M2 Macrophage-derived Exosome miR-1246 Regulates the Growth and Invasion of Gastric Cancer Cells
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摘要:
目的 探讨M2巨噬细胞来源的外泌体miR-1246对胃癌AGS细胞增殖，凋亡和侵袭的影响。 方法 采用IL-4和IL-13诱导M2巨噬细胞后，分离其外泌体，并通过透射电镜和免疫印迹法进行鉴定。M2巨噬细胞分别转染NC inhibitor和miR-1246 inhibitor后，分离对应外泌体与AGS细胞共培养，并采用CCK-8，Annexin V-FITC/PI和Transwell分别检测AGS细胞增殖，凋亡和侵袭。TargetScan数据库预测miR-1246下游靶标，并通过双荧光素酶报告基因实验对miR-1246和GSK3B的靶向关系进行验证。 结果 M2巨噬细胞中分离的外泌体大小为50～150 nm，且表达ALIX，CD63和TSG101。M2巨噬细胞来源外泌体增加AGS细胞活力（P < 0.05）和侵袭细胞数（P < 0.01），并降低其凋亡比例（P < 0.01）。敲低外泌体中miR-1246的表达，AGS细胞的表型变化得到回复（P < 0.01）。外泌体miR-1246靶向GSK3B，并调控β-catenin和c-Myc的表达，M2巨噬细胞来源外泌体miR-1246靶向GSK3B促进胃癌细胞增殖和侵袭、并抑制其凋亡（P < 0.001）。 结论 M2巨噬细胞来源外泌体miR-1246靶向GSK3B介导Wnt通路激活促进胃癌细胞增殖和侵袭，并抑制其凋亡。 Abstract:Objective To investigate the effects of M2 macrophage-derived exosome miR-1246 on the proliferation, apoptosis and invasion of AGS cells. Methods After induction of M2 macrophages using LPS and IFN-γ, their exosomes were isolated and identified by transmission electron microscopy and western blot. After M2 macrophages were transfected with NC inhibitor and miR-1246 inhibitor respectively, the corresponding exosomes were isolated and co-cultured with AGS cells, and proliferation, apoptosis, and invasion of AGS cells were detected by CCK-8, Annexin V-FITC/PI and Transwell, respectively. TargetScan database predicted miR-1246 downstream targets and the targeting relationship between miR-1246 and GSK3B was validated by dual-luciferase reporter gene assays. Results The exosomes isolated from M2 macrophages were 30-150 nm in size and expressed ALIX, CD63 and TSG101. M2 macrophage-derived exosomes increased the viability and invasive cell count of AGS cells and decreased their apoptotic ratio. Phenotypic changes in AGS cells were reverted by knocking down the expression of miR-1246 in exosomes. Exosome miR-1246 targets GSK3B and upregulated the expression of β-catenin and c-Myc. Conclusion M2 macrophage-derived exosome miR-1246 mediates Wnt pathway activation to promote proliferation and invasion of gastric cancer cells and inhibit their apoptosis via targeting GSK3B. -
