Effect of PTEN Gene Expression on Apoptosis of Thyroid Cancer Cells BCPAP and FTC133 and Expression of ERK and AKT
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摘要:
目的 探讨PTEN基因表达对甲状腺癌BCPAP细胞和FTC133细胞凋亡以及信号通路蛋白ERK和AKT表达的影响。 方法 BCPAP细胞和FTC133细胞经PTEN-pCMV6转染和si-PTEN RNA干扰后，光镜下观察细胞形态变化，MTT检测细胞活力，Annexin V-FITC和PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡率，Western blot检测Caspase 8、9、12、3、Bax、Bcl-2、ERK和AKT的表达水平，分析PTEN基因的不同表达与甲状腺癌BCPAP和FTC133细胞凋亡以及信号通路蛋白表达的关系。 结果 与对照组相比较，甲状腺癌BCPAP和FTC133细胞在PTEN基因过表达时，光镜下均出现细胞变形、体积缩小、核固缩等凋亡改变，细胞活力降低（P < 0.01），细胞凋亡率增加（P < 0.01），凋亡蛋白Caspase 8、9、12、3以及促凋亡蛋白Bax表达量增加（P < 0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2表达量减低（P < 0.01），ERK和AKT表达量均较对照组减低（P < 0.05），ERK的相对表达量在FTC133细胞的减低程度显著高于BCPAP细胞（P < 0.01），AKT的相对表达量减低程度在BCPAP和FTC133，差异无统计学意义（P > 0.05）；PTEN基因干扰表达减低时，光镜下BCPAP和FTC133细胞数目、细胞形态、体积及细胞核形态变化、细胞活力和细胞凋亡率变化，差异无统计学意义（P > 0.05）；凋亡蛋白Caspase 8、9、12、3以及促凋亡蛋白Bax表达量减低（P < 0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2表达量增加（P < 0.01），FTC133细胞ERK和AKT表达量分别较空白对照组均为增高（P < 0.01），BCPAP细胞ERK表达量较对照组增高（P < 0.01）。而AKT表达量与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），ERK的相对表达量增高程度在BCPAP和FTC133，差异无统计学意义（P > 0.05），AKT的相对表达量在FTC133细胞的增高程度显著高于BCPAP细胞（P < 0.05）。 结论 PTEN基因可促进BCPAP和FTC133细胞凋亡，线粒体途径、死亡受体途径和内质网激活通路均参与BCPAP和FTC133细胞凋亡的过程，ERK在PTEN基因调控BCPAP细胞凋亡发挥重要作用，而AKT和ERK均参与PTEN基因促进FTC133凋亡的过程。 Abstract:Objective To investigate the effect of PTEN gene expression on the apoptosis of BCPAP cells and FTC133 thyroid cancer cells and on the expression of signal pathway proteins ERK and AKT. Methods BCPAP cells and FTC133 cells were transfected with PTEN-pCMV6 and silenced si-PTEN RNA, before the cell microscopic morphology changes were observed. Cell viability was measured by MTT, and apoptosis rate was measured by Annexin V-FITC and PI double staining flow cytometer, respectively. Furthermore, the protein expression levels of ERK, AKT, Bax, Bcl-2, caspase 8, 9, 12 and 3 were detected by Western blot. The association between different expression of PTEN gene and the apoptosis of BCPAP and FTC133 thyroid cancer cells and the expression of signal pathway proteins were analyzed. Results Compared with control group, when the PTEN gene was overexpressed, BCPAP and FTC133 thyroid cancer