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CBCT成像在涎腺造影检查中的应用价值

普启宏 何秋敏 郑大伟 尹大海 王燕 彭海

周磊, 吕雯雯, 段永忠, 钱雯, 程继帅. 靶向抗HSV-1的siRNA研究进展[J]. 昆明医科大学学报, 2024, 45(9): 1-8. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20240901
引用本文: 普启宏, 何秋敏, 郑大伟, 尹大海, 王燕, 彭海. CBCT成像在涎腺造影检查中的应用价值[J]. 昆明医科大学学报, 2022, 43(11): 118-123. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20221114
Lei ZHOU, Wenwen LYU, Yongzhong DUAN, Wen QIAN, Jishuai CHENG. Research Progress of siRNA Targeting Against HSV-1[J]. Journal of Kunming Medical University, 2024, 45(9): 1-8. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20240901
Citation: Qihong PU, Qiumin HE, Dawei ZHENG, Dahai YIN, Yan WANG, Hai PENG. Application Value of CBCT Imaging in Salivary Adenography[J]. Journal of Kunming Medical University, 2022, 43(11): 118-123. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20221114

CBCT成像在涎腺造影检查中的应用价值

doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20221114
基金项目: 云南省口腔疾病临床医学研究中心科研基金资助项目(2022QN0010)
详细信息
    作者简介:

    普启宏(1963~),男,云南牟定人,医学学士,副主任医师,主要从事口腔影像诊断和教学工作

    通讯作者:

    何秋敏,E-mail: puqihong623@163.com

  • 中图分类号: R781

Application Value of CBCT Imaging in Salivary Adenography

  • 摘要:   目的   探讨CBCT成像技术在涎腺造影诊断涎腺疾病中的应用价值。   方法   对51例患者行涎腺造影术后,进行传统曲面体层摄影(traditional pantomography,TPAN)和CBCT扫描;利用CBCT容积数据重建多平面图像(multi-planar reconstructed ,MPR)、合成曲断面图像(synthetic pantomography,SPAN)及3D图像,并与TPAN影像对比。   结果   51例涎腺造影后的CBCT- 3D图像,能360°立体展示涎腺全貌,对涎腺导管扩张、狭窄及末梢导管“点状扩张”等病变特征的显示优势明显;其MPR三维图像对涎腺占位性病变(如阴性涎石、肿瘤)形成的充盈缺损显示更为清晰和准确。   结论   CBCT成像在涎腺造影检查中能以多种重建技术(MPR、SPAN、3D)立体展示涎腺导管系统及腺体形态改变,更有利于涎腺疾病诊断,加之体位舒适、操作简便,辐射剂量低等优点,在涎腺疾病诊断中具有独特的应用价值。
  • 单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)在世界范围内普遍流行,引起临床上常见的口唇疱疹 (herpes labialis,HL)并反复发作,由于病毒感染后终身携带以及抗病毒药物的耐用性、副作用等问题而导致疾病难以完全治疗。1995年小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的发现为治疗HSV-1感染提供了基因层面的新策略,人工合成的siRNA通过特异性沉默效应靶向与HSV-1增殖有关的自身或宿主基因,进而影响病毒增殖。研究表明,基于RNA干扰(RNA interference,RNAi)的抗HSV-1疗法可能发展为一种有效的临床治疗手段。

    HSV-1是一种广泛存在于世界范围内的常见病毒,具有普遍性、潜伏感染和年龄分布的特征,其感染率在不同地区和人群中大有不同[12]。全球每年大约14 000例新生儿感染HSV,其中HSV-1比例占到了4000例,尤其在美洲、欧洲和西太平洋地区,HSV-1 的病例数比HSV-2多[3]。即使HSV-1的血清阳性率逐年降低,但是在青年人中HSV-1的血清阳性率仍达到了57.7%[4]。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)最新数据显示,全世界0~49岁中约有67%的人群受到了HSV-1的感染。HSV-1的普遍流行使世界医疗负担加重,在全球范围内都有着重要的健康影响,自新型冠状病毒(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)爆发以来,有报道称感染或接种 COVID-19疫苗诱发了 HSV-1 的再激活现象[5]。HSV-1大多数的感染是通过口唇接触传播而引起不同程度的HL。感染宿主外周组织后,一部分病毒便会通过逆行轴突感染神经元,其最大特征是进行潜伏性感染,人三叉神经节是HSV-1主要的潜伏部位,一旦潜伏建立病毒便难以被清除。HSV-1感染通常表现为轻度的疱疹症状,但在免疫系统受损或其他因素影响下,可能导致严重的并发症[6]。HSV-1感染会引起严重和罕见的疾病,如失明和脑炎[7]。反复的脑感染也可积累性的造成神经元受损,如阿尔兹海默症(Alzheimer's disease,AD)[8]