Key words:
- Gastric cancer /
- Macrophages /
- Exosomes /
- miR-1246 /
- Wnt signaling pathway
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胃癌（gastric cancer，GC）目前是全球第五大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第三大原因[1-2]。GC的发病率和死亡率在东亚（特别是在韩国、蒙古、日本和中国）最高，GC已成为中国第二致命的癌症[3-4]。GC通常在晚期被诊断出来，由于缺乏敏感和特异性的早期诊断，5 a总生存率约为20%～30%[5]。因此，深度探讨GC的发生发展机制对GC的治疗意义重大。
大量的研究表明，肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中癌细胞与周围基质细胞之间的细胞相互作用在调节癌症进展和治疗反应中起着关键作用[6]。作为TME的主要群体之一，巨噬细胞通常表现为M2样表型与癌细胞相互作用，促进肿瘤发生，进展和治疗抵抗[7-8]。越来越多的证据表明，巨噬细胞调节癌细胞的治疗反应，它们现在被认为是抗癌治疗的潜在靶点[9-11]。然而，抗癌治疗与TAM之间的详细相互作用尚不清楚。
外泌体是细胞外囊泡之一，大小在50～150 nm范围内，由许多细胞分泌，并通过传递细胞内物质（例如蛋白质，脂质和mRNA等）参与细胞间通讯[12]。研究表明，TME细胞之间通过外泌体的细胞通讯与肿瘤转移和化疗耐药性有关[13-15]。microRNA（miRNA）是一类18～22个核苷酸的小单链非编码RNA分子，在转录后水平上控制多个靶基因的表达[16]。外泌体的脂质膜保护内部miRNA不被RNA酶消化[12]。越来越多的证据表明，miRNA通过外泌体转移有助于多种肿瘤类型化学抵抗力的发展。Shi等[17]表明，GC患者临床血清样本外泌体中，miR-1246异常高表达，并且预测其为GC早期诊断的潜在生物标志物。Qian等[18]对GC患者血浆和尿中miRNA的生物信息学分析也表明了这一观点。但是miR-1246对GC恶性生物学行为的作用还有待于验证，并且M2巨噬细胞来源外泌体中是否含有miR-1246，并以此调控GC进程也是未知的
综上所述，本研究拟探讨M2巨噬细胞来源外泌体对GC生长和侵袭的影响，并深究其中是否有miR-1246的参与。旨在揭示巨噬细胞与GC细胞之间的一种新的通讯机制，而且可能为GC患者提供一个有前景的新的治疗靶点。
1. 材料与方法
1.1 M2巨噬细胞诱导及鉴定
THP-1细胞和完全培养液购买中国科学院细胞库（货号：TCHu57）。THP-1细胞接种于THP-1完全培养液中，并在培养箱条件为37℃，5% CO2，90%湿度下进行培养。采用100 ng/mL LPMA刺激THP-1细胞6 h以诱导M0巨噬细胞，为Control组。采用20 ng/mL IL-4和20 ng/mL IL-13孵育M0巨噬细胞48 h以诱导M2巨噬细胞，为Stimulated组。收集极化前后的巨噬细胞，采用免疫印迹实验（Western Blot，WB）检测M2巨噬细胞标志物INOS和CD86的表达以鉴定M2巨噬细胞。
1.2 M2巨噬细胞来源外泌体诱导及鉴定
参照文献[19]对M2巨噬细胞来源外泌体采用超速离心法进行分离。M2巨噬细胞上清液分别采用300×g离心5 min、2 000×g离心5 min、12000×g离心30 min，并用0.22 μm滤网过滤以去除上清液中的细胞碎片和大囊泡。采用110 000×g超速离心法收集外泌体，PBS悬液洗涤后，再按110 000×g收集外泌体，然后将外泌体悬浮于200 μL PBS悬液中。采用透射电镜观察外泌体的大小及结构。分离的外泌体与4%多聚甲醛混合。然后将外泌体滴到Formvar碳涂层的电子显微镜网格上，并用1%戊二醛固定10 min。用2%乙酸铀酰溶液对样品进行负染色。使用Tecnai透射电子显微镜在163 KV下获得图像。采用WB检测外泌体中外泌体标志物ALIX，CD63和TSG101的表达。
1.3 细胞分组及转染
