Analysis of Triterpene Chemical Constituents in Poria cocos 95% Ethanol Extract via UPLC-IT-TOF/MS
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摘要:
目的 采用超高效液相色谱串联离子阱飞行时间质谱(UPLC-IT-TOF/MS)技术定性分析茯苓95%乙醇提取物的三萜类化学成分。 方法 采用UHPLC XB-C18色谱柱,甲酸/水(0.05/100,v/v)-乙腈作为流动相,梯度洗脱,流速为0.20 mL/min;紫外检测波长范围为190~400 nm。使用ESI离子源,三氟乙酸钠校正,电喷雾正负离子同时检测,Shimadzu Composition Formula Predictor软件定性分析茯苓三萜类化合物。 结果 通过多级质谱数据分析,结合氮规则和Scifinder数据库检索,从茯苓醇提取物中鉴定了22个三萜类成分,结构类型包括羊毛甾-8-烯型三萜、羊毛甾-7,9(11)-二烯型三萜和其他羊毛甾三萜类型。 结论 通过LC-MS快速分析了茯苓醇提取物中三萜类成分,为其药效物质基础和质量控制提供了依据。 -
关键词:
- 茯苓 /
- 三萜 /
- UPLC-IT-TOF/MS
Abstract:Objective To evaluate the triterpene chemical constituents in Poria cocos 95% ethanol extract by ultra-performance liquid chromatography ion trap time-of-flight mass spectrometry (UPLC-IT-TOF/MS) method. Methods UPLC was performed with the UHPLC XB-C18 and methanoic acid/water (0.05/100, v/v)-acetonitrile solution (gradient elution) was employed with a flow rate of 0.2 mL·min-1. The detection wavelength range was 190~400 nm. Triterpene chemical compositions in Poria cocos were qualitatively analyzed using ESI ion with electrospray positive and negative ions simultaneous detection, sodium trifluoroacetace correction and Shimadzu Composition Formula Predictor software. Results Through the analysis of the multistage tandem mass spectrometry, combined with the application of nitrogen rule and the Scifinder database search, 22 triterpenes with lanostan-8-en, lanostan-7, 9(11)-diene type and other lanostane triterpene were identified. Conclusion This study quickly analyzed the triterpenes in the Poria cocos ethanol extract via LC-MS, which provided the basis for the pharmacodyamic material basis and quality control. -
Key words:
- Poria cocos /
- Triterpene /
- UPLC-IT-TOF/MS
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随着影像学学科的飞速发展,通过对影像技术的灵活运用可以对骨骼表面软骨进行更好的观察和测量,其中超声与MRI可对软骨进行测量[1-2]。二者无辐射,安全无害,但大量影像循证医学研究表明MRI在真实软骨测量准确性方面好于超声,是间接观察软骨的最佳选择[3]。随着MRI检查手段和系统的不断升级,可以很好的利用其对关节软骨损伤和病变检测,1.5T磁共振T1WI TSE成像技术可以测量出真实的软骨厚度[4]。对于踝关节损伤患者,除了考虑骨折和韧带损伤,软骨的损伤也逐渐得到骨科医生的关注,许多研究表明软骨厚度通常小于2 mm,然而软骨厚度也会因地方、性别、和个体的不同而表现出很大的差异[5]。因此对距骨软骨厚度测量将帮助骨科医生预测需要修复的软骨量,并以合理的成本进行治疗,而不会过度侵犯患者,在距骨解剖假体的设计过程中也要考虑软骨存在[6-8]。Giannicola等[9]研究发现软骨厚度分布与骨骼长短、粗细均不相关,即我们不能简单从骨骼CT和X光片显像中预测出软骨厚度。当前国内尚未有对距骨关节面软骨厚度测量的相关文献报道,因此应用MRI测量成人正常距骨表面软骨厚度,构建国内成人正常距骨表面软骨厚度参数势在必行。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2021年01月至2021年11月在云南省中医医院MRI室行检查的踝关节无关节炎、无外伤史的成人100例,其中男性、女性各50例,年龄18~60岁,中位年龄37岁,签署知情同意告知书,对踝关节进行扫描,如实记录体重、身高与年龄。已通过医院伦理委员会审批。
