Reductive Amination of Genipin with NaBH3CN to Synthesize Alkaloid-likes and Bioactivity
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摘要:
目的 以京尼平苷为原料通过还原胺化反应合成拟生物碱的方法。 方法 京尼平与胺类化合物在氰基硼氢化钠存在下进行还原反应：京尼平与芳基乙胺的甲醇溶液混合后，加入过量氰基硼氢化钠，放置室温下反应3d，产物经石油醚-异丙醇-二乙胺，石油醚-乙酸乙酯等洗脱分离。 结果 合成共得到9个拟生物碱并对部分拟生物碱进行活性筛选，找到治疗2型糖尿病的PTP1B抑制剂。 结论 部分受试化合物对PTP1B有抑制作用。一系列活性衍生物的获得为化合物结构及其生物活性间的构效关系研究打下了基础，有利于寻找具有更高活性的PTP1B抑制剂。 Abstract:Objective To explore a method for the synthesis of alkaloid-likes from Genipin by reductive amination is reported. Methods The reduction of Genipin and amines in the presence of sodium cyanoborohydride: after the methanol solution of Genipin and arylethylamine was mixed, excessive sodium cyanoborohydride was added and the reaction was kept at room temperature for 3 days. The product was eluted and separated on silica gel by petroleum ether-isopropyl alcohol-diethylamine and petroleum ether-ethyl acetate. Results Nine alkaloid-likes were synthesized. Some alkaloid-likes were screened for inhibition activity of PTP1B enzyme for Ⅱ diabetes treatment. Conclusions All of the tested compounds have a certain inhibitory effect on PTP1B. The acquisition of a series of active derivatives has laid a foundation for the study of the structure-activity relationship between the compounds and their bioactivities, so as to facilitate the search for more active PTP1B inhibitors. -
Key words:
- Genipin /
- Alkaloid-likes /
- Reductive amination /
- Inhibition activity against PTP1B
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目前，通过发现先导化合物是现代新药研发的重要出发点，研究者对具有特定生物活性的先导化合物，利用生物、化学方法进行结构修饰，从而减少化合物毒副作用，提高化合物的活性，增强其生物利用度，最终找到一些作用效果明显，副作用少的新药应用于临床治疗。京尼平（Gardenia jasminoidesEllis）是茜草科植物的果实，主要成分是京尼平苷，始载于《神农本草经》，其性寒，味微酸而苦，具有清热泻火、保肝利胆、抗菌消炎的功效，主要分布于浙江、江西、湖南等省[1]。近年对京尼平苷的药理研究，其具有保肝利胆、镇痛、解毒[2]以及改善学习和增强性行为等作用[2-4]。白涛等[5]研究表明京尼平苷可以作用GLP-1 受体调节在高糖高脂的诱导条件下胰岛β细胞胰岛素分泌。其衍生物具有抗老年痴呆、生物交联剂、抗血栓、抗肿瘤、抗病原体和降血糖作用[6-8]。环烯醚萜苷的基本骨架具有缩醛基团，隐含戊二醛的结构，主要分布于龙胆科植物中并与单萜吲哚类共存[9]。从生源途径来讲，环烯醚萜苷与胺类成分发生缩合反应，衍生化后形成具有较强生物活性的拟单萜生物碱。参照裂环马钱子苷与色胺经仿生合成得到单萜吲哚生物碱异胡豆苷的反应[10]，选择天然产物中的环烯醚萜苷作为初始反应物，得到一系列结构类似的含氮化合物（拟生物碱）。京尼平苷是环烯醚萜与葡萄糖形成的一种苷，Yu等[11]分离到一些环烯醚萜化合物，京尼平苷[12]是环烯醚萜苷中的典型代表，在植物中含量较高，其水解产物京尼平丰富易得，其结晶有较好的而稳定性，其戊二醛结构有很强的“可塑性”，可用来制备大量拟生物碱。因此，在实验中笔者以京尼平为原料，合成得到9个拟生物碱并对其生物活性进行筛选。
1. 材料与方法
1.1 仪器和试剂
1.1.1 仪器
HH-2型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）、ZFQ85A旋转蒸仪（上海医械专机厂）、78-1型磁力加热搅拌器（杭州仪器电机厂）、TN型托盘式扭力天平（上海第二天平仪器厂）、AM-400型核磁共振波谱仪（（瑞士BRUKER公司）。
1.1.2 试剂
京尼平由本课题组制备。所用有机试剂（化学纯）均购自昆明市医药公司化学试剂玻璃仪器采供站，柱层析硅胶均为青岛海洋化工厂产品。
