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PI3K/Akt信号通路在增生性瘢痕中的调控作用

刘巍敏 麻艺群 田卓 湯諹

廖周俊, 杨少华, 刘立鑫, 胡晟, 陈轶晖, 康强, 张小文. AK4对肝内胆管癌细胞HUCCT1增殖、迁移的影响[J]. 昆明医科大学学报, 2022, 43(6): 1-6. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20220611
引用本文: 刘巍敏, 麻艺群, 田卓, 湯諹. PI3K/Akt信号通路在增生性瘢痕中的调控作用[J]. 昆明医科大学学报, 2023, 44(3): 22-27. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20230313
Zhoujun LIAO, Shaohua YANG, Lixin LIU, Sheng HU, Yihui CHEN, Qiang KANG, Xiaowen ZHANG. Effect of AK4 on Proliferation and Migration of Intrahepatic Bile Duct Carcinoma Cell HUCCT1[J]. Journal of Kunming Medical University, 2022, 43(6): 1-6. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20220611
Citation: Weimin LIU, Yiqun MA, Zhuo TIAN, Yang TANG. Regulatory Role of PI3K/Akt Signaling Pathway in Hypertrophic Scar[J]. Journal of Kunming Medical University, 2023, 44(3): 22-27. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20230313

PI3K/Akt信号通路在增生性瘢痕中的调控作用

doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20230313
基金项目: 云南省基础研究计划资助项目(202201AY070001-039);云南省应用基础研究基金资助项目[2017FE468(-049)]
详细信息
    作者简介:

    刘巍敏(1986~),女,陕西宝鸡人,医学硕士,主治医师,主要从事皮肤外科临床工作

    通讯作者:

    湯諹,E-mail:drtangyang@126.com

  • 中图分类号: R751.05

Regulatory Role of PI3K/Akt Signaling Pathway in Hypertrophic Scar

  • 摘要:   目的   探讨PI3K/AKT信号通路在增生性瘢痕中的调控作用。  方法   构建兔耳增生性瘢痕模型,并随机分为4组:正常兔耳皮肤组(A)、瘢痕模型组(B)、DMSO刺激模型组(C)、PI3K特异性抑制剂(LY294002)刺激模型组(D)。通过组织病理学观察兔耳瘢痕的形态学变化;免疫组化和Western blot检测p-Akt[S473]和p-Akt[T308]的表达量;免疫荧光双染色评估p-Akt[S473]和p-Akt[T308]的共定位情况;以及TUNEL评估皮肤组织中成纤维细胞的凋亡水平。  结果   D组中瘢痕厚度及成纤维细胞数明显高于B和C组。免疫组化和Western blot检测结果表明,p-Akt[T308]和p-Akt[S473]在B组中的表达量明显高于A组,但在D组中显著低于C组。免疫荧光表明,p-Akt[T308]和p-Akt[S473]主要定位于瘢痕组织中的细胞浆内,且在D组中的共表达量低于B组。TUNEL检测结果证实,与A组相比,B组皮肤组织中细胞凋亡水平明显下调,且D组中细胞凋亡水平高于C组(P < 0.01)。  结论   阻断PI3K/Akt信号通路可通过抑制Akt磷酸化,导致成纤维细胞凋亡水平上调,进而缓解瘢痕增生进程。
  • 肝内胆管癌是一种具有高度侵袭性的恶性肿瘤[1],预后差,近年来,其发病率逐年升高[2]。腺苷酸激酶4(Adenylate kinase4,AK4)是腺苷酸激酶家族的一员,其分子量为25kDa,别称为AK3L1。多项研究显示AK4促进恶性肿瘤的发生发展[3-5]。但其对肝内胆管癌的作用尚无报道。本实验通过小干扰RNA手段,就AK4对肝内胆管癌细胞HUCCT1增殖、迁移能力的影响作出探究。

    本实验所用肝内胆管癌细胞HUCCT1购自上海誉驰生物科技有限公司,该细胞已通过中国科学院昆明动物研究所鉴定明确。该细胞作为肝内胆管癌细胞株之一,常用于肿瘤增殖、迁移的研究。