cells showed microscopic apoptotic changes such as deformation, volume reduction and nuclear pyknosis. The cell viability was decreased （P < 0.01）, and the cell apoptosis rate was increased （P < 0.01）. The expression levels of the apoptotic proteins caspase 8, 9, 12, 3, and proapoptotic protein Bax were significantly increased （P < 0.01）, and the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 was significantly decreased （P < 0.01）, the expression of ERK and AKT were decreased （P < 0.05）. The reduction degree of ERK relative expression in FTC133 cells was significantly higher than that in BCPAP cells （P < 0.01）, while the reduction degree of AKT relative expression in BCPAP and FTC133 cells was not statistically significant （P > 0.05）. After PTEN gene silencing, compared with the control group, the number, cell morphology, volume and nuclear morphology of BCPAP and FTC133 were not significantly different （P > 0.05）. The change of cell viability and apoptosis rate were not significantly different （P > 0.05）. The expression levels of apoptotic proteins caspase 8, 9, 12, 3, and proapoptotic protein Bax was significantly decreased （P < 0.01）, and the expression level of anti-apoptotic protein Bcl-2 were significantly increased （P < 0.01）. The expression levels of ERK and AKT in FTC133 cells were higher than those in the control group （P < 0.01）, and the expression levels of ERK in BCPAP cells were higher than those in the control group （P < 0.01）. Compared with the control group, there was no statistically significant difference in the expression level of AKT （P > 0.05）. The relative expression level of ERK increased in BCPAP and FTC133, but there was no statistically significant difference （P > 0.05）. The relative expression level of AKT increased in FTC133 cells than that in BCPAP cells （P < 0.05）. Conclusion PTEN gene promotes the apoptosis of BCPAP and FTC133 cells. Mitochondrial pathway, death receptor pathway and endoplasmic reticulum activation pathway are all involved in the process of BCPAP and FTC133 cell apoptosis. ERK plays an important role in PTEN gene regulation of BCPAP cell apoptosis, while AKT and ERK both are involved in the process of PTEN gene promoting FTC133 apoptosis. -
Key words:
- PTEN /