1.2 仪器与方法
使用荷兰飞利浦1.5T磁共振仪。扫描线圈:SENSE-FLEX-M-COIL,C1-COIL,C3-COIL,T/R HEAD COIL KNEE/FOOT COIL。扫描序列:冠状位T1WI TSE ,矢状位T2WI TSE,矩阵512×512,FOV 16 cm,层厚为3 mm,层距为1 mm。扫描体位:取仰卧位,足部先进,沙袋固定足部于中立位。
1.3 测量方法
选择在冠状位通过距骨关节面中垂线的矢状位图像作为测量图像,以胫距关节面前、中、后3个点作为测量点,各测量点垂直于相应的关节面,测量软骨厚度为关节软骨低信号的垂直高度,得出软骨厚度a、b、c(图1)。所有图片均放大3倍,由3名骨科医师独立分别完成3个测量点测量,每个点取3者所得平均值作为最终结果,测量精度为0.01 mm。
软骨测量点的选择:选择在冠状位通过距骨关节面中垂线的矢状位图像作为测量图像,以胫距关节面前、中、后3个点作为测量点,各测量点垂直于相应的关节面,测量软骨厚度为关节软骨低信号的垂直高度,得出软骨厚度a、b、c。
1.4 统计学处理
采用SPSS25.0统计学软件包进行统计学分析,基本描述正态分布计量资料采用均数据±标准差表示,正态分布计量资料两组间比较采用两独立样本t检验,相关性分析采用Pearson相关性分析,P < 0.05表示差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 性别与前、中、后距骨关节面软骨厚度的关系
男性前、中、后距骨关节面软骨厚度分别为(1.00±0.18)mm、(1.40±0.21)mm、(0.87±0.18)mm;女性前、中、后距骨关节面软骨厚度分别为(0.96±0.19)mm、(1.29±0.20)mm、(0.86±0.15)mm;男性和女性距骨前、后关节软骨面厚度差异无统计学意义(P > 0.05),距骨中关节面软骨厚度,差异有统计学意义(P < 0.05),见表1。
表 1 男、女性各指标比较Table 1. Comparison of male and female indicators指标 男性 女性 t P a(mm) 1.00 ± 0.18 0.96 ± 0.19 1.342 0.183 b(mm) 1.40 ± 0.21 1.29 ± 0.20 2.715 0.008* c(mm) 0.87 ± 0.18 0.86 ± 0.15 0.089 0.930 年龄(岁) 37.00 ± 11.96 41.42 ± 14.10 −1.680 0.096 身高(m) 1.70 ± 0.06 1.64 ± 0.06 5.194 < 0.001* 体重(Kg) 67.61 ± 6.29 58.04 ± 4.47 8.707 < 0.001* a:前关节面软骨厚度;b:中关节面软骨厚度;c:后关节面软骨厚度。*P < 0.05。 2.2 身高、体重、年龄与距骨前、中、后关节面软骨厚度的关系
男性与女性年龄差异无统计学意义(P > 0.05),男性身高、体重均大于女性,差异有统计学意义(P < 0.05),考虑为男女差异。经Pearson相关性分析男、女性身高、体重、年龄与距骨前、中、后关节面软骨厚度均无相关性(P > 0.05),见表2、表3、表4。
表 2 身高与各指标相关性分析Table 2. Correlation analysis between height and various indexes指标 r P a(mm) 0.11 0.297 b(mm) 0.05 0.600 c(mm) −0.03 0.764 a:前关节面软骨厚度;b:中关节面软骨厚度;c:后关节面软骨厚度。 表 3 体重与各指标相关性分析Table 3. Correlation analysis between body weight and various indexes指标 r P a(mm) 0.08 0.429 b(mm) 0.17 0.099 c(mm) 0.06 0.588 a:前关节面软骨厚度;b:中关节面软骨厚度;c:后关节面软骨厚度。 表 4 年龄与各指标相关性分析Table 4. Correlation analysis between age and various indicators指标 r P a(mm) −0.14 0.182 b(mm) −0.09 0.389 c(mm) −0.15 0.131 a:前关节面软骨厚度;b:中关节面软骨厚度;c:后关节面软骨厚度。 3. 讨论
在磁共振成像中使用各同向性体素进行厚度测量,来自各同向性体素的MRI数据结果表明,在关节间隙宽度和软骨厚度的测量值的位置准确测量软骨厚度是体素大小的2倍或更大是科学合理的,因此本研究所有测量图像均放大3倍;通过与3个模型、5个正常尸体髋部标本和9个骨关节炎患者的实验结果进行比较,验证了该模拟方法的有效性。MRI提供了软骨和软骨下骨厚度的良好表征,支持其在骨软骨结构和改变的研究和临床诊断中的应用[10-11],也正是如此为本研究MRI测量软骨厚度提供了研究基础。
