Characteristics of katG and inhA Gene Mutations in INH-Resistant Mycobacterium Tuberculosis in Yunnan Province
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摘要:
目的 分析云南省异烟肼耐药结核分枝杆菌katG和inhA基因突变特征。 方法 采用PCR方法对云南省异烟肼耐药结核分枝杆菌进行katG和inhA基因扩增，并将扩增产物进行基因测序后比对分析。 结果 88株异烟肼耐药菌株中，耐药基因与表型药敏结果的符合率为82.95%（73/88），katG和inhA基因突变率分别为75.00%（66/88）和9.09%（8/88）。最为常见的基因突变位点为katG315（67.05%）和inhA-15（7.95%），katG315位点基因突变主要表现为Ser315Thr（59.09%，52/88）。耐多药与单耐异烟肼菌株中katG基因突变比例，差异有统计学意义（χ2 = 4.190，P = 0.041），而inhA基因及katG315、inhA-15位点基因突变比例，差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 云南省异烟肼耐药以katG315和inhA-15基因突变为主，MDR菌株中katG基因突变率高于异烟肼单耐，目前基于基因突变的分子检测技术是检测异烟肼耐药的有效手段。 Abstract:Objective To analyze the characteristics of katG and inhA genetic mutations associated with INH-resistant Mycobacterium tuberculosis in Yunnan Province. Methods The INH-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates were collected from drug-resistant monitoring sites in Yunnan Province, and the katG and inhA genes were amplified by PCR and then sequenced. Results Among the 88 MTB strains, the coincidence rate of INH-resistant genotype and phenotype was 82.95% （73/88）. 75.00% （66/88） had katG mutations and 9.09% （8/88） had inhA mutations. katG315 （67.05%） and inhA-15 （7.95%） were the top two mutation sites, and a high prevalence of katG Ser315Thr mutations （59.09%, 52/88） was observed. The frequency of the katG mutation was significantly higher in MDR-TB compared to INH mono-resistant isolates （χ2 = 4.190, P = 0.041）, while katG315, inhA and inhA-15T mutations did not differ significantly between these two groups （P > 0.05）. Conclusion The most common mutation of INH-resistant Mycobacterium tuberculosis in Yunnan Province were katG315 and inhA-15, and katG mutation was higher among MDR isolates compared with INH mono-resistant strains. Molecular diagnostics based on gene mutations was a useful method for rapid detection of INH-resistant Mycobacterium tuberculosis in Yunnan Province. -
Key words:
- Mycobacterium tuberculosis /
- INH /
- Drug resistance /