1.2 方法
1.2.1 还原胺化反应
NaBH3CN在醇类溶剂或弱酸性、中性水溶液中有较好的稳定性，是一种优良的还原剂，羰基化合物和胺在NaBH3CN的条件下，可发生还原胺化反应得到胺类化合物，见图1。
1.2.2 京尼平与芳香伯胺在氰基硼氢化钠条件下的还原胺化反应
京尼平中戊二醛结构与不同的胺类发生缩和环化后，再经NaBH3CN还原得到目标产物，反应历程（图2）如下：C1位羰基发生还原胺化反应得到中间体Ⅰa，经过分子内的胺化缩和，生成亚胺阳离子Ⅰb，重排后得到较稳定的烯胺类产物Ⅰ，产物Ⅰ由于存在△3，4烯键与羰基共轭，故不能被进一步还原；C3位羰基发生还原胺化反应得到中间体Ⅱa与Ⅲa，分别进行分子内胺化缩和得到亚胺阳离子，再被NaBH3CN还原得到一对差向异构体Ⅱ和Ⅲ。在制备时分别采用3，4-二甲氧基苯乙胺（I）、3-甲氧基-4-羟基苯乙胺（Ⅱ）、对二甲氨基苯乙胺（Ⅲ）和盐酸酪胺（Ⅳ），生成的产物见图3。
1.2.3 拟生物碱的制备
1，4-二羰基类化合物和氨在氰基硼氢化钠条件下发生还原反应得到环胺类成分[9]。选择不同的原料胺（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，见图4）与京尼平反应：将伯胺溶于甲醇，加一滴甲基红指示剂，滴加10%盐酸使溶液由黄变红，加入等摩尔京尼平，与过量的氰基硼氢化钠混合（京尼平：氰基硼氢化钠1∶4～1∶5），反应完全后，稀释溶液，氯仿萃取，合并有机相，上硅胶柱分离，石油醚-异丙醇-二乙胺（5∶1∶1～15∶1∶1）与石油醚-乙酸乙酯（1∶1～0∶1）交替洗脱，制备得到三个拟生物碱，见表1，对产物进行抗PTP1B活性测试。
表 1 反应产物Table 1. Products of reactionR1 R2 C4-C11 1 OCH3 OCH3 α型 2 OCH3 OCH3 β型 3（△3，4） OCH3 OCH3 4（△3，4） OCH3 OH 5 OCH3 OH α型 6 H N（CH3）2 β型 7 H N（CH3）2 α型 8（△3，4） H N（CH3）2 9 H OH β型 10 H OH α型 2. 结果
2.1 化合物的波谱数据
13C NMR数据（100 MHz，CDCl3 δ in ppm）。
2.2 抗PTP1B活性研究
PTP1B是第一个被鉴定的蛋白酪氨酸磷酸酯酶（protein tyrosine phosphatase），从大肠杆菌中表达并纯化的GST融合蛋白，通过对胰岛素受体的脱磷酰化，影响胰岛素的敏感性和脂肪代谢。PTP1B与2型糖尿病的发病和肥胖症发病及发展密切相关，因此筛选出具有高活性、高选择性的PTP1B抑制剂至关重要[13-15]。在活性实验中所使用的紫外底物是PNPP（α-吡啶甲酸对硝基苯酚酯），PTP1B水解PNPP的产物在410 nm处有强吸收，可以通过监测其光吸收的变化来初步评价化合物对PTP1B的抑制作用。基于之前的活性研究结果，笔者选取部分结构进行了抗PTP1B活性实验，实验数据见表2，表3。
表 2 9个拟单萜生物碱的13C NMR数据Table 2. 13C NMR data of 9 monoterpenoid alkaloidsC genipin[7] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 97.4 50.5 53.7 47.7 55.8 51.7 50.6 47.4 54.3 51.3 3 144.9 55.8 54.5 144.8 50.3 53.4 56.2 146.1 55.4 56.7 4 108.7 43.3 45.7 128.8 42.9 45.2 41.4 98.4 45.4 43.7 5 19.4 39.1 40.4 35.9 38.8 32.0 39.2 39.1 40.2 40.1 6 31.2 30.0 36.1 39.4 30.1 35.9 29.7 34.5 36.6 30.0 7 120.4 125.4 128.6 128.0 125.9 127.8 125.3 126.4 126.5 124.1 8 147.3 147.6 147.3 147.7 146.6 144.9 147.7 144.9 147.0 149.7 9 47.3 42.0 43.5 41.3 41.3 43.5 42.1 41.8 44.8 42.5 10 68.6 60.7 60.4 57.5 61.0 60.7 61.1 60.4 62.0 61.5 11 165 173.8 174.6 169.4 173.2 174.7 173.9 170.0 176.2 174.2 酯OCH3 50.8 51.5 51.8 50.5 51.6 54.4 51.4 57.7 52.3 51.5 1′ 61.1 60.5 61.3 60.4 60.0 60.9 50.3 60.6 60.5 2′ 33.1 32.9 35.3 32.5 29.2 30.1 35.7 33.3 33.0 3′ 132.6 132.3 130.9 131.0 128.0 128.2 129.2 132.1 131.5 4′ 111.2 111.2 111.4 111.4 129.1 129.3 126.8 130.6 130.3 5′ 148.9 148.8 148.9 147.3 113.1 113.0 113.1 116.2 115.9 6′ 147.3 145.0 145.7 144.2 149.2 149.2 149.4 156.6 156.5 7′ 112.0 111.9 112.0 114.4 113.1 113.0 113.1 116.2 116.2 8′ 120.5 120.4 120.7 121.3 129.1 129.3 126.8 130.6 130.6 芳OCH N（CH3）2 55.9 55.2 55.9 55.8 55.9 55.7 55.9 40.8 40.9 40.7 表 3 部分化合物对PTP1B的抑制率（ $\bar x \pm s $）Table 3. The inhibition activity of part of products against PTP1B （ $\bar x \pm s $）试样 试样浓度 抑制率（%） 2 20 μg/mL 16.50 ± 1.79 9 20 μg/mL 15.13 ± 4.51 注：抗PTP1B活性筛选由国家新药筛选中心完成。 3. 讨论