虽然超声与MRI可对软骨进行测量,二者无辐射,安全无害,超声可以作为评估股骨中、后股骨区域相对软骨厚度的可行临床工具。然而,在软骨厚度 < 2 mm时,超声在相关测量值之间的绝对一致性较差,由于更多的基于MRI测量,超声测量的绝对有效性受到同行质疑[12]。而CT需要通过造影技术对软骨进行测量,有创且辐射大,不适于对人体进行研究,但动物研究可考虑CT造影技术;目前来说,相对于超声、CT测量软骨厚度,MRI测量更为准确、安全、敏感,因此本研究选择了MRI测量。
近年来关节软骨损伤越来越受到骨科医生所关注,距骨软骨面损伤是踝关节最常见的软骨损伤[13],主要表现为踝部肿痛、关节异物感、活动受限,多见于青壮年男性。X线片是踝关节扭伤后需拍摄的常规影像学检查,以前是距骨软骨面损伤的主要诊断依据,但X线片会忽略50%以上的软骨病变。MRI敏感度高,可清晰显示距骨软骨病变、骨髓水肿范围,是软骨损伤最佳无创检查[14];关节软骨损伤的患者日益受到重视,准确的诊断软骨损伤显得更为重要,而X线片误诊率较高,并不利于疾病的诊疗,因此目前MRI检查更有意义。当然,本研究只是起了一个抛砖引玉的作用,而且由于各方面的原因存在一定的局限性,本研究纳入的样本量有限,研究的还不够深入,由于选择健康志愿者进行检查成本高,实施难度大,本研究对象根据病情需要选择踝关节无关节炎、无外伤史的门诊就诊成人,节约成本,也能代表正常距骨软骨厚度,下一步将对运动前后、踝关节损伤后距骨软骨厚度的变化进行探索,希望更多的学者加入进一步更加全面的研究。
通过MRI对距骨表面软骨厚度测量研究发现,成人后距骨表面软骨厚度趋于稳定,与身高、体重、年龄均无相关性,负重区距骨软骨厚度明显大于非负重区,且负重区软骨厚度男性大于女性。展望未来,对于这一现象相信随着影像学学科的不断前进,笔者能更好的对不同区域的软骨进行更深入的研究。
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表 1 茯苓中色谱峰的LC/ESI–MSn鉴定结果(1)
Table 1. Characterization of the peaks in LC/ESI–MSn chromatogram of Poria cocos (1)
色谱峰 保留时间 分子式 分子量 ESI+ (误差,mDa) ESI− (误差,mDa) 化合物名称 1 17.51 C30H48O5 488 [M+Na]+ 511.3328 (−6.6)
MSn: 511-493.3316 (C30H46O4, +2.8),
453.3319 (C30H44O3, −4.4)[M−H]−487.3402 (−2.7) Daedaleanic acid B[10] 2 19.15 C30H46O6 502 [M+Na]+ 525.3301 (+11.4) [M−H]−501.3164 (−5.8) Pinicolic acid F [9] 3 19.90 C31H48O5 500 MSn: 483.3468 (C31H46O4, −0.1), 465.3319 (C31H44O3, −4.4) [M−H]−499.3427 (−0.2) 29α-羟基去氢土莫酸
29α-Hydroxydehy-dropachymic acid[14]4 19.90 C30H48O6 504 [M+Na]+ 527.3331 (−1.2)
MSn: 527- 495.3077 (C29H44O5, +6.3), 437.2886 (C27H42O3, −14.0)[M−H]−503.3373 (−0.5) - 5 21.69 C31H48O6 516 [M+Na]+539.3047 (+6.8)
MSn: 539- 521.2809 (C31H46O5, −6.5), 507.2633 (C30H44O5, −4.6)[M−H]−515.3056 (+4.2) 5,8α-Dioxy-3β,16α-dihydroxylanosta-7,
24- dien-21-oic acid [18]6 21.97 C31H46O6 514 [M+H]+515.3331 (−3.6)
MSn: 515- 497.3360 (C31H44O5, +9.8), 443.2839
(C31H38O2, −10.6), 433.3267 (C30H40O2, +16.6), 425.2996
(C28H40O3, −5.4), 415.2933 (C30H38O, −6.2), 385.2397
(C24H32O4, +2.4), 377.2199 (C25H28O3, +8.8), 335.2455
(C24H30O, +8.6), 253.1655 (C18H20O, +6.8), 247.1670
(C16H22O2, −2.3), 229.1583 (C16H20O, −0.4), 201.1704 (C15H20, +6.6)[M−H]−513.3151 (−7.1)
MSn: 513- 483.3167 (C31H46O4, −5.6)5α,8α-过氧化去氢土莫酸
5α,8α-Peroxydehydrotumulosic acid[19]7 22.54 C31H46O5 498 [M+H]+ 499.3287 (−13.1)