    本实验采用siRNA技术以沉默AK4。siRNA购自上海市吉玛基因生物技术有限公司,共计构建6条si-RNA序列,序列设计见表1。本次实验分组为空白对照组(CON)、阴性对照组(siRNA-NC)、阳性对照组(siRNA-GAPDH)、实验组1(siRNA-AK4-1),实验组2(siRNA-AK4-2),实验组3(siRNA-AK4-3)。转染试剂采用上海市吉玛基因生物技术有限公司GP-transfect-Mate。采用免疫印迹法(Western Blot,WB)对实验组1、实验组 实验组3进行si-RNA筛选,其中空白对照组不添加siRNA,阴性对照组基因序列与目的基因序列无同源性,阳性对照组基因序列与内参GAPDH同源。各组间其余实验操作步骤(转染方法、WB、EdU、细胞划痕实验)均一致。

    表  1  si-RNA序列
    Table  1.  Sequence of si-RNA built by siRNA technology
    组别序列Antisense
    Negative control 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′ 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′
    GAPDH Positive control 5′-UGACCUCAACUACAUGGUUTT-3′ 5′-AACCAUGUAGUUGAGGUCATT-3′
    siRNA-AK4-1 5′-GCGGAAGGGUAUAUAACCUTT-3′ 5′-AGGUUAUAUACCCUUCCGCCT-3′
    siRNA-AK4-2 5′-CAGGCUAAGACAGUACAAATT-3′ 5′-UUUGUACUGUCUUAGCCUGTT-3′
    siRNA-AK4-3 5′-CACCUAUUCAGUCCAAAGATT-3′ 5′-UCUUUGGACUGAAUAGGUGTT-3′
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    转染前1 d将HUCCT1细胞接种至6孔板中,以次日细胞融合度达到60%~80%为宜,用无抗生素的完全培养基进行培养。转染:(1)转染试剂室温备用;(2)按照每孔200 µL无血清培养基(1640培养基)加5~8 µL转染试剂配置转染试剂混合物。静置5 min;(3)按照每孔200 µL无血清培养基(1640培养基)加150/pmol siRNA配置siRNA混合物。静置5 min;(4)将转染试剂混合物滴加到siRNA混合物中,混匀,静置20 min;(5)20 min后将混合液均匀加至6孔板各孔中;(6)各孔另外加入1 600 µL无抗生素完全培养基;(7)孔板放入细胞培养箱中培养48 h,使用免疫印迹检测转染效率。

    (1)裂解细胞:使用PMSF(品牌:Beyotime,货号:ST506-2 PMSF)与RIPA裂解液(强)品牌:Beyotime,货号:P0013B)按照200∶1配置细胞裂解液。于冰上充分裂解细胞;(2)测蛋白浓度:取裂解产物于4 ℃离心机12000 r/min,离心30 min。吸取86 µL上清液,使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(品牌:Beyotime,货号:P0012 500次)测定蛋白浓度;(3)取80 µL上清液加20 µL SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(品牌:Beyotime,货号:P0015L)沸水加热15 min;(4)电泳:配置12%下层胶,5%上层胶,蛋白上样量为2.5 µg,上层胶60 V恒压电泳,下层胶100 V恒压电泳;(5)转膜:甲醇浸泡PVDF膜,胶、膜放置妥当后以300 mA恒流条件下湿转发转膜,时间为30 min;(6)封闭:PVDF膜置于5%脱脂牛奶中封闭,缓慢摇晃,室温封闭2 h;(7):孵育一抗:兔单克隆抗体[EPR7678] to AK3L1抗体,(1∶7000,品牌:Abcam,货号:ab131327)。一抗孵育过夜,4 ℃;(8):孵育二抗:山羊抗兔IgG(H+L)(品牌:Proteintech,货号:SA00001-2,1∶10000),室温孵育2 h;(9)显影:ECL化学发光液孵育1 min后,于成像仪中曝光显影。