AGS细胞购买于中国科学院细胞库（货号：TCHu232）。AGS细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基（含100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）中，并于37℃和5% CO2的培养箱中培养。AGS细胞随机分为NC组（AGS细胞正常培养），M2-exo组（AGS细胞与M2巨噬细胞来源外泌体共培养），M2-exo/NCinhibitor组（AGS细胞与转染NCinhibitor的M2巨噬细胞来源外泌体共培养），M2-exo/miR-1246 inhibitor组（AGS细胞与转染miR-1246 inhibitor的M2巨噬细胞来源外泌体共培养）和M2-exo+DDK1组（AGS细胞与M2巨噬细胞来源外泌体共培养，并采用Wnt通路阻断剂重组人DDK1进行处理）。对于细胞转染，参考Lipofectamine 2000试剂盒说明书，在M2巨噬细胞中分别转染NCinhibitor和miR-1246 inhibitor。转染24 h后，分离对应的外泌体根据组别信息与AGS细胞进行共培养。
1.4 CCK-8实验检测AGS细胞增殖
实验程序是根据CCK-8试剂盒上提供的说明书进行的。将各组AGS细胞以2×103/孔的密度接种到96孔板中并孵育24 h。随后，将10 μL CCK-8试剂加入到含AGS细胞的96孔板中以进一步孵育。通过Multiskan FC酶标仪在450 nm 处测量24 h时AGS细胞的吸光度。
1.5 流式细胞术检测AGS细胞凋亡
各组AGS细胞浓度为1×106个/mL，并用预冷的70%乙醇溶液固定，在4℃静置过夜。取100 μL AGS细胞悬液，离心后重悬于200 μL binding buffer中。随后加入10 μL FITC和5 μL PI，与细胞悬液轻轻混合，室温避光反应15 min。随后加入300 μL binding buffer，采用流式细胞仪在488 nm波长下检测细胞凋亡。
1.6 Transwell实验AGS检测细胞侵袭
用DMEM将Matrigel原液稀释成1/3，然后将该溶液涂覆在Transwell的上室中，然后在37℃的培养箱中孵育4 h，直至获得Matrigel凝固。各组AGS细胞悬液用100 μL无血清培养基稀释至约1×106个/mL。接种后，在基底外侧小室中加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM。37℃、5% CO2的培养箱中孵育24 h后，将Transwell小室用4%多聚甲醛进行固定，并用结晶紫染色5 min。清除内表面的细胞后，在倒置荧光显微镜下拍照，计算穿透小室的细胞平均数量。
1.7 实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time quantitative polymerasechain reaction，RT-qPCR）检测miR-1246的表达
采用TRIzol实际分离M2巨噬细胞来源外泌体和AGS细胞的总RNA，并通过紫外分光光度计测定总RNA浓度。参考Mir-X™ miRNA First-Strand Synthesis Kit试剂盒说明，将总RNA逆转录为cDNA。随后，SYBR Premix Ex Taq试剂盒通过7900 HT Real-Time PCR系统进行PCR检测miR-1246的表达，并将U6作为内部参考。采用2-ΔΔct法计算miR-1246的相对表达水平。本研究使用的引物如下：miR-1246 sense：5′-GCTGACCGATTTCTCCTGGT-3′； miR-1246 antisense：5′-TCCCCCTACATCATAACCGA-3′；U6 sense：5′-CTAGATAATGGTGCTGATAGATGGA-3′；U6 antisense：5′-GGCACACCAGAAATCGAAGC-3′。
1.8 WB检测凋亡相关蛋白以及M2巨噬细胞标志物（INOS和CD86），外泌体标志物（ALIX，CD63和TSG101），GSK3B，β-catenin和c-Myc的表达
使用RIPA裂解缓冲液提M2巨噬细胞来源外泌体和AGS细胞的总蛋白。在4℃离心15 min后，收集上清液使用BCA试剂盒测定和定量蛋白浓度。使用丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白并转移到聚偏二氟乙烯膜上。5%脱脂牛奶阻断后，膜中加入稀释的一抗：INOS（1：1000），CD86（1∶2000），ALIX（1∶2000），CD63（1∶1000），TSG101（1∶2000），claved-Caspase 3 （1∶500），BAX（1∶1000），Bcl2（1∶2000），GSK3B（1∶3000），β-catenin（1∶1000）和c-Myc（1∶2000），在4℃下孵育过夜。随后，在室温下用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1∶20000）或山羊抗小鼠IgG（1∶5000）稀释孵育1 h。采用Image J软件进行蛋白质定量分析。蛋白水平的相对表达水平表示为目标条带灰度值与内部参考GAPDH灰度值的比值。