- Thyroid cancer /
- Apoptosis /
- ERK /
- AKT
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甲状腺癌（thyroid cancer，TC）发病率占全部恶性肿瘤的3.4%，居内分泌系统恶性肿瘤首位，TC目前发病率为30a前的2～3倍且女性发病率显著高于男性[1-4]。TC的发生和发展涉及多基因、多步骤及多途径的复杂过程，基于分子层面的研究探讨TC的发病机制将更加有助于患者的个体化精准治疗。张力蛋白同源第10号染色体缺失的磷酸酶基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）主要通过调控细胞周期、细胞迁移、细胞凋亡等环节发挥抑癌作用，多项研究表明，突变等因素导致的PTEN基因表达减低或缺失可影响细胞的生长、分化和凋亡，在肿瘤细胞浸润、转移和血管生成以及淋巴组织破坏等方面发挥重要作用，与肝癌、乳腺癌及结直肠癌等疾病发生发展过程显著相关[5-9]。PTEN基因参与多个信号转导通路并发挥生物学功能，包括磷脂酰肌醇-3羟基激酶/丝苏氨酸激酶（phoshoinositide- 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）、丝裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK/ERK）、粘着斑激酶（FAK）等，其中PI3K/AKT 和MAPK/ERK是目前研究最多且与抑癌作用关系较为紧密的通路[10-11]。细胞凋亡（Apoptosis）是由基因控制的细胞自主有序的死亡，可直接影响肿瘤细胞的生存。细胞凋亡具有主动性、程序性和信号依赖等特点，同时又经历信号转导、分子调控以及蛋白水解活化等一系列复杂过程。目前，TC相关的PTEN基因研究主要集中于肿瘤组织内表达的变化，其通过信号转导通路的作用机制以及对TC细胞凋亡的影响尚待进一步探讨。本研究通过改变PTEN基因的表达，观察PTEN基因过表达和干扰状态下甲状腺癌BCPAP细胞和FTC133细胞凋亡的变化，与此同时检测甲状腺癌BCPAP和FTC133细胞信号蛋白ERK和AKT的表达，旨在探讨PTEN基因表达对甲状腺癌细胞凋亡的影响以及可能的信号通路作用机制。
1. 材料与方法
1.1 研究材料
甲状腺癌BCPAP细胞和FTC133细胞购自中国科学院典藏委员会昆明细胞库；脂质体Lipofectamine 2000和Lipofectamine RNAiMAX培养基购自美国Invitrogen公司；PTEN-pCMV6载体和si-PTEN干扰RNA购于美国Origene公司。PTEN抗体GTX101025和Caspase抗体8CSP03、96-1-23、3CSP01、D-20分别购于美国GeneTex和Abcam公司；Bax抗体2D2和Bcl-2抗体C-2购于美国Santa Cruz公司；ERK抗体和AKT抗体购于美国CST公司；MTT试剂盒、碘化丙啶购自美国BD公司。
1.2 研究方法
1.2.1 细胞分组
甲状腺癌BCPAP细胞和FTC133细胞分别分为过表达组、干扰组和空白对照组。
1.2.2 细胞培养
甲状腺癌BCPAP细胞和FTC133细胞选用RPMI-1640培养基，其内含有10%的胎牛血清、青霉素G100IU/mL、链霉素100 µg/mL。37 ℃、5% CO2、湿度95%培养，2 d换液。铺满瓶壁底70%～80%时胰蛋白酶消化传代。取对数生长期细胞待用。
1.2.3 细胞瞬时转染
分别取甲状腺癌BCPAP和FTC133对数生长期细胞，转染前24 h更换新培养基接种，转染时细胞融合度30%～50%。250 μL Opti-MEM分别稀释8 μg PTEN-pCMV6载体质粒和10 μL Lipofectamine 2000，放置5 min后混匀。室温25 min后加入转染液并混匀DNA-Lipofectamine 2000复合物，37 ℃二氧化碳培养箱中常规培养6 h后换上新鲜培养基，继续常规培养。转染48 h后MTT检测OD值及细胞存活率，Annexin V-FITC和PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡率，Western Blot检测PTEN、Bax/Bcl-2和Caspase 8、9、12、3以及ERK/AKT表达量。以空质粒作对照。
1.2.4 细胞干扰
20 μM si-PTEN RNA 0.7 μL及Lipofectamine RNAiMAX 1 μL以Opti-MEM50 μL稀释，室温放置18 min后加opti-MEM200 μL，6 h后换完全培养液。干扰48 h后MTT检测OD值及细胞存活率，Annexin V-FITC和PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡率，Western Blot检测PTEN、Bax/Bcl-2和Caspase 8、9、12、3以及ERK/AKT表达量。以Control siRNA作对照。
1.2.5 MTT比色法检测细胞的存活率