- katG /
- inhA
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结核病仍是人类面临的重大公共卫生问题。据WHO估计[1]，2019年全球有新发结核病1 000万，近50万新发利福平（rifampicin，RFP）耐药肺结核患者，其中78%为耐多药结核病患者（multiple drug resistant tuberculosis，MDR-TB）指同时耐异烟肼和利福平的结核病患者，而中国是全球30个MDR高负担国家之一，耐药结核患者占了其中的14%，位居全球第2[1]。耐药结核病尤其是MDR-TB仍是结核病防治面临的一个严重挑战。异烟肼（isoniazid，INH）自其问世以来一直是治疗结核病的首选药物之一，当结核分枝杆菌对INH产生耐药时则会严重影响结核病的治疗效果。而耐药从分子水平上大部分是由于结核耐药相关基因位点发生了突变而产生的，同时受地域因素等影响，其耐药基因突变类型和频率存在差异。为了解云南省的INH耐药结核分枝杆菌基因突变情况，本研究对云南省结核耐药监测点分离的结核分枝杆菌进行INH耐药相关基因katG基因和inhA基因测序，以阐明其耐药基因突变特征，为本地区耐药结核病的快速诊断和防控政策的制定提供技术依据。
1. 材料与方法
1.1 菌株来源
结核分枝杆菌菌株来自于2016年1月至12月期间前来云南省32个耐药监测县就诊的病原学阳性肺结核患者，对其痰标本进行分离培养后获得。结核杆菌标准株（H37RV）由中国疾控中心结核病预防控制中心国家结核病参比实验室提供。
1.2 试验方法
1.2.1 表型药物敏感性试验
表型药物敏感性试验采用比例法，检测其对6种抗结核药物的药物敏感性。抗结核药物在培养基中的终浓度分别为：INH 0.2 μg/mL，OFX 2 μg/mL，RFP 40 μg/mL，KM 30 μg/mL，EMB 2 μg/mL和SM 4 μg/mL。以耐药百分比作为判定标准： < 1%者判定为敏感，≥1%则报告为耐药。并以H37RV作对照进行质量控制。
1.2.2 DNA模板制备
对表型药敏结果显示INH耐药的结核分枝杆菌，从固体罗氏培养基斜面上刮取1接种环培养3～4周的新鲜菌株，重悬于200 μLTE中，恒温金属浴85 ℃孵育30 min灭活，12000 r/min离心5 min，然后弃上清，每管分别加入100 μL去离子水，涡旋振荡重悬；95 ℃恒温金属浴20 min，超声裂解15 min，12000 r/min离心 5 min，取上清液作为DNA 模板备用。
1.2.3 耐药基因扩增及测序
从Genebank获得H37Rv的katG和inhA基因序列，采用Primer 5.0设计引物，对katG和inhA基因进行扩增，2对引物的序列分别为：
katG-F：5‘-AATCGATGGGCTTCAAGACG-3’ ；
katG-R：5‘-CTCGTAGCCGTACAGGATCTCG-3’ 。
inhA-F：5‘-CCTCGCTGCCCAGAAAGGGA-3’ ；
inhA-R：5‘-ATCCCCCGGTTTCCTCCGGT-3’ 。
扩增产物分别为500 bp和248 bp。每个反应体系为50 μL，包括2×PCR扩增25 μL、上下游引物（ 10 mol /L） 各1.5 μL，DNA模板5 μL，去离子水17 μL。PCR扩增反应条件：94 ℃变性5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min共35个循环，再72 ℃延伸10 min。扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
1.2.4 测序结果比对
katG和inhA基因测序结果采用BioEdit v7.2.5软件分析，测序结果与标准菌H37Ｒv的基因序列进行比对，确定基因突变位点及基因突变情况。
1.3 统计学处理
建立EpiData数据库，并将实验结果等信息录入，采用SPSS 22.0软件进行统计分析。突变率的比较采用χ2检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 药物敏感性实验结果
共收集并分离到846株结核分枝杆菌，药敏试验结果显示，88株结核分枝杆菌对INH耐药，INH耐药率为10.40%。其中32株同时对RFP耐药（即MDR），MDR率为4.29%，另56株对INH耐药，而对RFP敏感（INH单耐）。
2.2 INH耐药相关基因突变特征
88株表型药敏试验结果显示INH耐药的结核分枝杆菌，对其katG和inhA基因进行PCR扩增，扩增出500 bp和248 bp大小的目的基因片段，见图1。