MSn: 481.3308 ( (C31H44O4, −0.4), 463.3147 (C31H42O3, −6.0)[M−H]−497.3193 (−7.9)
MSn: 497- 403.2418 (C24H26O5, −7.2), 389.2435 (C27H34O2, −5.1),
371.2336(C27H32O, −4.4), 355.2131 (C26H28O, +6.4)6α-羟基猪苓酸C
6α-Hydroxypolyporenic acid C[11]8 23.69 C33H48O8 572 [M+H]+573.3312 (−11.1) [M−H]−571.3213 (−6.3) 3-(2-羟基乙酰氧基)- 5α,8α-过氧化去氢土莫酸
3-(2-hydroxyacetoxy)- 5α,
8α-peroxydehydrotumulosic acid [20]9 25.78 C31H46O5 498 [M+H]+ 499.3433 (+1.5)
MSn: 481.3408 ( (C31H44O4, +9.6)- 451.3147 (C30H42O3, −1.4),
435.2955 (C29H38O3, +6.2), 325.2132 (C22H28O2, −3.0),
299.2112 (C20H26O2, +10.6)[M−H]−497.3236 (−3.6) - 表 1 茯苓中色谱峰的LC/ESI–MSn鉴定结果(2)
Table 1. Characterization of the peaks in LC/ESI–MSn chromatogram of Poria cocos (2)
色谱峰 保留时间 分子式 分子量 ESI+ (误差,mDa) ESI- (误差,mDa) 化合物名称 10 28.42 C32H50O6 530 [M+Na]+553.3443 (−5.7)
MSn: 553- 535.3422 (C32H48O5, +2.8), 495.3437
(C30H48O4, −0.8), 477.3274 (C30H46O3, −6.5), 435.3364
(C28H44O2,+13.0), 353.2548 (C22H34O2, +9.7)[M−H]−529.3461 (−7.4) 3-乙酰氧基-16α,26-二羟基-羊毛甾-8,24-二烯-21-酸
3- Acetoxy-16α,26-dihydroxy-lanosta-8,24-dien-21-oic acid[10]11 29.01 C33H50O6 542 MSn: 525.3513 (C33H48O5, −6.2)- 507.3459
(C33H46O4, −1.0), 465.3365 (C31H44O3, +0.2),
447.3544 (C32H46O, −7.7)[M−H]−541.3460 (−7.5) 6α-羟基去氢茯苓酸
6α-Hydroxy-dehydropachymic acid[13]12 31.15 C31H48O4 484 [M+Na]+485.3592 (−3.3)
MSn: 485- 467.3492 (C31H46O3, −2.9), 449.3408 (C31H44O2, −0.6),
311.2388 (C22H30O, +1.9), 293.2259 (C22H28, −0.5)[M−H]−483.3413 (−6.7)
MSn: 483- 437.3393 (C30H46O2, −3.2), 421.2978 (C29H42O2, −13.4)3β,15α-二羟基-羊毛甾-7,9(11),24-三烯-21-酸
3β,15α-dihydroxylanosta-7,9(11),24-trien-21-oic acid[15]13 30.27 C31H50O4 486 [M+H]+ 487.3722 (−6.0)
MSn: 487- 469.3719 (C31H48O3, +4.3),
451.3553 (C31H46O2, −1.8), 343.2701
(C23H34O2, +6.9), 313.2464 (C22H32O, −6.2),
295.2405 (C22H30, −1.5)[M−H]−485.3570 (−6.6)
MSn: 483- 423.3371 (C29H44O2,+10.2)土莫酸
Tumulosic acid[10-11]14 31.74 C31H46O5 498 [M+H]+ 499.3368 (−5.0)
MSn: 499- 481.3292 (C31H44O4, −2.0), 463.3291 (C31H42O3, +8.4),
421.3024 (C29H40O2, −7.7), 325.2198 (C22H28O2, +3.8), 307.2102 (C22H26O, +4.6)[M−H]−497.3199 (−7.3)
MSn: 497- 425.2942 (C31H38O, +9.2)29-羟基猪苓酸 C
29-Hydroxypolyporenic acid C[16]15 33.26 C33H52O6 544 [M+H]+ 545.3733 (−10.4)
MSn: 545- 527.3696 (C33H50O5, −3.5), 451.3097 (C31H46O2, +2.6), 433.3267 (C31H44O, −19.8), 295.2433 (C22H30,+2.3)[M−H]−543.3623 (−6.8)