    尽管目前市面上具有有效的传统抗HSV-1药物可以减轻症状,例如阿昔洛韦(Acyclovir)和喷西洛韦(Penciliovir),该类核苷类药物虽能抑制HSV-1的复制,但在长期的治疗中,存在耐药性和副作用等问题[912]。多款用于预防HSV-1感染的疫苗也大多数处于不同的研发阶段,还没有批准上市的产品可供人们使用[13]。因此,寻找新的治疗策略显得尤为重要。

    近年来,RNA干扰(RNA interference,RNAi)已经被广泛用于各类口腔疾病、变异体调控以及病毒治疗等方面[1416]。通过序列特异性方式可沉默与疾病相关基因,使小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)成为一种有前途的治疗方式。siRNA是人工合成的外源双链反义RNA(double-stranded antisense RNA,dsRNA),是一类独特的DNA转录物,其大小为21~23个核苷酸,具有与mRNA完全互补的特性。siRNA通过RNA干扰与同源靶基因结合促进mRNA降解,在转录后的表达水平上进行高效特异性沉默。1995年,RNAi在秀丽隐干线虫中被证明参与基因调控表达[17];随后Fire等[18]首次揭示RNAi现象并因此获得了诺贝尔奖,2001年,在果蝇模型中Elbashir等[19]表明具有21nt至22nt的RNA是实现RNAi的重要序列特异性结构,siRNA具有突出的3′ 末端和磷酸化的5′ 端,其实现高效切割的位点位于其所结合区域的中心附近。更重要的是,合成的siRNA在哺乳动物细胞中可实现转录后基因特异性沉默[20],该项研究推动了siRNA在哺乳动物中的应用奠定了基础。

    通常情况下,dsRNA通过跨膜蛋白SID-1转移至细胞质,在细胞质中被Dicer核糖核酸酶III (dicer ribonucleaseIII,RNaseIII)切割成更小的dsRNA分子,被称为siRNA,它包含一条正义链和一条反义链[21]。siRNA反义链是具有生物学活性的链,成熟的siRNA与RNA沉默诱导复合体(RNA silencing induction complex,RISC)结合并激活该复合物,随后RISC的核酸内切酶(argonaute 2,AGO2)切割siRNA的正义链,而将反义链运输到细胞质中与mRNA结合,由于靶mRNA的序列与siRNA反义链是完全互补的,导致siRNA高效特异性沉默靶基因[2223]。DNA转录成dsRNA,通过SID-1转移至细胞质,在其中被Dicer切割成初级双链siRNA,成熟的siRNA与RISC结合形成复合物,通过反义链与靶mRNA序列结合导致mRNA降解。见图1

    图  1  siRNA作用机制示意图
    Figure  1.  Schematic diagram of siRNA mechanism of action

    近年来,siRNA作为一种新的抗HSV-1策略得到了广泛的研究。siRNA可以靶向HSV-1的基因发挥直接抗病毒效应。同时,靶向与HSV-1互作的宿主基因能够实现间接抗病毒效应。

    人工合成的siRNA是潜在的HSV-1基因治疗药物,由于其特异靶向性、低毒和高效而成为人们广泛关注的焦点[24]。Jin等[25]设计多个siRNA分别靶向HSV-1的UL18、UL19、UL26、UL26.5、UL35和UL38核衣壳蛋白编码基因,研究结果显示UL18和UL19效果显著。此外,他们还通过电镜定位实验表明,联合靶向病毒衣壳蛋白VP 23和VP 5能更显著影响HSV-1复制。