图 1 katG和inhA基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳图A：M为DNA marker，Rv为H37Rv标准株，1-8为部分耐异烟肼菌株katG基因扩增产物；B：M为DNA marker，Rv为H37Rv标准株，1～8为部分耐异烟肼菌株inhA基因扩增产物。Figure 1. Agarose GEL electrophoresis of katG and inhA gene amplification products测序结果显示，73株检出INH耐药相关基因突变，15株（17.05%）未检测到katG或inhA基因的突变，INH耐药基因型与表型的符合率为82.95%（73/88），其中65株（73.86%）为katG基因突变，7株（7.95%）为inhA基因突变，1株（1.14%）为katG基因和inhA基因的联合突变。基因突变涉及katG和inhA的14个基因突变类型和13种氨基酸改变，有点突变、双位点联合突变和基因缺失，见表1。
表 1 88株INH耐药结核分枝杆菌的KatG和inhA基因突变情况Table 1. Distribution of mutations of katG and inhA gene among 88 inh-resistant TB isolates基因位点 密码子改变 氨基酸改变 菌株数（株） 构成比（%） katG 315 AGC ACC Ser Thr 50 56.82 AGC AAC Ser Asn 5 5.68 AGC CGC Ser Arg 1 1.14 katG 190 CAG TAG Gln 终止密码子 1 1.14 katG 232 CCG ACG Pro Thr 1 1.14 katG 316 GGC CGC Gly Arg 1 1.14 katG 328 TGG TCG Trp Ser 1 1.14 katG 315+327 AGC ACC Ser Thr 1 1.14 AAA AAG Lys Lys同义突变 katG 315+329 AGC ACC Ser Thr 1 1.14 GAC GTC Asp Val katG 315+334 AGC AAC Ser Asn 1 1.14 GAG GGG Glu Gly katG 232+ 328 CCG GCG Pro Ala 1 1.14 TGG GGG Trp Gly katG基因缺失 - - - - 1 1.14 inhA -15 C T - - 7 7.95 katG314+inhA-34 ACC ATC Thr Ile 1 1.14 C T - - 未检出 - - - - 15 17.05 突变频率最高的位点为KatG315位点，占INH耐药菌株数的67.05%（59/88），包括52株Ser315Thr （碱基改变为AGC→ACC，氨基酸改变为Ser→Thr）基因突变，见图2，6株Ser315Asn（碱基改变为AGC→AAC，氨基酸改变为Ser→Asn）基因突变，见图2，1株Ser315Arg （碱基改变为AGC→CGC，氨基酸改变为Ser→Arg）基因突变。有4株（4.55%）出现katG基因的双位点突变，见表1，其中1株出现Ser315Thr+Lys327Lys双位点突变中的Lys327Lys碱基密码子改变为同义突变，碱基变化为AAA→AAG，而编码氨基酸未发生改变，均为Lys，见表1。7株（7.95%）INH耐药菌株的基因突变发生于非315密码子区。
图 2 katG和inhA基因的主要突变类型A：野生型katG315；B：Ser315Thr突变；C：Ser315Asn突变；D：inhA C-15T突变。Figure 2. The characteristics of katG and inhA gene mutation7株（7.95%）inhA基因突变位于inhA基因启动子区域，均为-15 位点（ C→T），见图2，占基因突变类型的第2位。katG315或inhA-15位点的突变占到所有INH耐药菌株数的75%（66/88）。
2.3 耐药基因突变与耐药类型的比较
32株MDR菌株中有87.50%（28/32）出现katG或inhA基因突变，而56株INH单耐菌株中出现基因突变的比例为80.36%（45/56），MDR和INH单耐菌株中基因突变比例，差异无统计学意义（χ2 = 0.735，P = 0.391）。32株MDR菌株中，katG基因突变的有28株，占MDR数的87.50%，其中出现katGSer315Thr的比例为62.50%（20/32），见表2，56株INH单耐菌株中，katG基因突变的有38株（67.86%），其中出现Ser315Thr的比例为57.14%（32/56），见表2，MDR菌株中出现katG基因突变的比例与INH单耐结核分枝杆菌相比，差异有统计学意义（χ2 = 4.190，P = 0.041），而出现katGSer315Thr基因突变，差异无统计学意义（χ2 = 0.242，P = 0.623）。inhA基因突变中，7株inhA-15位点基因突变均来自于INH单耐菌株中，1株inhA-34位点基因突变来自于MDR菌株，为与katG314位点的联合突变，MDR和INH单耐菌株的inhA基因突变，差异无统计学意义（3.13% vs 12.50%，χ2 = 1.180，P = 0.277），inhA-15位点基因突变，差异无统计学意义（0 vs 12.50%，χ2 = 2.806，P = 0.094）。