    (1)转染细胞:6孔板培养细胞。免疫印迹实验已明确siRNA-AK4-3的沉默效果最好,故本次实验使用siRNA-NC及siRNA-AK4-3做细胞转染。分组亦同。转染完成24 h开始进行EdU实验。(2)工作液孵育:使用BeyoclickTM Edu-555配置2XEdU工作液后(品牌:Beyotime,货号:C0075s),与无抗生素完全培养基等体积加入六孔板中,孵育2 h。(3):固定、染色:每孔1 mL固定液固定15 min,洗涤后加入通透液孵育15 min,Click反应液孵育15 min,1X Hoechst 33342溶液孵育10 min。(4):荧光检测:洗涤液清洗后于倒置荧光显微镜观察。

    (1)转染细胞:6孔板培养细胞。本次实验分组为siRNA-NC及siRNA-AK4-3。转染完成24 h开始细胞划痕实验。(2)画线:使用直尺于6孔板背面作横行画线。(3)划痕:待细胞融合度为95%~100%时,使用200 µL枪头沿直尺作垂直于画线的划痕。(4)冲洗:使用PBS冲洗孔板3次,动作轻柔,吸净PBS后,加入无血清1640培养液。(5)拍照:每孔以“十”字交叉处上下为定点,于0 h,12 h,24 h,36 h拍照,对比不同时间下各组细胞迁移能力,并进行统计分析。

    数据分析使用GraphPad Prism 8及SPSS 26统计软件,计量资料采用($\bar x \pm s $),计数资料用t检验,3组及多组计量资料采用单因素方差分析。所有检验取两端。P < 0.05为差异有统计学意义。

    免疫印迹法检测各组后量化结果分别为:空白对照组(CON):(0.9±0.01,)阴性对照组(siRNA-NC):(0.92±0.01),阳性对照组(siRNA-GAPDH):(0.95±0.04),实验组1(siRNA-AK4-1):(0.74±0.08),实验组2(siRNA-AK4-2):(0.45±0.04),实验组3(siRNA-AK4-3):(0.24±0.02)。免疫印迹结果显示各组内参齐,沉默效果较好,其中阳性对照组对GAPDH的沉默效果显著。各siRNA组中siRNA-AK4-3对AK4的沉默效果最好,见图12。因此,后期实验使用siRNA-NC作为对照组,siRNA-AK4-3作为实验组。

    图  1  各组中AK4蛋白的Western Blot条带
    Figure  1.  Western blot bands of AK4 protein in each group
    图  2  各组细胞中AK4蛋白的相对表达量
      siRNA-GAPDH组为阳性对照,取GAPDH/AK4。各组分别与siRNA-NC组比较,除CON组无统计学差异其余各组均有统计学差异。**P < 0.01,***P < 0.005,****P < 0.001。
    Figure  2.  The relative expression level of AK4 protein in each group

    Edu实验结果显示:siRNA-NC组增殖细胞(15.9±4.4)/视野,细胞总数(110.9±22.4)/视野。siRNA-AK4-3组增殖细胞数目(12.8±5.0)/视野,细胞总数(116.7±22.1)/视野。两组增殖比率有差异,差异有统计学意义。siRNA-NC组增殖细胞多于siRNA-AK4-3组,AK4促进细胞增殖,见图34

    图  3  EdU检测siRNA-NC与siRNA-AK4-3细胞的增殖情况(×200)
    Figure  3.  The proliferation of siRNA-NC and siRNA-AK4-3 cells was detected by EdU (×200)
    图  4  siRNA-NC组与siRNA-AK4-3的细胞增殖比率
    *P < 0.05。
    Figure  4.  The proliferation rate of siRNA-NC group and siRNA-AK4-3

    图3中EdU中增殖的HUCCT1细胞被标记为红色荧光,Hoechst 33342中蓝色荧光标记的为视野下所有活细胞,Merge图由EdU和Hoechst 33342图像合并后得到。