    感染细胞蛋白0(infected cell protein 0,ICP0)是单纯疱疹病毒在裂解性和潜伏性感染期间的重要调节因子,在缺乏ICP0蛋白的病毒中,发现宿主细胞能够抑制病毒基因组的转录。Agbaria等[26]将siRNA做成靶向HSV-1 ICP0蛋白的脂质体LipDOPE-siHSV(DOPE是内体逃逸辅助脂质)并转染受感染细胞,研究表明ICP0的表达水平呈剂量依赖性下降。使用siHSV脂质体治疗后,ICP0的表达水平降低产生的影响在病毒斑块减少实验和3D表皮模型中都得到了验证。

    UL29编码单链DNA结合蛋白ICP8,不但在病毒DNA复制中起到重要作用还表现出抑制来自亲本基因组的转录和刺激晚期基因转录[27-28]。通过复制缺陷型5型人腺病毒(adenovirus type 5,Adv 5)作为载体介导的shRNA,以UL29为靶标,转导后有效降低UL29的蛋白水平并在体外显著抑制HSV-1复制[29]。HSV-1 DNA聚合酶是病毒复制的一个关键酶,临床上使用的大多数核苷类药物都以其作为靶点。HSV-1核糖核苷酸还原酶(ribonucleotide reductase,RR)基因作为一种β基因,在病毒DNA复制中起重要的调节作用。UL39和UL40是编码RR基因同源二聚体的关键蛋白,Silva等[30]通过siRNA特异性地沉默UL39和UL40表达,导致HSV-1的增殖被抑制,其中一条siRNA有效抑制了99%的病毒增殖。此外,Zhe等[3134]研究表明使用siRNA靶向视网膜上皮细胞中的HSV-1 ICP4蛋白和UL39(编码ICP6)可有效减少HSV-1增殖。

    UL28蛋白是切割和包装HSV-1 DNA所需的七种病毒蛋白之一[35],Adv5作为载体介导的shRNA,以UL28为靶标,转导后有效降低了UL28的蛋白表达水并在体外显著抑制HSV-1复制[29]。通过酶促反应制备的靶向UL54、UL29和UL27的siRNA在不同程度上抑制了病毒靶基因mRNA表达水平。然而,靶向UL29的siRNA最具潜力[36]。在小鼠角膜模型实验中,靶向UL29的siRNA能抑制病毒增殖,减轻了病毒的感染症状并增加了小鼠存活的时间[37]。此外,siRNA-UL29对TK缺陷型HSV-1治疗也有效[38]。酶法合成的2'-氟修饰Dicer底物siRNA(2′ -F-siRNA)靶向HSV-1 UL29基因,对RNA聚合酶A(RNA polymerase A,RNase A)具有高抗性而不易被降解的优势,与未修饰的siRNA相比其抗HSV-1效力增加了100倍[39]。VP16是病毒立即早期(immediate early,IE)的重要转录基因,Zhang等[40]设计了靶向VP16(由UL48基因编码)的siRNA-1和靶向DNA聚合酶的siRNA-4,表明2种siRNA都显著抑制HSV-1复制。

    HSV-1包膜蛋白能与宿主细胞表明受体结合,促进病毒与宿主细胞之间的相互作用。Zhu等[41]通过转染靶向gD(US6)的特异性siRNA到Vero细胞中,gD的敲低导致HSV-1空斑数和病毒蛋白的表达和复制效率降低。转染靶向gE(US8)特异性siRNA到HaCaT细胞中,相比之下,用siRNA转染宿主细胞中WT HSV-1感染产生类似于gE突变病毒的噬斑,与靶向gD的siRNA有类似作用[42]

    综上所述,siRNA靶向HSV-1关键基因的研究为开发新型抗HSV-1药物提供了重要的理论基础和实验依据,为治疗HSV-1感染提供了新的思路和途径。靶向HSV-1编码基因的siRNA,见表1