表 2 不同耐药类型中INH耐药基因突变情况[n（%）]Table 2. KatG and inhA gene mutations between MDR and INH mono-resistant [n（%）]耐药类型 菌株数（株） 总的基因突变 katG 其中Ser 315Thr突变 inhA 其中inhA-15突变 MDR 32 28（87.50） 28（87.50） 20（62.50） 1**（3.13） 0（0） INH单耐 56 45（80.36） 38（67.38） 32（57.14） 7（12.50） 7（12.50） χ2 0.735 4.190 0.242 1.180 2.806 P 0.391 0.041※ 0.623 0.277 0.094 **：inhA和katG基因的联合突变；※P < 0.05。 3. 讨论
INH和RFP作为治疗结核病的2种最重要的首选抗结核药物，两者均存在价格便宜、杀菌力强和副作用低的特点[2]。由于RFP耐药的主要分子机制相对简单，96%以上RFP耐药都是由于apoB基因的核心区基因突变引起的[3]，表型和基因型耐药高度相关，因而使得RFP耐药快速检测成为可能，而INH的耐药机制十分复杂，涉及katG、inhA、ahpC、oxyR-ahpC等结构基因和调控区[4-7]，其中最为主要的为katG和inhA基因。INH耐药菌株中katG基因突变率约为60%～95%，而inhA基因突变率则为8%～43%左右[8-10]。本研究通过对来自云南结核病耐药监测点分离的88株INH耐药结核分枝杆菌进行katG和inhA基因的序列分析，结果显示82.95%的菌株出现INH耐药相关基因katG和/或inhA的突变，15株未检测到katG基因及inhA基因的突变，这可能和其它异烟肼耐药相关基因发生突变有关，有关文献报道，在异烟肼耐药菌株中，oxyR-ahpC突变率可达占5%～10%[2]。本研究中katG基因突变占INH耐药菌株数的73.86%，INH耐药以katG 315位点基因突变为主，超过INH耐药菌株数的50%，达到67.04%；其次为inhA-15位点的突变，占耐药菌株数的7.95%，总体结果与国内其它省份基本一致。katG基因突变率与江西（73.25%）[11]和吉林（70.6%）[12]等地结果接近，高于浙江（63.1%）[13]和北京（62.3%）[14]；katG 315位点突变率与江西（68.8%）[11]、浙江（63.1%）[13]等地报道接近，低于上海（81.4%）[15]和四川（84.43%）[16]，inhA-15位点的突变与浙江（10.41%）[13]结果接近，而低于江西（15.30%）[11]、上海（16.9%）[15]、湖南（15.6%）[17]及北京（19.5%）[14]等地结果，提示katG和inhA基因突变受地域等因素的影响。目前，商品化的INH耐药检测分子诊断技术大部分是基于对katG基因的315位点和inhA基因启动子区的几个常见突变位点进行检测，根据本研究，两者占INH耐药的75%左右，鉴于常规表型药敏检测从痰标本采集到获得药敏结果需分离培养和药敏试验等过程，耗时2～3个月时间，而分子诊断技术工具大大缩短了诊断的时间，因此合理使用分子诊断技术对于指导临床诊疗具有重要意义，同时今后还需开发或引进包含其它基因或位点的分子诊断工具以提高INH耐药检测水平。
世界各地结核分枝杆菌中katG基因中Ser 315Thr突变的流行率各不相同，与当地结核病疫情密切相关，相比于结核病低疫情地区，高结核病负担地区INH耐药菌株中的Ser 315Thr突变率总是处于一个比较高的水平[18]。本研究显示云南省的结核分枝杆菌Ser 315Thr突变达到INH耐药菌株数的59.09%，超过50%与国内其他地区的报道基本一致[18]。有研究表明，INH耐药菌株在katG 315密码子以外区域的突变频率低于1%[19]，而本研究中315密码子突变率为7.95%，同时4.55%菌株出现katG基因双位点突变看，提示我省katG基因突变的多样性较高。