    划痕实验取划痕面积/视野总面积,各组面积比见表2,差异有统计学意义,见图56。siRNA-NC组细胞迁移面积较siRNA-AK4-3组更大,AK4促进细胞迁移。

    表  2  划痕面积比
    Table  2.  Scratch area ratio
    项目0 h12 h24 h36 h
    siRNA-NC 0.39 ± 0.01 0.26 ± 0.017 0.12 ± 0.017 0.08 ± 0.026
    siRNA-AK4-3 0.39 ± 0.005 0.33 ± 0.001 0.24 ± 0.024 0.24 ± 0.027
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    图  5  siRNA-NC与siRNA-AK4-3细胞划痕后面积变化,图中红色边缘为Image J软件勾勒
    Figure  5.  The area changes of siRNA-NC and siRNA-AK4-3 cells after scratches,and the red edge in the figure is outlined by Image J software
    图  6  siRNA-NC组与siRNA-AK4-3组细胞划痕后面积占视野总面积比的变化
    *P < 0.05,**P < 0.01。
    Figure  6.  In the siRNA-NC group and siRNA-AK4-3 group,ns represented no difference in the ratio of cell area to total field area after scratches

    肝内胆管癌的手术治疗是极其重要的,目前全球范围内术后其平均无瘤生存时间( DFS) 为12 ~ 36 个月[6-7],但胆管癌起病隐匿,多数患者在发现疾病时已属晚期[8],据报道,肝内胆管癌的根治切除率为30%~40% ,其他肝胆恶性肿瘤均比此数据高[19]。肝内胆管癌的辅助化疗(吉西他滨联合铂类)在一定程度上实现肿瘤将期,从而获得手术机会[10-12],但其中位生存期仍然不到1 a时间[13-15]。根据Andrew X Zhu的RCT临床研究,靶向药物Ivosidenib使得患者有10.3个月的中位生存期,而安慰剂组仅有7.5个月[16],Abou-Alfa GK等学者也通过RCT实验研究了Ivosidenib在胆管癌中的作用,其结果是实验组的无病生存期为2.7个月(95% CI:1.6~4.2),而安慰剂组的无病生存期为1.4个月(95% CI:1.4~1.6)[17]。A Demols也在胆管癌的靶向治疗上进行了RCT研究,他研究了靶向药Regorafenib对胆管癌作用,最终得出实验组无病生存期为3.0个月(95% CI:2.3~4.9),而对照组无病生存期为1.5个月(95% CI:1.2~2.0),然而实验组的总生存时间和对照组的总生存时间并无统计学差异[18]。可以看出,靶向药能提高患者生存时间,但有研究显示部分靶向药并不能显著提升患者的总生存率[18, 19]。因此需寻找一个更有效的作用靶点。

    1944年,美国学者Kalckar在实验中首次发现了肌苷酸[20]。在随后的科学实践中,更名为腺苷酸激酶AK。AK4定位于细胞线粒体基质内,在肝脏、心脏、脑、肾脏、胃肠道组织中富于表达[21],AK4在细胞能量代谢方面表现出特异性[22],因此他与肿瘤应该存在相关性。2012年由台湾地区学者Yi-Hua Jan完成了首例AK4与癌症关系论证的研究:体外试验中shRNA沉默肺癌细胞CL1-5和A549中的AK4后,两株细胞的侵袭能力下降约50%,从而证实AK4促进肺癌细胞的侵袭[3]。连云港市的学者MinMin HUANG在研究中显示AK4在人浆液性卵巢癌组织中高表达。在体内试验中,AK4敲低组的肿瘤体积明显减小,肿瘤重量明显减轻。这些试验均显示AK4促进了人浆液性卵巢癌的发生发展[4]。Jie Zhang等在Her-2阳性乳腺癌中的研究显示AK4的表达水平与肿瘤TNM分期(P = 0∶017)和淋巴结转移(P = 0∶046) 显著相关。体外试验中,MTT法、细胞划痕实验和Transwell试验都显示敲低AK4组的癌细胞增值、迁移、侵袭能力减弱。体外试验也显示敲低了AK4的肿瘤组织体积减小,重量减轻[5]。此后AK4与肿瘤的研究未曾断绝,田华等学者通过免疫组化等方法证实了AK4在肺腺癌中高表达[23]。李辰运的研究显示AK4在胰腺导管腺癌中高表达,并且与肿瘤分期、淋巴结转移、神经受侵、脉管内瘤栓有相关性(P < 0.05)[24]。李绍军等也证实AK4在食管鳞状细胞中高表达[25],夏林等也通过免疫组化的方式证实了AK4在胃癌中高表达[26],尽管我国的多数学者都明确了AK4在大多数肿瘤中的表达,但是很遗憾,仅有少数人通过体内、体外实验论证AK4对相关癌症的影响,无法将他们的研究进一步转化为临床制定治疗方案的依据。