细胞转染或干扰48 h后，加入20 µL 5 mg/mL的MTT溶液，继续培养4 h后终止。每孔加入150 μL DMSO，快速震荡1 min，酶标仪检测490 nm波长处各孔的OD值，计算细胞存活率（%） = （实验组OD值/Control组OD值）×100%。
1.2.6 Annexin V-FITC和PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡率
转染或干扰48 h后，离心后加入磷酸盐缓冲液（PBS）重悬洗涤细胞，重悬于200 μL Binding Buffer，依次加入Annexin V-FITC l0 μL和PI 5 μL，避光室温孵育15 min，加入Binding Buffer 30 μL，0.5 h内上机检测细胞凋亡率。
1.2.7 Western blot检测
PBS冲洗并裂解所收集稳定转染和干扰的甲状腺癌BCPAP细胞和FTC133细胞，离心提取蛋白质，测定总蛋白浓度。SDS-PAGE分离蛋白质，湿法转膜，封闭2 h，一抗（PTEN、Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9、Caspase 12、BAX、Bcl-2、Erk、Akt、β-tubulin；稀释比例均为1∶1000）孵育过夜，二抗孵育4 h，滴加适量ECL化学发光底物，显影。采用Quantity One软件测定条带灰度值。
1.3 统计学处理
SPSS17.0统计软件分析，计量资料服从正态分布，以（均数±标准差）表示，组间数据比较，采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 PTEN基因表达变化对甲状腺癌BCPAP和FTC133细胞凋亡的影响
2.1.1 BCPAP和FTC133细胞光镜下的形态变化
与对照组相比较，BCPAP和FTC133细胞在PTEN基因过表达后，均出现细胞变形，体积缩小，核固缩的改变；PTEN基因干扰表达减少后，BCPAP和FTC133在光镜下细胞数目、形态、体积及细胞核形等无显著变化，见图1，图2。
图 1 PTEN基因表达变化BCPAP细胞凋亡的光镜下表现（× 200）A：空白对照组；B：过表达组；C：干扰组。Figure 1. The apoptosis of BCPAP with different PTEN expression levels （× 200）
图 2 PTEN基因表达变化FTC133细胞凋亡的光镜下表现（× 200）A：空白对照组；B：过表达组；C：干扰组。Figure 2. The apoptosis of FTC133 with different PTEN expression levels （× 200）2.1.2 MTT测定BCPAP和FTC133细胞OD值和细胞活力
与空白对照组相比较，PTEN基因过表达时BCPAP和FTC133细胞测定OD值均减低（P < 0.01），计算BCPAP和FTC133细胞活力显著减低（P < 0.01）；PTEN基因干扰时BCPAP和FTC133细胞OD值均增高（P < 0.05），但计算细胞活力与空白对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），见表1。
表 1 PTEN基因表达变化MTT检测BCPAP和FTC133细胞OD值及细胞活力($\bar x \pm s$ ）Table 1. The OD and cell viability of BCPAP and FTC133 detected by MTT with different PTEN expression levels （$\bar x \pm s$ ）组别 BCPAP FTC133 OD 细胞活力（%） OD 细胞活力（%） 空白对照组 1.506 ± 0.165 100.00 ± 10.97 0.813 ± 0.123 100.00 ± 15.20 PTEN过表达组 0.345 ± 0.117* 22.92 ± 7.76* 0.040 ± 0.008* 4.91 ± 0.95* P < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 PTEN干扰组 1.804 ± 0.086* 109.75 ± 8.17 0.943 ± 0.050* 112.66 ± 7.49 P < 0.001 0.082 0.032 0.051 与对照组比较，*P < 0.05。 2.1.3 Annexin V-FITC和PI双染色流式细胞仪检测BCPAP和FTC133细胞凋亡率
BCPAP和FTC133细胞对照组凋亡率分别为（31.00±2.90）%和（17.02±2.94）%。PTEN过表达时BCPAP和FTC133细胞凋亡率分别为（60.27±5.64）%和（34.26±5.41）%，与对照组相比较凋亡率均增加（P分别为 < 0.001和0.001）。PTEN干扰时，BCPAP和FTC133细胞凋亡率分别为（28.33±2.56）%和（15.04±2.34）%，与对照组相比较凋亡率，差异无统计学意义（P = 0.439和P = 0.547），见图3。