    表  1  靶向HSV-1编码基因的siRNA
    Table  1.  Summary of siRNAs targeting HSV-1-encoded genes
    靶基因 siRNA 正向 (5′-3′) 反向 (5′-3′) 干扰效率(%) 参考文献
    UL18 siUL18-1 GCACCGUUAACCUUCGCAATT UUGCGAAGGUUAACGGUGCTT 86.78 [25]
    siUL18-2 GUCCUUAACAUGGUUUACUTT AGUAAACCAUGUUAAGGACTT 60.00
    siUL18-3 CCAUCAUCCUUACGCUAAUTT AUUAGCGUAAGGAUGAUGGTT 87.25
    siUL18-4 CCCGUUAUACGCUAUCCCUAA AGGGAUAGCGUAUAACGGGGG 65.00
    UL19 siUL19-1 CCAGCGACGUACAGUUUAATT UUAAACUGUACGUCGCUGGCG 79.71
    siUL19-2 CUUUUGUGCCGAUGCATT UGCAUCGGCAACAACAAAGTT 81.52
    siUL19-3 CGACCGACGUCAACUACUUTT AAGUAGUUGACGUCGGUCGTT 81.52
    siUL19-4 CCAGCGACGUACAGUUUAATT UUAAACUGUACGUCGCUGGTT 78.86
    UL26 siUL26-1 CCGUUAACAACAUGAUGCUTT AGCAUCAUGUUGGUUAACGGCG 40.00
    siUL26-2 CCGAUUUGUUCGUCUCUCATT UGAGAGACGAACAAAUCGGCG 81.21
    siUL26-3 CUGUUGUACCUGAUCACCAAC UGGUGAUCAGGUACAACAGGC NC
    siUL26-4 CCGUUAACAACAUGAUGCUGC AGCAUCAUGUUGGUUAACGGCG 10.00
    UL26.5 siUL26.5 CCGAUUUGUUCGUCUCUCAUU UUGGCUAAACAAGCAGAGAGU 52.12
    UL28 shRNAUL28 GATCCGCAGGTGCAGACCTATG
    TGTTTTCAAGAGAACACATAGG
    TCTGCACCTGCTTTTTTGGAAA
    NC DAY1 50.00 [29]
    DAY2 70.00
    DAY3 60.00
    DAY4 40.00
    UL29 shRNAUL29 GATCCGCAATCAATTCCAACCG
    GTGCTTCAAGAGAGCACCGGTT
    GGAATTGATTGCTTTTTTGGAAA
    NC DAY1 60.00
    DAY2 80.00
    DAY3 60.00
    DAY4 50.00
    UL30 siRNA-4 GGUACAACAUCAUCAACUUTT AAGUUGAUGAUGUUGUACCTT 6 h 60.00 [40]
    12 h 80.00
    UL35 siUL35-1 CACGCAAACAACACGUUUATT UAACGUGUUGUUGCGUGGG 50.00 [25]
    siUL35-2 GCCACCAAUAACUCUCAGUTT ACUGAGAGUUAUUGGUGGCCA 55.95
    siUL35-3 CUCUCAGUUUAUCAUGGAUTT AUCCAUGAUAAACUGAGAGTT 22.00
    siUL35-4 GUUUGUCGUCGAGAACCUTT AGGUUCUCGAACGACAAACGG 30.00
    UL38 siUL38-1 GGCCUAGUGUCGUUUAACUTT AGUUAAACGACACUAGGCCCG NC [25]
    siUL38-2 GGAUCACCAAACCGAUUCATT UGAAUCGUGUUGGUGAUCCCGG 10.00
    siUL38-3 GCGUUUCUGUACCUGGUAUTT AUACCAGGUACAGAAACGCCG 82.48
    siUL38-4 GUUGUGUGUACGUGAUCAATT UUGAUCACGUACACACAACAC NC
    UL39
     