本研究还对耐多药和INH单耐菌株的耐药基因突变率进行了分析，结果显示，MDR结核分枝杆菌中katG基因突变率显著高于INH单耐的菌株，这可能与大部分MDR菌株其INH耐药性的获得提前于RFP有关[2]，通常认为katG突变与结核分枝杆菌对INH高水平耐药相关，inhA启动子突变与INH低水平耐药相关。INH耐药性尤其是katG突变更容易诱发菌株对RFP耐药而形成MDR菌株。国外相关研究[19-20]也显示MDR菌株中的katG基因突变率高于INH单耐。本研究中虽然MDR和INH单耐菌株中其inhA基因突变比例无显著差异，但7株inhA -15位点突变的菌株均来自于INH单耐，仅有1株inhA-34+katG314联合突变的菌株为MDR，提示不同耐药类型中，inhA的基因突变率也可能不同，本研究受限于inhA基因突变的样本较少，尚不足以明确反映inhA基因与表型耐药的关系，具体情况还有待于今后进一步研究。
本研究首次通过基因测序手段揭示了云南省结核分枝杆菌异烟肼耐药的分子特征，并对耐药表型和基因型的关系进行了分析，为云南省今后各类异烟肼耐药检测技术手段在云南省的合理应用提供了技术支撑。
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图 1 katG和inhA基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
A：M为DNA marker，Rv为H37Rv标准株，1-8为部分耐异烟肼菌株katG基因扩增产物；B：M为DNA marker，Rv为H37Rv标准株，1～8为部分耐异烟肼菌株inhA基因扩增产物。
Figure 1. Agarose GEL electrophoresis of katG and inhA gene amplification products
图 2 katG和inhA基因的主要突变类型
A：野生型katG315；B：Ser315Thr突变；C：Ser315Asn突变；D：inhA C-15T突变。
Figure 2. The characteristics of katG and inhA gene mutation
表 1 88株INH耐药结核分枝杆菌的KatG和inhA基因突变情况
Table 1. Distribution of mutations of katG and inhA gene among 88 inh-resistant TB isolates
基因位点 密码子改变 氨基酸改变 菌株数（株） 构成比（%） katG 315 AGC ACC Ser Thr 50 56.82 AGC AAC Ser Asn 5 5.68 AGC CGC Ser Arg 1 1.14 katG 190 CAG TAG Gln 终止密码子 1 1.14 katG 232 CCG ACG Pro Thr 1 1.14 katG 316 GGC CGC Gly Arg 1 1.14 katG 328 TGG TCG Trp Ser 1 1.14 katG 315+327 AGC ACC Ser Thr 1 1.14 AAA AAG Lys Lys同义突变 katG 315+329 AGC ACC Ser Thr 1 1.14 GAC GTC Asp Val katG 315+334 AGC AAC Ser Asn 1 1.14 GAG GGG Glu Gly katG 232+ 328 CCG GCG Pro Ala 1 1.14 TGG GGG Trp Gly katG基因缺失 - - - - 1 1.14 inhA -15 C T - - 7 7.95 katG314+inhA-34 ACC ATC Thr Ile 1 1.14 C T - - 未检出 - - - - 15 17.05 
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表 2 不同耐药类型中INH耐药基因突变情况[n（%）]
Table 2. KatG and inhA gene mutations between MDR and INH mono-resistant [n（%）]
耐药类型 菌株数（株） 总的基因突变 katG 其中Ser 315Thr突变 inhA 其中inhA-15突变 MDR 32 28（87.50） 28（87.50） 20（62.50） 1**（3.13） 0（0） INH单耐 56 45（80.36） 38（67.38） 32（57.14） 7（12.50） 7（12.50） χ2 0.735 4.190 0.242 1.180 2.806 P 0.391 0.041※ 0.623 0.277 0.094 **：inhA和katG基因的联合突变；※P < 0.05。
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