性和系统进化树分析，本研究报告的G5型EA H1N1 SIV毒株，与同时期猪群中传播的EA H1N1 SIV基因型的流行情况一致，且与猪源性的参考病毒JS/HD11/20紧密聚类相似性最高，进一步支持该病毒由猪向人传播的可能性。根据现有的有限的流行病学信息，未发现YN/01/22毒株的进一步传播，然而这一病例的发现，再次引起了公众对动物流感，尤其是猪流感的关注。
尽管在抗原性和遗传上与人类流感病毒不同[16]，猪流感病毒偶尔也会感染人类。以往的研究表明，EA H1N1 SIV对人类健康威胁巨大：EA H1N1SIV可以通过呼吸道飞沫在雪貂模型中高效传播[8]，血清学证据表明，EA H1N1 SIV在养猪工人和普通人群中的感染率可达10.4%和4.4%[8，10，26]。截止目前，中国共报告9例人感染EA H1N1SIV病毒病例，见表3，其中云南省报告的病例数最多，是否跟云南省所处地理环境和气候条件更适宜EA H1N1SIV生存和传播，或生猪养殖和流通环节的特殊性有关，有待进一步的研究。云南省先前报道的人感染EA H1N1SIV病例有G3[14]和G4[17]型，本研究为云南省首次报告的G5型EA H1N1SIV病例，由于云南省迄今为止缺乏猪群中猪流感病毒的监测数据，因此，是否EA H1N1SIV在云南的猪群中持续传播并不断重组产生新的基因型值得关注。
表 3 中国人感染EA H1N1SIV病例Table 3. The cases infected EA H1N1SIV in China年份 省份 毒株名 基因型 参考文献 2011 江苏 A/Jiangsu/1/2011 1 Yang et al.[10] 2012 河北 A/Hebei-Yuhua/SWL1250/2012 1 Wang et al.[11] 2015 湖南 A/Hunan/ 42443 /20153 Zhu et al.[13] 2015 云南 A/Yunnan-Longyang/SWL1982/2015 3 Zhu et al.[14] 2015 云南 A/Yunnan-Wuhua/SWL1869/2015 3 2016 福建 A/Fujian-Cangshan/SWL624/2016 5 Xie et al.[12] 2018 天津 A/Tianjin-baodi/ 1606 /2018（H1N1）5 Li et al.[15] 2020 云南 A/Yunnan⁃Mengzi/ 1462 /20204 Li，et al.[17] 2022 云南 A/Yunnan-Lincang/ASWL01/2022 5 孙艳红，等 EA H1N1SIV可优先与人类唾液酸受体结合[8]，这与人类上呼吸道上皮细胞中含有丰富的α-2， 6-唾液酸受体有关[16]，HA蛋白的受体结合偏好被认为是决定宿主物种趋向性的重要因素[27−28]，YN/01/22的HA蛋白中190D和225E的氨基酸突变表明与人类受体的结合增加，提示存在潜在的人传人的风险。YN/01/22 病毒的PB2、NS1、M1、PA、PB1和NP蛋白中的氨基酸替换突变可能会增加病毒对哺乳动物的毒力和适应性。本研究未发现YN/01/22 病毒具有对神经氨酸酶抑制剂耐药突变位点，提示应用奥司他韦等神经氨酸酶抑制剂仍具有积极治疗作用。
该病例为云南省通过ILI监测网络发现的第4例EA H1N1SIV病例，表明流感监测网络不仅在监测季节性流感流行和疫苗病毒的选择方面发挥着关键作用，而且有助于早期发现具有大流行潜力的新型流感病毒。但很大一部分EA H1N1SIV感染病例病情轻微，甚至无症状，病例如果没到流感监测哨点医院就诊，可能存在漏诊的情况，感染EA H1N1SIV的数量可能被低估。因此，继续加强EA H1N1SIV在猪、以及猪和人之间的监测具有重要意义。
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图 1 YN/01/22感染MDCK细胞的病变（cytopathic effects，CPE）情况（164x）
A：MDCK细胞对照；B：48 h CPE；C：72 h CPE。
Figure 1. Cytopathic effects of MDCK cells infected with YN/01/22（164x）
图 2 EA H1N1 SIV分离株基因进化树
A：PB2基因系统发育树；B：HA基因系统发育树；C：M基因系统发育树；D：NA基因系统发育树；E：NP基因系统发育树；F：NS基因系统发育树；G：PA基因系统发育树；H：PB1基因系统发育树。
Figure 2. The genetic phylogenetic tree of EA H1N1 SIV isolate
表 1 不同型别的欧亚类禽猪流感基因型分型依据