图 3 PTEN基因表达变化流式细胞仪检测BCPAP和FTC133细胞凋亡率A：BCPAP细胞凋亡情况；B：BCPAP细胞凋亡率；C:FTC133细胞凋亡情况；D：FTC133细胞凋亡率。 与对照组比较，**P < 0.01。Figure 3. The apoptosis rate of BCPAP and FTC133 by cytometer with different PTEN expression levels2.2 BCPAP和FTC133细胞PTEN、Bax、Bcl-2、Caspase 8、Caspase 9、Caspase 12和Caspase 3表达水平以及细胞信号通路蛋白ERK和AKT表达的检测
PTEN过表达时，BCPAP和FTC133细胞PTEN蛋白、促凋亡蛋白Bax以及凋亡蛋白Caspase 8、9、12和3表达量增高（P < 0.05），而抗凋亡蛋白Bcl-2表达量减低（P < 0.01）。
PTEN基因干扰表达减低时，BCPAP和FTC133细胞PTEN蛋白、促凋亡蛋白Bax以及凋亡蛋白Caspase 8、9和12表达量减低（P < 0.05），而抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平增高（P < 0.05）。BCPAP细胞Caspase 3表达量与对照组比较，差异无统计学意义（P = 0.486），而FTC133细胞Caspase 3表达量较对照组减低（ P = 0.002），见图4。
图 4 PTEN基因表达变化Western blot检测BCPAP和FTC133细胞相关蛋白表达A：BCPAP细胞各相关因子Western印迹蛋白表达；B：BCPAP细胞各相关因子相对表达水平；C：FTC133细胞各相关因子Western印迹蛋白表达；D：FTC133细胞各相关因子相对表达水平。 与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。Figure 4. The protein’s expression of BCPAP and FTC133 by Western blot with different PTEN expression levelsPTEN基因过表达时，Western Blot检测BCPAP和FTC133细胞ERK和AKT表达量均较对照组减低（P < 0.05）；PTEN基因干扰表达减低时，FTC133细胞ERK和AKT表达量分别较空白对照组均为增高（P < 0.01），BCPAP细胞ERK表达量较对照组增高（P < 0.001）而AKT表达量与对照组比较，差异无统计学意义（P = 0.210）。
PTEN基因过表达时，与对照组相比较，ERK的相对表达量在FTC133细胞的减低程度显著高于BCPAP细胞（P = 0.004）；AKT的相对表达量减低程度在BCPAP和FTC133，差异无统计学意义（P = 0.136）。
PTEN基因干扰表达减低时，与对照组相比较，ERK的相对表达量增高程度在BCPAP和FTC133，差异无统计学意义（P = 0.297）；AKT的相对表达量在FTC133细胞的增高程度显著高于BCPAP细胞（P = 0.012），见图4、表2。
表 2 PTEN基因表达变化Western blot检测BCPAP和FTC133细胞ERK和AKT表达（$\bar x \pm s $ ）Table 2. The expression of ERK and AKT of BCPAP and FTC133 by Western blot with different PTEN expression levels （$\bar x \pm s $ ）分组 BCPAP FTC133 ERK AKT ERK AKT 对照组 115.90 ± 4.41 140.04 ± 8.45 148.38 ± 5.39 126.76 ± 4.24 PTEN过表达组 95.02 ± 7.19* 112.45 ± 5.44* 101.43 ± 8.00* 82.76 ± 5.17* P 0.009 0.002 < 0.001 < 0.001 PTEN干扰组 156.47 ± 7.87* 147.49 ± 5.05 179.55 ± 6.59* 150.91 ± 6.63* P < 0.001 0.210 0.001 0.002 与对照组比较，*P < 0.05。 3. 讨论
分化型甲状腺癌（differentiated thyroid cancer，DTC）约占TC的90%，包括甲状腺乳头状癌（papillary thyroid cancer，PTC）和滤泡状癌（follicular thyroid cancer，FTC），其中以PTC最为常见[12]。甲状腺未分化癌（anaplastic thyroid cancer，ATC）较少见。甲状腺癌BCPAP细胞和FTC133细胞分别来源于PTC和FTC，具有相应的肿瘤细胞学特性。
抑癌基因PTEN与第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源，其表达产物的脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶活性具有抑制细胞周期运行、参与调控细胞凋亡、黏附、迁移和分化等生物学作用[13-14]，亦可通过局灶黏附激酶（FAK）和Shc的去磷酸化抑制细胞的黏附与侵袭，抑制血小板源性生长因子（PDGF）和通过多种途径改变血管生成素（Ang）、血管内皮生长因子（VEGF）和环氧合酶2（Cox-2）等多种血管生成因子的表达，从而抑制肿瘤血管的生成[15-16]。