     
    siRNA1 CUGCACCAUGAUCAUCGACdTdT GUCGAUGAUCAUGGUGCAGdTdT 29.63 [33]
    siRNA2 AUCGGCCCUGAAGUAUGAGdTdT CUCAUACUUCAGGGCCGAUUG 27.07
    siRNA3 GCGCUGCGACAAUAUCUUCdTdT GAAGAUAUUGUCGCAGCGCUG NC
    siRNA4 CCAUAGCCAAUCCAUGACCdTdT GGUCAUGGAUUGGCUAUGGUC NC
    UL40 siRNA-1 GACGACCUGGUUACGGAAAdTdT UUUCCGUAACCAGGUCGUCGG 2.73 [30]
    siRNA-2 AAUGCAUCGAAGUCGUACAdTdT UGUACGACUUCGAUGCAUUCC 69.83
    siRNA-3 UCACCUGCCAGUCAAACGAdTdT UCGUUUGACUGGCAGGUGACC 67.94
    siRNA-4 AAAUUGGUGUGUUUGUCGGUG AAAUUGGUGUGUUUGUCGGUG 81.31
    ICP4 siRNA GCAACAGCAGCUCCUUCAUdTdT dTdTCGUUGUCGUCGAGGAAGUA 12 h 69.00
    24 h 95.00
    VP16 siRNA-1 GGUACUUUAUGGUGUUGAUTT AUCAACACCAUAAAGUACCTT NC [3140]
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    病毒是一种专性细胞寄生生物,在病毒复制增殖的过程中,许多的宿主细胞基因参与了病毒的生命活动过程。HSV-1在增殖的各个阶段都与宿主基因发生着广泛的相互作用,靶向与HSV-1互作宿主基因的siRNA,同样可以发挥抗HSV-1的功能,这也是设计siRNA药物的策略之一。

    表观遗传调控在HSV-1的感染过程中发挥重要的作用[43]。在HSV-1感染的IE期,病毒基因组能招募组蛋白去甲基化酶1(histone demethylase1,LSD1)促进病毒基因的转录,利用siRNA敲低LSD 1基因的表达有效地抑制HSV-1的裂解复制和潜伏再激活感染[44]。HSV-1感染后显著上调锌指转录因子胰岛素瘤相关1(zinc finger transcription factor insulinoma-associated 1,INSM1)的表达,而用siRNA敲低INSM1基因的表达后抑制了HSV-1的复制[45]

    增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是调控HSV-1复制及组蛋白沉积的重要细胞因子[46]。用siRNA敲低PCNA的表达后,HSV-1的滴度有所下降,表明PCNA对病毒复制有促进作用[47]

    蔗糖非发酵蛋白2同源物(sucrose nonfermenting protein 2 homolog,SNF2H)是染色质重塑酶的ISWI家族的成员,在HSV-1 复制区室(HSV-1 replication chamber,RC)中表达最丰富。特异性siRNA 敲低SNF 2H mRNA表达水平导致病毒复制减少,表明SNF2H能够促进HSV-1的增殖[48]

    CoREST是一种辅助性抑制蛋白,与抑制性转录因子REST和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)1或2形成复合物来抑制细胞基因表达。先前的研究表明,ICP0可以与CoREST结合并将HDAC1从CoREST/REST/去甲基化酶1(LSD1)抑制复合物中排斥出去,靶向CoREST/REST的siRNA导致了病毒α蛋白(ICP4、ICP0、ICP22和ICP27)和β蛋白ICP8的积累均显著减少[49]

    内吞网络是细胞进行吞噬、运输和分解细胞外物质的复杂系统,细胞环境中的出芽过程由4种转运复合物(transport complex,ESCRT)和一些蛋白介导,在维持内吞网络完整性方面起着重要作用[50]。其中,ALIX和TSG101是研究的最为深入的ESCRT的互作蛋白,而且HSV-1 编码蛋白的中也存在潜在的ALIX和TSG101结合序列基序,对病毒包膜的形成具有一定作用。Pawliczek等[51]通过siRNA敲低ALIX和TSG101后发现,HSV-1增殖但并不需要ALIX和TSG101[52]

    细胞囊泡内吞过程需要ESCRT-III组分CHMP4C参与,先前被证明对HSV-1 包膜内吞网络循环的完整性并且是不可缺少的。Russell等[53]转染特异性siRNA敲低CHMP4C表达后能显著降低HSV-1的滴度。

    Nectin-1是HSV进入宿主细胞的受体蛋白,先前研究表明nectin-1在HaCaT角质形成细胞系中高度表达[54]。从小鼠角质形成细胞中敲除nectin-1导致HSV-1进入减少[55],Sayers等[5657]使用siRNA敲除 nTERT细胞的nectin-1和HVEM受体导致病毒进入减少。B5蛋白是HSV-1进入宿主的辅助受体,siRNA沉默B5蛋白表达后导致HSV-1空斑形成水平明显降低,ICP4、ICP0、ICP27和VP16蛋白表达也显著降低[58]。靶向与HSV-1互作宿主基因的siRNA见表2