Table 1. Genotyping basis of different types of eurasian avian-like swine influenza genotypes
分离株不同来源的基因片段 HA NA PB2 PB1 PA NP M NS 基因型 A/Jiangsu/1/2011a EA EA EA EA EA EA EA EA 1 A/swine/Hong_Kong/72/2007a EA EA EA EA EA EA EA CS 2 A/Hunan/ 42443 /2015aEA EA PDM PDM PDM PDM EA CS 3 A/swine/Guangdong/ 1361 /2010aEA EA PDM PDM PDM PDM PDM PDM 4 A/Fujian-cangshan/SWL624/2016a EA EA PDM PDM PDM PDM PDM CS 5 A/swine/Guangdong/1/2010a EA EA CS CS CS CS EA CS 6 A/swine/Hong_Kong/ 2421 /2012aEA EA EA EA EA EA PDM EA 7 A/swine/Guangdong/NS2897/2012a EA EA PDM EA PDM PDM PDM EA 8 A/swine/Guangxi/S2/2013a EA EA EA EA PDM PDM EA CS 9 A/swine/Hong_Kong/268/2012a EA EA CS CS CS CS CS CS 10 A/swine/Hong_Kong/201/2010a EA PDM CS CS CS CS CS CS 11 A/Yunnan-Lincang/ASWL01/2022b EA EA PDM PDM PDM PDM PDM CS 5 a：欧亚禽猪流感基因型分型参考株；b：云南临沧人感染欧亚禽猪流感分离株；EA：基因片段来源于欧亚类禽猪流感病毒；CS：基因片段来源于经典猪流感病毒；PDM：基因片段来源于A（H1N1）pdm09流感病毒。 
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表 2 A/Yunnan-Lincang/ASWL01/2022毒株的氨基酸分子特征分析
Table 2. The amino acid molecular characteristics of A/Yunnan-Lincang/ASWL01/2022 strain
基因 氨基酸
突变位点意义 毒株 CA/07/09 HN/42443/15 GD/1/10 FJ/624/16 JS/HD11/20 YN/01/22 HA E190D
G225D/E病毒受体结合特异性从α-2，
3-唾液酸转变为α-2，6-唾液酸[20]D
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DT588I 除增加哺乳动物细胞中的聚合酶活性外，
还被证明介导干扰素-β表达的抑制T I T T I I 627 宿主特异性的决定因素，
禽流感是E，人类流感是KE E E E E E NS1 P42S
D92E增加哺乳动物病毒毒力或适应性 S
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表 3 中国人感染EA H1N1SIV病例
Table 3. The cases infected EA H1N1SIV in China
年份 省份 毒株名 基因型 参考文献 2011 江苏 A/Jiangsu/1/2011 1 Yang et al.[10] 2012 河北 A/Hebei-Yuhua/SWL1250/2012 1 Wang et al.[11] 2015 湖南 A/Hunan/ 42443 /20153 Zhu et al.[13] 2015 云南 A/Yunnan-Longyang/SWL1982/2015 3 Zhu et al.[14] 2015 云南 A/Yunnan-Wuhua/SWL1869/2015 3 2016 福建 A/Fujian-Cangshan/SWL624/2016 5 Xie et al.[12] 2018 天津 A/Tianjin-baodi/ 1606 /2018（H1N1）5 Li et al.[15] 2020 云南 A/Yunnan⁃Mengzi/ 1462 /20204 Li，et al.[17] 2022 云南 A/Yunnan-Lincang/ASWL01/2022 5 孙艳红，等
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