本研究发现PTEN-pCMV6转染甲状腺癌BCPAP和FTC133细胞后，PTEN基因过表达，光镜下显示BCPAP和FTC133细胞均出现细胞变形、体积缩小、核固缩等细胞凋亡现象，同时伴有细胞活力下降、凋亡率增加；而si-PTEN RNA干扰后，PTEN基因表达减少，BCPAP和FTC133在细胞数目、形态、体积以及细胞核形态等方面未出现显著的凋亡改变，同时细胞活力以及凋亡率的检测结果与对照组比较也未见显著差异。提示PTEN基因表达的增高可促进TC细胞的凋亡，PTEN基因能正向调控TC细胞的凋亡过程。
天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶Caspase（Cysteine- containing aspartate-specific protease）可启动和维持细胞凋亡，它的激活是细胞凋亡途径的关键。Caspase分为炎症介导因子、凋亡始动子和凋亡效应子[17-18]，其中Caspase 2、Caspase 8和Caspase 9自我活化后启动细胞凋亡途径，Caspase 3、Caspase 6、Caspase 7主要发挥推动凋亡进行和完成的作用，而Caspase 12则是内质网应激通路诱导细胞凋亡的重要组成部分[19-20]。Caspase 3主要通过线粒体途径、死亡受体途径和细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）介导的颗粒酶B途径参与细胞凋亡[19,21]，Caspase 3的活化标志着细胞凋亡的不可逆转。多个交汇点在细胞凋亡的不同通路间发挥重要的调控功能，如Caspase 8、9、3以及Bax/Bcl-2，Bcl-2蛋白家族通过控制线粒体通透性来对细胞凋亡进行调节，Bax作为促凋亡蛋白参与细胞凋亡，Bcl-2可拮抗Bax的促凋亡效应，Bax/Bcl-2失衡将导致线粒体Caspase的释放并引发Caspase级联反应，最终激活Caspase 3导致细胞凋亡[22]。本研究表明PTEN基因在负性调控抗凋亡蛋白Bcl-2表达的同时，可正向调控BCPAP和FTC133细胞的促凋亡蛋白Bax以及凋亡蛋白Caspase 8、9、12、3的表达，从而通过促进PTC和FTC细胞的凋亡而发挥抑癌作用。本研究显示，在PTEN基因干扰表达减低时，Caspase 3在FTC133细胞的表达量较对照组减低而在BCPAP细胞的表达量变化与对照组比较无显著差异，以此推测Caspase 3在FTC细胞凋亡中的促进作用是否与PTC细胞一致、或存在其它影响因素则有待于进一步深入研究。本研究同时提示PTEN基因对甲状腺癌BCPAP和FTC133细胞凋亡的调控过程，内质网应激通路、线粒体途径和死亡受体途径均参与其中，也可能通过调控Bax/Bcl-2的平衡影响细胞凋亡。
多项研究结果表明，PTEN通过细胞凋亡、细胞周期阻滞、细胞迁移的调控与肿瘤的发生、发展、浸润、转移、临床分期密切相关，并且多个信号通路参与其中，其中MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路的激活现象较为常见[23]。PTEN基因可负调控PI3K/AKT信号通路导致细胞发生周期阻滞而抑制细胞增殖[24]，也可通过抑制MAPK（ERK）活性、抑制Ras的活化以及Shc的磷酸化等方式抑制ERK激活的MAPK/ERK信号通路所产生的生物学效应[25]。与此同时，在PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路之间存在相互作用的交汇点，PTEN蛋白可通过激活PI3K/AKT通路中的AKT负调控MAPK/ERK通路中Ras对Raf1的活化，也可在无Ras作用的条件下直接负调控Raf1，进而抑制MAPK/ERK的生物学效应，促进细胞凋亡[26]。
本研究发现，PTEN基因过表达时BCPAP和FTC133细胞ERK和AKT的表达均减低，PTEN基因干扰表达减低时FTC133细胞ERK和AKT的表达均增高，而BCPAP细胞仅出现ERK表达的增高而AKT表达无显著变化；另一方面，PTEN基因过表达时FTC133细胞ERK相对表达量的减低程度显著高于BCPAP细胞，AKT相对表达量减低程度则二者相近，PTEN基因干扰表达减低时FTC133细胞AKT相对表达量的增高程度显著高于BCPAP细胞，ERK相对表达量的增高程度则二者相近。提示信号通路蛋白ERK在PTEN基因调控BCPAP（PTC）细胞凋亡发挥重要作用，MAPK/ERK可能是PTEN基因影响BCPAP（PTC）凋亡的主要信号通路，PTEN基因对FTC133（FTC）的作用可能通过信号通路蛋白AKT和ERK同时负向调控Pl3K/AKT和MAPK/ERK信号通路影响TC细胞的增殖、分化及迁移。该结论与其他学者研究结果一致[27-28]。