    表  2  靶向宿主基因与HSV-1相互作用的siRNA
    Table  2.  Summary of siRNA targeting host genes interacting with HSV-1
    靶基因 siRNA 正向(5′-3′) 参考文献
    INSM1 siINSM1 UCCGCAAGCUGCACUUCGATT [45]
    SNF2H
    siRNA5 GGAAUGGUAUACUCGGAUA [48]
    siRNA6 GGGCAAA UAGAUUCGAGUA
    siRNA7 GGAUUUACCAAUUGGAAUA
    siRNA8 GUUCUUUCCUCCACGUUUA
    REST siREST GUGAUACUGUAGAUUACAC [49]
    coREST sicoREST AAGAUUGUCCCGUUCUUGACU [59]
    TSG101 siTSG101 CCUCCAGUCUUCUCUCGUCTT [52]
    ALIX siALIX GCCGCUGGUGAAGUUCAUCTT
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    HSV-1是一种能在神经细胞中发生潜伏感染的病毒,这使得很难通过药物治疗或机体的免疫力彻底将其清除。siRNA在2001年被首次报道后,为治疗HSV-1带来了新希望[19]。通过siRNA靶向HSV-1基因和互作宿主基因以及与其他治疗手段的联合应用为治疗HSV-1感染及相关siRNA疫苗开发提供了新的策略。

    siRNA的高效递送体系统也是值得进行深入研究的方向。目前在mRNA疫苗中常用的脂纳米颗粒 (lipid nanoparticles,LNP) 是非常成熟的递送系统,但其细胞毒性和激活天然免疫的副作用仍需进一步的改进。

    尽管siRNA药物治疗病毒性疾病取得了一些进展,目前还没有基于RNAi的抗HSV-1疗法,其临床应用仍面临着挑战,需要进一步的研究和探索来解决相关的技术难题和安全性问题。

  • 图  1  双侧腮腺造影TPAN与CBCT-SPAN图像对比

    A:TPAN显示双侧腮腺造影图像;B:同一患者:CBCT-SPAN显示双侧腮腺造影图像。

    Figure  1.  Parotid radiography TPAN contrast with CBCT-SPAN

    图  2  双侧慢性阻塞性腮腺炎

      A:TPAN显示的双侧腮腺导管系统改变;B:同一患者,CBCT-SPAN显示的导管系统改变;C、D:同一患者,CBCT-3D多角度、立体显示导管扩张和狭窄改变。

    Figure  2.  Bilateral chronic obstructive parotitis

    图  3  双侧慢性复发性腮腺炎

      A、B:CBCT-3D清晰显示双侧腮腺末梢导管“点扩”征象;C:同一患者TPAN(分泌功能片)显示的“点扩”征象;D:同一患者SPAN显示的“点扩”征象。

    Figure  3.  Bilateral chronic recurrent parotitits

    图  4  颌下腺导管多发阴性小涎石

      A:TPAN未能显示涎石影像; B:同一患者,CBCT-3D显示多发小涎石(↑);C、D:同一患者,CBCT-MPR显示多发小涎石充盈缺损(↑)。

    Figure  4.  Multiple negative small sialolith in submandibular gland duct

    图  5  腮腺深叶肿瘤

    A:TPAN仅显示局部腺泡稍稀薄(↑);B、 C、D :同一患者,CBCT-MPR清晰显示肿瘤充盈缺损征像。

    Figure  5.  Deep lobe tumor of parotid gland

    表  1  CBCT与TPAN显示涎腺造影影像的优劣情况对比

    Table  1.   Comparison of the advantages and disadvantages of BCT and TPAN in displaying sialography images

    检查方法 腺体形态 主导管扩张 末梢导管点状扩张 导管内占位 腺泡内占位
    TPAN ++ ++ ++ + +
    CBCT
     SPAN ++ + ++ + +
     MPR + +++ +++
     3D +++ +++ +++ ++ +
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  • 收稿日期:  2022-06-28
  • 刊出日期:  2022-11-25

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