    本实验首次论证AK4对肝内胆管癌细胞HUCCT1增殖、迁移的影响。首先予siRNA沉默AK4的表达,再通过EdU检测细胞增殖能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力。本次实验的结论与前人的研究结论相似,即AK4促进肝内胆管癌细胞HUCCT1的增殖、迁移。本实验的不足在于,笔者尚未完成AK4对肝内胆管癌细胞其他生物学能力的影响,如EMT、侵袭等等。因此,笔者接下来即将完成其他细胞生物学行为实验,并且探究在机制方面的变化以及通过体内实验验证结论。本实验结论将为肝内胆管癌的临床分子靶向治疗提供基础实验数据,采用生物医学工程技术干预肝内胆管癌组织中AK4的表达,将有助于肿瘤的综合治疗。

  • 图  1  各组组织形态学变化

    A:增生瘢痕模型组;B:DMSO处理增生瘢痕组;C:LY294002处理增生瘢痕组。

    Figure  1.  Histomorphology changes in different groups

    图  2  免疫组化染色检测兔耳创面中p-Akt[T308]和p-Akt[S473]的表达量(200×)

    A:正常兔耳皮肤组;B:增生瘢痕模型组;C:DMSO处理增生瘢痕组;D:LY294002处理增生瘢痕组。

    Figure  2.  The expression of p-Akt[T308] and p-Akt[S473] in rabbit ear trauma was determined by immunohistochemical staining (200×)

    图  3  Western blot检测总Akt、p-Akt[T308]、p-Akt[S473]蛋白在兔耳创面中的表达水平

    A:Western blot检测总Akt、p-Akt[T308]、p-Akt[S473]蛋白;B:总Akt、p-Akt[T308]、p-Akt[S473]蛋白统计值; 与A组比较,*P < 0.05;与C组比较,#P < 0.05 。

    Figure  3.  The protein expression of total Akt,p-Akt[T308],p-Akt[S473] in the tissues of rabbit ear trauma was examined by western blot

    图  4  免疫荧光双染分析p-Akt[T308]和p-Akt[S473]在瘢痕组织中表达情况(40×)

    A:增生瘢痕模型组;B:LY294002处理增生瘢痕组;注:p-Akt[T308]为绿色,p-Akt[S473]为红色。

    Figure  4.  The expression of p-Akt[T308] and p-Akt[S473] in the scar tissue was determined by immunofluorescence double staining (40×)

    图  5  TUNEL染色分析兔耳创面组织中成纤维细胞凋亡情况(200×)

    A :正常兔耳皮肤组;B:增生瘢痕模型组;C:DMSO处理增生瘢痕组;D:LY294002处理增生瘢痕组。

    Figure  5.  TUNEL assay was used to evaluate fibroblast apoptosis in the tissues of rabbit ear trauma (200×)

    表  1  各组增生块相对增生厚度测量结果[n = 5,($ \bar x \pm s $)]

    Table  1.   The thickness of scar tissue in different groups [n = 5,($ \bar x \pm s $)]

    组别n厚度(mm)FP
    B组52.23 ± 0.381.1770.37
    C组52.09 ± 0.10
    D组5 1.94 ± 0.08*
      与C组相比,*P < 0.05。
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    表  2  各组凋亡指数的变化(n = 5,$ \bar x \pm s $

    Table  2.   Changes of fibroblast apoptosis index (n = 5,$ \bar x \pm s $

    组别n凋亡率(%)FP
    A组52.38 ± 0.4116.357 < 0.001*
    B组5 2.02 ± 0.16
    C组52.05 ± 0.26
    D组5 3.66 ± 0.42##△△
      *P < 0.05;与A组相比,P < 0.05;与B组相比,##P < 0.01;与C组相比,△△P < 0.01。
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-10-18
  • 网络出版日期:  2023-03-02
  • 刊出日期:  2023-03-25

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