1.9 双荧光素酶报告基因实验验证miR-1246和GSK3B的靶向关系
通过TargetScan数据库预测miR-1246和GSK3B的潜在结合序列。分别设计GSK3B与miR-1246结合位点野生型和突变型的双荧光素酶报告载体，即WT-GSK3B和MUT-GSK3B。通过Lipofectamine 2000试剂盒将两个报告质粒分别与NCmimic和miR-1246mimic和pRL-TK（表达海肾荧光素酶的内参考质粒）共转染至HEK293细胞。转染24 h后，采用双荧光素酶报告系统定荧光素酶活性，并用用萤火虫荧光素酶活性进行归一化。
1.10 统计学处理
采用GraphpadPrism软件进行统计学分析。符合正态分布且方差齐性的计量资料以均数±标准差表示。2组间数据比较采用独立样本t检验，组间比较采用单因素方差分析，多组间比较采用双因素方差分析，如有差异进一步用Turkey’s检测两两比较。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 M2巨噬细胞来源外泌体的分离及鉴定
采用IL-4和IL-13处理M0巨噬细胞后，WB结果表明，M2巨噬细胞INOS和CD86的表达水平升高（图1A，P < 0.01）。这表明笔者成功诱导了M2巨噬细胞。进一步分离N1巨噬细胞分泌的外泌体。透射电镜结果显示，分离的囊泡具有双层膜结构，并且囊泡大小范围为50～150 nm（图1B）。此外，M2巨噬细胞分离的囊泡中表达外泌体标志物ALIX，CD63和TSG101，但是M2巨噬细胞上清液中未见这些标志物的表达（图1C）。提示分离的囊泡为M2巨噬细胞来源外泌体。
图 1 成功分离M2巨噬细胞来源外泌体A：采用WB检测M2巨噬细胞中标志物（INOS和CD86）的表达水平；B：M2巨噬细胞来源外泌体的透射电镜代表性图片（×1 000）；C：WB检测M2巨噬细胞上清液和分离的囊泡中外泌体标志物（ALIX，CD63和TSG101）的表达水平。相较于Control组，**P < 0.01。Figure 1. Exosomes derived from M2 macrophages were successfully isolated2.2 M2巨噬细胞来源外泌体对AGS细胞增殖，凋亡和侵袭的影响
评估M2巨噬细胞来源外泌体对胃癌AGS细胞恶性表型的影响。M2巨噬细胞来源外泌体与AGS细胞共培养后，相较于NC组，M2-exo组中AGS细胞活力增加（图2A，P < 0.05），凋亡比例显著降低（图2B，P < 0.01），细胞侵袭数增加（图2C，P < 0.01）。值得注意地，M2巨噬细胞来源外泌体处理后，AGS细胞中miR-1246的表达水平增加（图2D，P < 0.001）。同样的，M2巨噬细胞来源外泌体与AGS细胞共培养后，相较于NC组，凋亡相关蛋白claved-caspase3，BAX表达下降，而BCL2表达上升（图2E）。以上结果提示，M2巨噬细胞来源外泌体促进AGS细胞增殖和侵袭，并抑制其凋亡，miR-1246可能在这一过程中起到调控作用。
图 2 M2巨噬细胞来源外泌体促进AGS细胞增殖和侵袭，并抑制其凋亡A：CCK-8检测M2巨噬细胞来源外泌体对AGS细胞活力的影响；B：Annexin V-FITC/PI检测AGS细胞凋亡的流式结果；C：Transwell检测AGS细胞侵袭的代表性图片和统计分析（×40）；D：RT-qPCR检测M2巨噬细胞来源外泌体对AGS细胞中miR-1246表达的影响；E：Western blot 检测凋亡相关蛋白claved-caspase3，BAX以及BCL2表达。相较于NC组，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。Figure 2. M2 macrophage-derived exosomes promoted the proliferation and invasion of AGS cells，and inhibited their apoptosis2.3 M2巨噬细胞来源外泌体miR-1246对AGS细胞增殖，凋亡和侵袭的影响