本研究结果提示，PTEN基因可对PC的PTC细胞和FTC细胞凋亡进行正向调控，线粒体途径、死亡受体途径和内质网激活通路均参与PTEN基因促进PTC和FTC细胞凋亡的过程，MAPK/ERK可能是PTEN基因调控PTC凋亡的主要信号通路，而Pl3K/AKT和MAPK/ERK信号通路均参与PTEN基因促进FTC凋亡的过程。针对Caspase家族、相关信号通路位点以及Bax/Bcl-2等凋亡因子，将为进一步深入研究TC的诊断和靶向治疗提供分子生物学理论依据。在本研究中由于观察指标相对单一，信号通路上游相关因素以及通路间交互作用机制等影响，PTEN基因在PC细胞信号通路的精准作用位点和机制以及影响TC细胞凋亡相关的其他细胞信号通路作用机制还有待进一步深入研究和完善。
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图 1 PTEN基因表达变化BCPAP细胞凋亡的光镜下表现（× 200）
A：空白对照组；B：过表达组；C：干扰组。
Figure 1. The apoptosis of BCPAP with different PTEN expression levels （× 200）
图 2 PTEN基因表达变化FTC133细胞凋亡的光镜下表现（× 200）
A：空白对照组；B：过表达组；C：干扰组。
Figure 2. The apoptosis of FTC133 with different PTEN expression levels （× 200）
图 3 PTEN基因表达变化流式细胞仪检测BCPAP和FTC133细胞凋亡率
A：BCPAP细胞凋亡情况；B：BCPAP细胞凋亡率；C:FTC133细胞凋亡情况；D：FTC133细胞凋亡率。 与对照组比较，**P < 0.01。
Figure 3. The apoptosis rate of BCPAP and FTC133 by cytometer with different PTEN expression levels
图 4 PTEN基因表达变化Western blot检测BCPAP和FTC133细胞相关蛋白表达
A：BCPAP细胞各相关因子Western印迹蛋白表达；B：BCPAP细胞各相关因子相对表达水平；C：FTC133细胞各相关因子Western印迹蛋白表达；D：FTC133细胞各相关因子相对表达水平。 与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
Figure 4. The protein’s expression of BCPAP and FTC133 by Western blot with different PTEN expression levels
表 1 PTEN基因表达变化MTT检测BCPAP和FTC133细胞OD值及细胞活力(
$\bar x \pm s$ ）Table 1. The OD and cell viability of BCPAP and FTC133 detected by MTT with different PTEN expression levels （
$\bar x \pm s$ ）组别 BCPAP FTC133 OD 细胞活力（%） OD 细胞活力（%） 空白对照组 1.506 ± 0.165 100.00 ± 10.97 0.813 ± 0.123 100.00 ± 15.20 PTEN过表达组 0.345 ± 0.117* 22.92 ± 7.76* 0.040 ± 0.008* 4.91 ± 0.95* P < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 PTEN干扰组 1.804 ± 0.086* 109.75 ± 8.17 0.943 ± 0.050* 112.66 ± 7.49 P < 0.001 0.082 0.032 0.051 与对照组比较，*P < 0.05。 
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表 2 PTEN基因表达变化Western blot检测BCPAP和FTC133细胞ERK和AKT表达（
$\bar x \pm s $ ）Table 2. The expression of ERK and AKT of BCPAP and FTC133 by Western blot with different PTEN expression levels （
$\bar x \pm s $ ）分组 BCPAP FTC133 ERK AKT ERK AKT 对照组 115.90 ± 4.41 140.04 ± 8.45 148.38 ± 5.39 126.76 ± 4.24 PTEN过表达组 95.02 ± 7.19* 112.45 ± 5.44* 101.43 ± 8.00* 82.76 ± 5.17* P 0.009 0.002 < 0.001 < 0.001 PTEN干扰组 156.47 ± 7.87* 147.49 ± 5.05 179.55 ± 6.59* 150.91 ± 6.63* P < 0.001 0.210 0.001 0.002 与对照组比较，*P < 0.05。
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