3.1 结构确认
在拟生物碱结构确定过程中，既参考原料京尼平的波谱数据[16]，又考虑了C4和C11间以β（α）型键相连的异构体，C6的化学信号在35～36 ppm（28～30 ppm）之间；β型取向产物的Rf值明显大于其α型[17]。
3.2 药理结果
合成的衍生物具有不同程度的糖尿病药物靶标PTP1B酶抑制活性，为研究抗PTP1B化合物构效关系提供理论基础，有助于筛选出高效的PTP1B酶抑制剂。
3.3 研究前景
通过分析已知药物的化学结构，设计合成其衍生物及其结构类似物，再进行药理、毒理学的探究，从而发现新的先导化合物，能有效解决植物资源短缺、构建活性筛选的化合物库和确定一类化合物的构效关系，更好地有利于这些化合物在药效学、药动学研究。
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表 1 反应产物
Table 1. Products of reaction
R1 R2 C4-C11 1 OCH3 OCH3 α型 2 OCH3 OCH3 β型 3（△3，4） OCH3 OCH3 4（△3，4） OCH3 OH 5 OCH3 OH α型 6 H N（CH3）2 β型 7 H N（CH3）2 α型 8（△3，4） H N（CH3）2 9 H OH β型 10 H OH α型 
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表 2 9个拟单萜生物碱的13C NMR数据
Table 2. 13C NMR data of 9 monoterpenoid alkaloids
C genipin[7] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 97.4 50.5 53.7 47.7 55.8 51.7 50.6 47.4 54.3 51.3 3 144.9 55.8 54.5 144.8 50.3 53.4 56.2 146.1 55.4 56.7 4 108.7 43.3 45.7 128.8 42.9 45.2 41.4 98.4 45.4 43.7 5 19.4 39.1 40.4 35.9 38.8 32.0 39.2 39.1 40.2 40.1 6 31.2 30.0 36.1 39.4 30.1 35.9 29.7 34.5 36.6 30.0 7 120.4 125.4 128.6 128.0 125.9 127.8 125.3 126.4 126.5 124.1 8 147.3 147.6 147.3 147.7 146.6 144.9 147.7 144.9 147.0 149.7 9 47.3 42.0 43.5 41.3 41.3 43.5 42.1 41.8 44.8 42.5 10 68.6 60.7 60.4 57.5 61.0 60.7 61.1 60.4 62.0 61.5 11 165 173.8 174.6 169.4 173.2 174.7 173.9 170.0 176.2 174.2 酯OCH3 50.8 51.5 51.8 50.5 51.6 54.4 51.4 57.7 52.3 51.5 1′ 61.1 60.5 61.3 60.4 60.0 60.9 50.3 60.6 60.5 2′ 33.1 32.9 35.3 32.5 29.2 30.1 35.7 33.3 33.0 3′ 132.6 132.3 130.9 131.0 128.0 128.2 129.2 132.1 131.5 4′ 111.2 111.2 111.4 111.4 129.1 129.3 126.8 130.6 130.3 5′ 148.9 148.8 148.9 147.3 113.1 113.0 113.1 116.2 115.9 6′ 147.3 145.0 145.7 144.2 149.2 149.2 149.4 156.6 156.5 7′ 112.0 111.9 112.0 114.4 113.1 113.0 113.1 116.2 116.2 8′ 120.5 120.4 120.7 121.3 129.1 129.3 126.8 130.6 130.6 芳OCH N（CH3）2 55.9 55.2 55.9 55.8 55.9 55.7 55.9 40.8 40.9 40.7
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表 3 部分化合物对PTP1B的抑制率（ $\bar x \pm s $）
Table 3. The inhibition activity of part of products against PTP1B （ $\bar x \pm s $）
试样 试样浓度 抑制率（%） 2 20 μg/mL 16.50 ± 1.79 9 20 μg/mL 15.13 ± 4.51 注：抗PTP1B活性筛选由国家新药筛选中心完成。
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