评估M2巨噬细胞来源外泌体对胃癌AGS细胞恶性表型的调控是否是通过miR-1246所实现的。笔者在M2巨噬细胞中转染了miR-1246 inhibitor，并分离了对应的外泌体与AGS细胞共培养。RT-qPCR结果显示，相较于NC组，M2-exo/NC inhibitor组中AGS细胞中miR-1246的表达水平增加（图3A，P < 0.001）；较于M2-exo/NC inhibitor组，M2-exo/miR-1246 inhibitor组中AGS细胞中miR-1246的表达水平降低（图3A，P < 0.001）。此外，敲低M2巨噬细胞来源外泌体中miR-1246的表达水平后，AGS细胞的增殖活力降低（图3B，P < 0.05）。敲低M2巨噬细胞来源外泌体中miR-1246的表达水平后，凋亡相关蛋白claved-caspase3，BAX表达上升，而BCL2表达下降（图3C，P < 0.001），凋亡比例增加（图3C，P < 0.01），细胞侵袭数降低（图3D，P < 0.01）。提示M2巨噬细胞来源外泌体中miR-1246促进AGS细胞生长和侵袭。
图 3 M2巨噬细胞来源外泌体miR-1246促进AGS细胞增殖和侵袭，并抑制其凋亡A：RT-qPCR检测各组AGS细胞中miR-1246的表达变化；B：由CCK-8试剂盒检测得到的AGS细胞活力变化；C：Western blot 检测凋亡相关蛋白claved-caspase3，BAX以及BCL2表达；D：AGS细胞凋亡比例的流式代表性图片和统计分析结果；E：Transwell检测AGS细胞的侵袭变化（×40）。相较于NC组，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；相较于M2-exo/NCinhibitor组，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001。Figure 3. M2 macrophage-derived exosome miR-1246 promoted the proliferation and invasion of AGS cells，and inhibited their apoptosis2.4 miR-1246下游靶基因的预测及验证
为了探讨miR-1246的下游靶标，通过TargetScan（https://starbase.sysu. edu.cn/）对结合靶点进行了预测。如图4A所示，GSK3B可能是miR-1246的下游靶标，并展示了两者的潜在结合序列。突变GSK3B后，采用双荧光素酶报告基因实验对miR-1246和GSK3B的靶向关系进行了验证。结果显示，相较于NCmimic组，miR-1246mimic组中野生型GSK3B的荧光素酶活性降低（图4B，P < 0.01），但是2组的突变型GSK3B的荧光素酶活性无显著性差异（图4B，P > 0.05）。此外，M2巨噬细胞来源外泌体处理后，AGS细胞中GSK3B蛋白的表达水平降低，但是，敲低M2巨噬细胞来源外泌体miR-1246，GSK3B蛋白的表达水平得到回复（图4C，P < 0.01）。GSK3B被公认为是Wnt信号通路的核心蛋白之一，因此检测了M2巨噬细胞来源外泌体miR-1246是否能够调控Wnt通路。结果显示，相较于NC组，M2-exo/NC inhibitor组中AGS细胞中β-catenin和c-Myc的表达水平增加（图4D，P < 0.01）；较M2-exo/NC inhibitor组，M2-exo/miR-1246 inhibitor组中AGS细胞中β-catenin和c-Myc的表达水平降低（图4D，P < 0.01）；M2-exo/miR-1246 inhibitor和M2-exo+DDK1组中β-catenin和c-Myc的表达水平无显著性差异（图4D，P > 0.05）。提示GSK3B是miR-1246的下游靶标，并且miR-1246能够激活Wnt信号通路。
图 4 miR-1246靶向调控Wnt信号通路A：TargetScan数据库预测得到的miR-1246与GSK3B的潜在结合序列；B：双荧光素酶报告基因实验验证miR-1246与GSK3B的靶向关系；C：WB检测M2巨噬细胞来源外泌体miR-1246对AGS细胞中GSK3B蛋白表达的影响；D：WB检测M2巨噬细胞来源外泌体miR-1246对AGS细胞中Wnt信号通路的影响。相较于NCmimic组，**P < 0.01；相较于NC组，aP < 0.05，aaP < 0.01；相较于M2-exo/NCinhibitor组，bP < 0.05，bbP < 0.01；ns表示差异无统计学意义。Figure 4. miR-1246 targets the Wnt signaling pathway2.5 M2巨噬细胞来源外泌体miR-1246靶向GSK3B促进胃癌细胞增殖和侵袭、并抑制其凋亡
相较于NC组，M2-exo/NC inhibitor组中AGS细胞中细胞活力以及侵袭细胞数增加，凋亡细胞数减少，凋亡相关蛋白claved-caspase3，BAX表达凋亡相关蛋白claved-caspase3，BAX表达下降，而BCL2表达上升，而BCL2表达上升，较M2-exo/NC inhibitor组，M2-exo/miR-1246 inhibitor组中AGS细胞中细胞活力以及侵袭细胞数降低，凋亡细胞数升高，凋亡相关蛋白claved-caspase3，BAX表达上升，而BCL2表达下降，M2-exo/miR-1246 inhibitor和M2-exo+DDK1组中细胞活力，侵袭细胞数以及凋亡细胞数无性差异（图5 A-E），提示M2巨噬细胞来源外泌体miR-1246靶向GSK3B促进胃癌细胞增殖和侵袭、并抑制其凋亡。