MSn: 543- 467.3227 (C31H48O3, +9.6)25-羟基茯苓酸
25-Hydroxypachimic acid[11]16 33.57 C31H46O4 482 [M+H]+ 483.3420 (−4.9)
MSn: 483- 465.3327 (C31H44O3, −3.6), 447.3246 (C31H42O2, −1.2), 309.2214 (C22H28O, +0.1)[M−H]−481.3266 (−5.7)
MSn: 481- 311.1817 (C21H28O2, −14.0)猪苓酸 C
Polyporenic acid C[11]17 34.28 C31H48O4 484 [M+H]+ 485.33637 (+1.2)
MSn: 483- 467.3486 (C31H46O3, −3.4), 449.3532 (C31H44O2, +11.8), 311.2343 (C22H30O, −2.6), 293.2330 (C22H28,+6.6)[M−H]−483.3378 (−10.2)
MSn:3-表去氢土莫酸
3-epi-Dehydrotumulosic acid acid[11]表 1 茯苓中色谱峰的LC/ESI–MSn鉴定结果(3)
Table 1. Characterization of the peaks in LC/ESI–MSn chromatogram of Poria cocos (3)
色谱峰 保留时间 分子式 分子量 ESI+ (误差,mDa) ESI− (误差,mDa) 化合物名称 18 34.89 C31H48O4 484 [M+H]+ 485.3589 (−3.6)
MSn: 483- 467.3526 (C31H46O3, +0.6), 449.3377 (C31H44O2, −3.7), 311.2408 (C22H30O, +3.9), 293.2265 (C22H28, 0.1)[M−H]−483.3406 (−7.4)
MSn: 481- 337.2465 (C24H34O, −7.2)去氢土莫酸
Dehydrotumulosic acid[17]19 38.63 C33H50O5 526 [M+H]+ 527.3671(−6.0)
MSn: 527- 509.3564 (C33H48O4, −6.1), 449.3398 (C31H44O2, −1.6), 293.2240 (C22H28, −2.4)[M−H]−525.3493 (−9.2)
MSn:3-表去氢茯苓酸
3-epi-Dehydropachymic acid[14]20 39.64 C32H50O5 514 [M+H]+ 515.3708(−2.3)
MSn: 515- 497.3555 (C32H46O4, −7.0), 437.3398 (C30H44O2, −1.6), 295.2422 (C22H30,+0.2)[M−H]−513.3532 (−5.3) 3-O-乙酰基-16α-羟基松苓酸
3-O-Acetyl-16α-hydroxytrametenolic acid[12]21 40.64 C33H50O5 526 [M+H]+ 527.3697 (−3.4)
MSn: 527- 509.3594 (C33H48O4, −3.1), 449.3446 (C31H44O2, +3.2), 353.2501 (C24H32O2, +2.6),
293.2254 (C22H28, −1.0)[M−H]−525.3511 (−7.4)
MSn: 525- 479.3471 (C32H48O3, −6.0), 465.3351 (C31H46O3, −2.3), 355.2295 (C23H32O3, +1.6),去氢茯苓酸dehydropachymic acid[11] 22 41.87 C33H52O5 528 [M+H]+ 529.3820 (−6.8)
MSn: 529- 511.3735 (C33H50O4, −4.7), 451.3599 (C31H46O2, −3.0), 295.2419 (C22H30, −0.1)[M−H]−527.3666 (−7.6)
MSn: 527- 465.3330 (C31H46O3, −4.4)茯苓酸
Pachymic acid[10-11]23 45.90 C30H46O3 454 [M+H]+ 455.3532 (+1.2)
MSn: 455- 437.3457 (C30H44O2, +4.3), 311.2370 (C22H30O, +0.1), 295.2381 (C22H30, −3.9)[M−H]−453.3342 (−3.2) 3-羟基-羊毛甾-7,9(11),24-三烯-21酸
Dehydrotrametenolic acid[12]24 47.30 C30H48O3 456 [M+H]+ 457.3663 (−1.3)
MSn: 457- 439.3502 (C30H46O2, −6.9), 313.2445 (C22H32O, −8.1), 295.2463 (C22H30, +4.3)[M−H]−455.3471 (−6.0) 3-氢化松苓酸
trametenolic acid[13] -
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