图 5 M2巨噬细胞来源外泌体miR-1246靶向GSK3B促进胃癌细胞增殖和侵袭、并抑制其凋亡A：由CCK-8试剂盒检测得到的AGS细胞活力变化；B：AGS细胞凋亡比例的统计分析结果；C：Transwell检测AGS细胞的侵袭变化统计分析结果；D：AGS细胞凋亡比例的流式代表性图片；E：Transwell检测AGS细胞的侵袭变化代表性图片（×40）；F：Western blot 检测凋亡相关蛋白claved-caspase3，BAX以及BCL2表达。相较于NC组，aP < 0.05，aaP < 0.01，aaaP < 0.001；相较于M2-exo/NCinhibitor组，bP < 0.05，bbP < 0.01；ns表示差异无统计学意义。Figure 5. M2 macrophage-derived exosome miR-1246 targets GSK3B to promote proliferation and invasion and inhibit apoptosis of gastric cancer cells3. 讨论
GC的早期阶段是无症状的，因此诊断总是延迟，错过了最佳的治疗机会。尽管诊断方法和各种治疗方法取得了进展，但GC患者的预后（特别是III和IV的临床阶段）仍然较差。因此，有必要全面了解GC的潜在分子机制，这些机制可能有助于开发新的诊断和治疗方法。在本研究中，笔者探讨了M2巨噬细胞来源的外泌体对胃癌生长和侵袭的影响，并发现M2巨噬细胞来源外泌体miR-1246靶向GSK3B介导Wnt通路激活促进胃癌细胞增殖和侵袭，并抑制其凋亡。
外泌体由多种细胞尤其是肿瘤细胞分泌，并在癌症患者的血液中循环，可能与肿瘤进展有关[20]。近年来，越来越多的证据表明，外泌体可以通过肿瘤细胞与周围基质细胞之间的通讯，产生免疫抑制环境，促进肿瘤的进展[20-21]。巨噬细胞，尤其是M2巨噬细胞，在肿瘤的发生和发展中发挥着重要作用，因为它们可以刺激免疫抑制、转移和抗肿瘤治疗的耐药性[22]。Zheng等[23]表明，肿瘤相关巨噬细胞衍生的外泌体miR-21的外体移植赋予胃癌细胞顺铂耐药性。来自M2巨噬细胞的外泌体miR-487a促进了胃癌的增殖和肿瘤发生[24]。笔者的结果也表明，M2巨噬细胞来源的外泌体能够促进胃癌的发展进程，并且证明这是通过外泌体中的miR-1246所实现的。此前的研究已表明，miR-1246即可作为抑癌或促癌因子对多种恶性肿瘤的表型具有调控作用。例如，miR-1246靶向CCNG2以增强口腔癌中的癌症干性和化学抵抗力[25]。miR-1246通过靶向肺癌细胞中的CXCR4来抑制细胞侵袭和上皮间充质转化过程[26]。仅一些生信研究表明，胃癌患者血清或尿液中外泌体miR-1246可作为胃癌患者诊断的潜在生物标志物[17-18]。但是，尚缺乏miR-1246对胃癌具体作用机制的研究。在笔者的研究中弥补了这一缺陷，证明了miR-1246在胃癌中作为促癌因子，促进胃癌细胞增殖和侵袭，并抑制其凋亡，且GSK3B是其下游靶标。
GSK3B是一种多底物靶蛋白激酶，是Wnt/β-catenin信号通路的重要组成部分。Wnt/β-catenin信号通路在胚胎和各种恶性肿瘤的发育中起重要作用。在没有Wnt信号传导的情况下，β-catenin在N端残基上被GSK3B组成性磷酸化，然后通过泛素化靶向降解[27-28]。相反，GSK3B活性的抑制有助于细胞质中β-catenin的积累，随后其核易位结合LEF/TCF转录因子家族，这有助于c-Myc、Cyclin D1等基因的转录，而这些基因有助于癌症的发展进程[27-28]。本研究中，笔者分析，M2巨噬细胞来源外泌体miR-1246能够靶向抑制胃癌细胞中GSK3B的表达，这有助于激活Wnt/β-catenin信号通路，进而促进胃癌细胞的恶性表型如增殖侵袭以及凋亡抑制。值得注意地，此前的研究也表明，miR-1246能够通过调控GSK3B介导Wnt/β-catenin参与多种肿瘤的发展进程。例如，miR-1246通过GSK3B/β-catenin信号通路促进人乳腺癌细胞中的多西他赛耐药性[29]。miR-1246通过靶向GSK3B介导的Wnt/β-catenin通路促进A549肺癌细胞的转移和侵袭[30]。
总之，笔者的结果深入了解胃癌细胞发展的机制，为潜在的胃癌基因治疗靶点提供了理论基础，并建议靶向miR-1246可能为胃癌的生物标志物和治疗靶点。
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图 1 成功分离M2巨噬细胞来源外泌体
A：采用WB检测M2巨噬细胞中标志物（INOS和CD86）的表达水平；B：M2巨噬细胞来源外泌体的透射电镜代表性图片（×1 000）；C：WB检测M2巨噬细胞上清液和分离的囊泡中外泌体标志物（ALIX，CD63和TSG101）的表达水平。相较于Control组，**P < 0.01。
Figure 1. Exosomes derived from M2 macrophages were successfully isolated
图 2 M2巨噬细胞来源外泌体促进AGS细胞增殖和侵袭，并抑制其凋亡
A：CCK-8检测M2巨噬细胞来源外泌体对AGS细胞活力的影响；B：Annexin V-FITC/PI检测AGS细胞凋亡的流式结果；C：Transwell检测AGS细胞侵袭的代表性图片和统计分析（×40）；D：RT-qPCR检测M2巨噬细胞来源外泌体对AGS细胞中miR-1246表达的影响；E：Western blot 检测凋亡相关蛋白claved-caspase3，BAX以及BCL2表达。相较于NC组，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
Figure 2. M2 macrophage-derived exosomes promoted the proliferation and invasion of AGS cells，and inhibited their apoptosis
图 3 M2巨噬细胞来源外泌体miR-1246促进AGS细胞增殖和侵袭，并抑制其凋亡
A：RT-qPCR检测各组AGS细胞中miR-1246的表达变化；B：由CCK-8试剂盒检测得到的AGS细胞活力变化；C：Western blot 检测凋亡相关蛋白claved-caspase3，BAX以及BCL2表达；D：AGS细胞凋亡比例的流式代表性图片和统计分析结果；E：Transwell检测AGS细胞的侵袭变化（×40）。相较于NC组，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；相较于M2-exo/NCinhibitor组，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001。
Figure 3. M2 macrophage-derived exosome miR-1246 promoted the proliferation and invasion of AGS cells，and inhibited their apoptosis
图 4 miR-1246靶向调控Wnt信号通路
A：TargetScan数据库预测得到的miR-1246与GSK3B的潜在结合序列；B：双荧光素酶报告基因实验验证miR-1246与GSK3B的靶向关系；C：WB检测M2巨噬细胞来源外泌体miR-1246对AGS细胞中GSK3B蛋白表达的影响；D：WB检测M2巨噬细胞来源外泌体miR-1246对AGS细胞中Wnt信号通路的影响。相较于NCmimic组，**P < 0.01；相较于NC组，aP < 0.05，aaP < 0.01；相较于M2-exo/NCinhibitor组，bP < 0.05，bbP < 0.01；ns表示差异无统计学意义。
Figure 4. miR-1246 targets the Wnt signaling pathway
图 5 M2巨噬细胞来源外泌体miR-1246靶向GSK3B促进胃癌细胞增殖和侵袭、并抑制其凋亡
A：由CCK-8试剂盒检测得到的AGS细胞活力变化；B：AGS细胞凋亡比例的统计分析结果；C：Transwell检测AGS细胞的侵袭变化统计分析结果；D：AGS细胞凋亡比例的流式代表性图片；E：Transwell检测AGS细胞的侵袭变化代表性图片（×40）；F：Western blot 检测凋亡相关蛋白claved-caspase3，BAX以及BCL2表达。相较于NC组，aP < 0.05，aaP < 0.01，aaaP < 0.001；相较于M2-exo/NCinhibitor组，bP < 0.05，bbP < 0.01；ns表示差异无统计学意义。
Figure 5. M2 macrophage-derived exosome miR-1246 targets GSK3B to promote proliferation and invasion and inhibit apoptosis of gastric cancer cells
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